Nedreglering av SPARC uttryck minskar cancer gastric cellulär invasion och survival

nedreglering av SPARC uttryck minskar cancer gastric cellulär invasion och överlevnad Bild Sammanfattning
Bakgrund
utsöndrat protein sura och rika på cystein (SPARC) spelar en nyckelroll i utvecklingen av många vävnader och typer organ. Aberrant SPARC expression återfanns i ett stort antal olika humana cancerformer, bidrar till tumörutveckling. Eftersom SPARC befanns vara överuttryckt i human magcancer vävnad, vi därför att undersöka uttrycket av SPARC i magcancer linjer och cancerframkallande mekanismerna.
Metoder
SPARC uttryck utvärderades i en panel av humana magcancer-cellinjer . MGC803 och HGC 27 magcancer cellinjer som uttrycker hög nivå av SPARC transfekterades med SPARC specifika små störande RNA och därefter utvärderas för effekter på invasion och spridning.
Resultat
små störande RNA-medierad knockdown av SPARC i MGC803 och HGC 27 gastric cancerceller minskat dramatiskt deras invasion. Knockdown av SPARC observerades också att avsevärt öka apoptos av MGC803 och HGC 27 gastric cancerceller jämfört med kontroll transfekterad grupp.
Slutsatser
Våra data visade att nedreglering av SPARC hämmar invasion och tillväxt av humana gastriska cancerceller. Således kan målsökning av SPARC vara en effektiv terapeutisk strategi mot magcancer.
Introduktion
Gastric cancer är den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall i världen och är en av de mest aggressiva tumörer och är ofta förknippade med lymfkörtel metastas, peritoneal spridning, och hematogen metastas [1]. På det hela taget, 65-70% av nya fall och dödsfall från magcancer förekommer i mindre utvecklade länder [2]. År 2005, incidens av magcancer (0,3 miljoner dödsfall och 0,4 miljoner nya fall) trea bland de vanligaste cancerformerna i Kina [3]. Nuvarande terapier för långt framskridna eller magsäckscancer har liten effekt, kirurgiskt avlägsnande med resektion av intilliggande lymfkörtlar erbjuder den enda möjligheten till bot, som är mindre än 33% av patienter med magsäckscancer. 5-års överlevnad är endast 30-40%, med en sämre prognos för avancerade tumörer. Att förstå de molekylära mekanismer som ligger bakom utvecklingen av magcancer kan ge insikter i nya terapeutiska mål
utsöndrade proteinet sura och rika på cystein (SPARC, även känd som osteonektin eller BM-40). Tillhör matricellular familj av utsöndrade proteiner [4 ]. SPARC är en icke-strukturell komponent i extracellulära matriser som modulerar cell-matris-interaktioner, i synnerhet under vävnadsutveckling, remodeling och reparera [5]. Många cancertyper karakteriseras av uppregleras expressionen av SPARC [6]. Överuttryck av SPARC har dokumenterats i flera typer av solida tumörer, såsom bröst- [7], prostata [8], melanom [9] och glioblastom [10]. Däremot har lägre nivåer av SPARC uttryck återfinnas i andra typer av cancer, såsom äggstocks [11], kolorektal [12], pankreas [13, 14] och akut myeloisk leukemi [15]. Dessa observationer tyder på att tumörframkallande SPARC är celltyp specifika och kan vara beroende av tumörcellen omgivande miljön.
Kunskap om SPARC funktioner i mag cancerceller är fortfarande bristfällig. Överuttryck av SPARC-genen observerades i human magcancer i fem andra rapporter [16-20]. Men alla ovannämnda studier hade ingen detalj i gastric cancercellinjer och cancerframkallande mekanism. SPARC har associerats med aggressiva stadier av magcancer och är korrelerad med dålig prognos [16], vilket tyder på att minskningen av SPARC uttryck kan ha terapeutisk fördel. I själva verket uttryck för antisensoligonukleotider mot SPARC i melanomceller blockerades tumörbildning [21]. De exakta biologiska och molekylära mekanismer genom vilka en minskning av SPARC uttryck kan bidra till förbättrad tumörterapi återstår att utredas. Därför är syftet med denna studie var att karakterisera SPARC funktioner i mag cancerceller och utforska dess möjligen cancerframkallande mekanism.
Material och metoder
Cellodlings
mänskliga magsäckscancer cellinjer NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 erhölls från Cancer Institute of Chinese Academy of Medical Science. Alla celler odlades i RMPI 1640 (GIBCO ™) medium supplementerat med 10% fetalt bovinserum, penicillin G (100 enheter /ml) och streptomycin (100 | ig /ml) benämns fullständigt medium. Celler upprätthölls i monolagerkultur vid 37 ° C i fuktad luft med 5% CO 2.
Kemikalier och reagens
EDTA-2 natrium, akridinorange, etidiumbromid (EB) och 3- [4, 5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl tetrazoliumbromide (MTT) köptes från Sigma (St Louis, MO, USA). Mus-monoklonal antikropp som är specifik till p-aktin var från Sigma. Kanin polyklonala antikroppar som är specifika för Bcl-2 (sc-492), var kaspas-3 (sc-7148) och PARP (sc-7150) köptes från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Monoklonala musantikroppar specifika för SPARC (sc-74295) och Bax (sc-7480) erhölls från Santa Cruz Biotechnology. Get-anti-kanin (w3960) och anti-mus (w3950) sekundära antikroppar köptes från Promega (Madison, WI, USA) RNAi.
Och transfektion
Human SPARC siRNA och kontroll siRNA var från Dharmacon Bioscience Corp (Chicago , IL, USA). Ekvimolära mängder av siRNA användes enligt tillverkarens anvisningar med kontroll icke-inriktning siRNA (CTRL). 150 000 celler ströks per sex-brunn i DMEM med 10% FBS och fick fästa över natten. Ekvimolära mängder av siRNA inkuberades med transit-TKO transfektionsreagens från Mirus (Madison, WI, USA) enligt tillverkarens anvisningar. Celler upprätthölls under 48 h före experiment om inget annat beskrives
Western blot-analys
Tjugo mikrogram av den totala proteiner separerades genom SDS-PAGE och överfördes på ett PVDF-membran. Membranet inkuberades sedan med antikroppar specifika för SPARC (Santa Cruz; 1: 500), eller anti-β-aktin (Sigma; 1: 1000) över natten vid 4 ° C. Bundna antikroppar visualiserades med användning av förstärkt kemiluminescens. För att bekräfta lika belastning ades membranen avdrogs under 30 minuter vid 50 ° C i buffert innehållande 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,7), och 100 mM 2-merkaptoetanol och reprobed med en anti-β-aktin-antikropp för att påvisa lika lastning . Densiteten för banden kvantifierades genom densitometrisk analys med användning av Imagetool (version 3,0) systemet.
RT-PCR
Totalt RNA (1-2 ug) transkriberades omvänt med användning av en Superscript pre-amplifiering kit (Invitrogen, Carlsbad , CA). Primers baserades på sekvenser som rapporterats på Genbank (NM 003.118). SPARC senssekvensen var 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'och SPARC antisens-sekvens 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3'. Den förväntade produkten storlek SPARC cDNA 512bp. ß-aktin senssekvensen var 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'och SS-aktin antisens-sekvens 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. Den förväntade produktstorlek av ß-aktin cDNA 514bp. PCR-amplifiering utfördes i 25 | il reaktionsvolymer innehållande 0,2 | iM dNTP, 20 pmol av varje oligonukleotidprimer, och 0.2U Taq-polymeras i PCR-buffert. cDNA amplifierades på en PCR-termisk styrenhet med en initial denaturering vid 95 ° C under 5 min, följt av cykler av 95 ° C under 1 min, 65 ° C under 1 min och 72 ° C under 1 min, 27 cykler, och ett slutligt förlängningssteg av 72 ° C under 10 min. Mängden utgångs cDNA justerades med användning av β-aktin intensitet.
Cellmigrationsassay
cellernas förmåga att migrera genom filter mättes med en BioCoat Matrigel invasion kammare (BD Biosciences, San José, CA). Cellodling skär med en 8 pm porstorlek PET membran användes enligt protokollet från tillverkaren. Bottenkammaren inkluderade medium (0,75 ml) innehållande 10% FCS, medan SPARC siRNA transfekterade eller kontroll-transfekterade celler (1,0 x 10 5 suspenderade i 0,5 ml medium innehållande 1% FCS) såddes i den övre kammaren och inkuberades över natten vid 37 ° C i en fuktig atmosfär innehållande 5% CO 2. Remaning celler på den övre ytan ades mekaniskt bort. Membranen tvättades sedan, fixerades och färgades med Diff-Quik (Medion Diagnostics). Antalet celler som migrerade till den nedre ytan av filtren bestämdes genom att räkna färgade celler under ett ljusmikroskop vid tre oberoende fält (0,25 mm 2 /brunn).
Celltillväxt och viabilitetsanalys
effekten av SPARC siRNA på livskraften hos cellerna bestämdes genom MTT-analysen. I korthet innebar detta MGC803 och HGC 27 celler ströks ut med 1 x 10 4-celler per brunn i nittiosex-brunnars mikrotiterplattor. Efter inkubation i 72 h tillsattes cellviabilitet bestämdes. Därefter 20 | il MTT (10 mg /ml i PBS lager, späddes till arbetskoncentration av 1 mg /ml med medium) sattes till varje brunn och inkuberades under 4 h. Efter noggrann avlägsnande av mediet, tillsattes 200 | j, l dimetylsulfoxid sattes till varje brunn och skakades noggrant. Absorbansen registrerades på mikroplattläsare (ELX 800; Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, USA) på en 570 nm våglängd. Effekten av SPARC siRNA på celltillväxthämning utvärderades som procent cellviabilitet där vehikelbehandlade celler togs som 100% viabla.
Cellcykelanalys och annexin V-färgning
För flödescytometrisk cellcykelanalys, behandlades cellerna med siRNA uppsamlades, tvättades med PBS, fixerades i kall 70% etanol, och lagrades vid -20 ° C tills färgning. Efter fixering, tvättades cellerna med PBS och inkuberades med 50 | j, g /mL RNaseA (Sigma) under 30 min vid 37 ° C, innan färgning med 50 | j, g /mL propidiumjodid (Sigma). Apoptotiska celler i tidiga och sena stadier upptäcktes med hjälp av en annexin V-FITC Apoptos Detection Kit från BioVision (Mountain View, CA, USA). I korthet, transfekterades cellerna med siRNA. Vid 96 h efter transfektion, var odlingsmedia och celler uppsamlades och centrifugerades. Efter tvättning återsuspenderades cellerna i 490 mikroliter annexin V bindningsbuffert, följt av tillsats av 5 | il annexin V-FITC och 5 mikroliter propidiumjodid. Proven inkuberades i mörker under 5 min vid rumstemperatur och analyserades med hjälp av flödescytometri. Statistik
Resultaten uttrycktes som betyda expressionsnivåer (± SD). Students t
-test eller rangsummetest användes för statistisk analys. Ett p-värde < 0,05 togs som signifikansnivån (dubbelsidig).
Resultat
Expression av SPARC i odlade gastric cancerceller
Vi utvärderade först den endogena uttrycket av SPARC i flera humana gastriska cancercellinjer. Vi fann att SPARC-protein och mRNA var förhärskande i MGC803 och HGC27 celler, producerades vid lägre nivåer genom SGC7901 cellinjen var undectable i NCI-N87 och BGC823 cellinjer (Figur 1). Figur 1 Expression av SPARC i gastric cancercellinjer. A, Immunoblotanalys med användning av en polyklonal kanin SPARC-antikropp (1: 500). B, Specific RT-PCR (RT-PCR) analys för SPARC. p-aktin användes som laddningskontroll. C, relativ SPARC mRNA expressionsnivåer. Autoradiografer scannades och analyserades genom densitometri följt av kvantifiering i förhållande till p-aktin. Resultaten visas som expression (i%) i förhållande till p-aktin och är medelvärden (± SD) av 3 experiment Inhibering av endogen SPARC-expression.
Efter denna första screening, MGC803 celler och HGC27 celler som uttrycker relativt höga endogena SPARC etablerades knockdown uttrycker SPARC på ett övergående sätt för att bestämma vikten av endogena SPARC uttryck. Som visas i figur 2A, var SPARC uttryck hämmas med SPARC siRNA transfektanter i proteinnivåer. Dessa resultat tyder på att dessa SPARC siRNA framgångsrikt utöva en ljuddämpande effekt för SPARC uttryck. Figur 2 Effekt av SPARC knockdown på cellmigration i gastric cancercellinjer MGC 803 och HGC 27 celler. A. SPARC expression i MGC 803 och HGC 27, kontroll och SPARC siRNA transfekterade celler detekterades genom immunoblotanalys med användning av en polyklonal kanin SPARC-antikropp (1: 500). p-aktin användes som laddningskontroll. B. Effekter av SPARC knockdown på cellmigration i magsäckscancer cellinjer. SPARC uttryck slogs ner i MGC 803 och HGC 27 celler använder SPARC siRNA och utsattes för en migrationsanalys med användning av en två kamrar invasion apparat som beskrivits i Material och Metoder, histogram som visar procent inhibition av MGC 803 och HGC 27 cellinvasion. Experimentet utfördes i tre exemplar och det värde som erhålls från scrambled siRNA transfekterade celler sattes till 100%.
Nedreglering av SPARC uttryck hämmas gastric cancerceller invasion in vitro
att bestämma om SPARC siRNA kan minska protumorigenic cellulära beteenden i samband med SPARC uttryck, först bestämde vi effekten av minskad SPARC uttryck på tumörcellinvasion. Cellinvasion analys utfördes sedan med hjälp av Transwell kamrar. Vi mätte kapaciteten hos gastriska cancerceller att invadera genom Matrigel, en konstgjord extracellulär matris, efter transfektion med ett icke-målsökande kontroll siRNA eller SPARC siRNA. Minskade SPARC uttryck ledde till hämning av invasion av 69% och 79% i MGC803 och HGC27, respektive (Figur 2B, C). Sammantaget visar dessa resultat visar tydligt att undertryckandet av SPARC hämmar migration och invasion förmåga MGC803 celler och HGC27 celler.
Nedreglering av SPARC uttryck hämmar tillväxten av gastric cancerceller in vitro
Vi undersökte om SPARC siRNA kan minska överlevnad av gastric cancerceller. MGC 803 och HGC 27 gastriska cancerceller transfekterade med SPARC siRNA levde vid minskade priser relativt matchade celler som transfekterats med en icke-målsökande kontroll siRNA (figur 3A). Nedreglering av SPARC uttryck inte inducera cellcykelstopp i gastric cancerceller. Vi undersökte effekterna av SPARC siRNA på cellcykelprogression. Tysta SPARC i MGC803 och HGC27 celler ändrade inte G1 eller S fas populationer vid 72 h posttransfection med SPARC siRNA i jämförelse med den negativa kontrollgruppen (figur 3B). Figur 3 Effekter av SPARC knockdown på celltillväxt i gastric cancercellinjer. Den vänstra halvan data representerar data erhållna från MGC 803 celler och de rätta representerar data erhållna från HGC 27 celler. A. Basal tillväxten bestämdes efter 48 timmar i komplett medium vid MTT-analysen. Resultaten visas som medeltillväxt (i%) av respektive MGC 803 och HGC 27 cellinje och är organ (± SE) av fyrfaldiga bestämningar från sex separata experiment. Celler från siRNA och kontrollgrupperna samlades för cytometri cellcykelanalys. B. tysta SPARC av siRNA transfektion inte ändra cellcykelfördelning i MGC 803 och HGC 27 gastric cancerceller. MGC 803 och HGC 27 celler transfekterades med SPARC siRNA eller negativ kontroll siRNA. Vid 72 timmar efter transfektion, var DNA-innehållet mättes med användning av propidiumjodid (PI) färgning på flödescytometri.
Hämning av SPARC uttryck förstärker apoptos i gastric cancerceller
Vi undersökte om SPARC siRNA kan inducera celldöd i magcancer cellinjer. Behandlingen av MGC803 och HGC27 celler med SPARC siRNA ökade tidiga apoptotiska celler såväl som sena apoptotiska celler, jämfört med negativ kontroll siRNA-behandling (figur 4A), mätt med Annexin V-analys den. Som väntat var minskad överlevnad av celler som transfekterats med SPARC siRNA i samband med ökad förekomst av apoptos med 91% i MGC803 och 92% i HGC27 celler (Figur 4B). Dessa fynd tyder på att SPARC är involverad i apoptos att upprätthålla cellulär överlevnad i vissa gastric cancerceller. Figur 4 SPARC knockdown resultat i induktion av apoptos i gastric cancercellinjer. För flödescytometrisk analys, skördades cellerna 96 h efter transfektion med SPARC siRNA eller negativ kontroll siRNA, färgades sedan med annexin V-FITC och propidiumjodid (PI). Den vänstra halvan data representerar data erhållna från MGC 803 celler och de rätta representerar data erhållna från HGC 27 celler. Procentandelen annexin V /PI (tidig apoptotiska) och annexin V /PI (sent apoptotiska) celler visas i varje panel. Värden i fetstil indikerar minskande SPARC uttryck ökad apoptos med 65% i MGC803 och 92% i HGC27 jämfört med negativ kontroll siRNA.
Apoptotic effekten av SPARC siRNA transfekterade behandling i MGC 803 och HGC27 celler
I ett försök att belysa mekanismen för SPARC siRNA apoptos i MGC 803 celler och HGC27 celler, expressionsnivåer av apoptotiska reglerande proteiner, såsom Bcl-2, Bax och kaspas-3 och PARP utvärderades. MGC 803 celler och HGC27 celler transfekterades med SPARC siRNA. Som visas i figur 5, fanns signifikanta skillnader i uttryck av Bax och Bcl-2 i MGC 803 celler och HGC27 celler i jämförelse med den negativa kontrollgruppen (P < 0,05 och P < 0,01). Som svar på apoptotiska stimuli, är procaspase-3 klyvs till ett fragment 20 kDa, och den efterföljande autokatalytisk reaktion leder till bildningen av den aktiva fragmentet 17 kDa. När kaspas-3 är aktiverad är PARP klyvs. Således klyvning av PARP används som en indikator på apoptos. För att erhålla direkta bevis som visar förhållandet mellan kaspasaktivering och apoptos har procaspase-3 klyvning och PARP undersöks i MGC 803 celler och HGC27 celler efter SPARC siRNA transfekterade. Såsom visas i figur 5, SPARC siRNA inducerade klyvningen av 32 kDa procaspase-3 in i dess kDa formen aktiv 17 och klyvning av PARP dök upp i MGC 803-celler och HGC27 celler. Figur 5 Uttrycket av apoptos proteiner i MGC 803 och HGC27 celler efter transfektion med antingen kontroll eller SPARC siRNA. Cellysaten separerades på 10% SDS-PAGE-gel, överfördes till nitrocellulosamembran och sonderades med anti-PARP, anti-caspas-3, anti-Bcl-2, och anti-Bax. Proteinhalter normaliserades genom sondering samma membran med anti-β-aktin. . Den vänstra halvan data representerar data erhållna från MGC 803 celler och de rätta representerar data erhållna från HGC 27 celler
Diskussion
utsöndrat protein och rik på cystein, SPARC (även känd som osteonektin, eller källare-membran-40 , BM-40), är en medlem av en familj av matricellular proteiner, vars funktion är att modulera cell-matrix-interaktioner och cellfunktion utan att delta i den strukturella byggnadsställning av den extracellulära matrisen. Överuttryck av SPARC har dokumenterats i flera typer av solida tumörer, såsom bröst- [7], prostata [8], melanom [9] och glioblastom [10]. Däremot har lägre nivåer av SPARC uttryck återfinnas i andra typer av cancer, såsom äggstocks [11], kolorektal [12], pankreas [13, 14] och akut myeloisk leukemi [15]. Dessa observationer tyder på att tumörframkallande SPARC är celltyp specifika och kan vara beroende av tumörcellen omgivande miljön.
Kunskap om SPARC funktioner i mag cancerceller är fortfarande bristfällig. Vissa immunohistokemiska studier [16-20, 22] kollektivt rapporterade en uppreglering av SPARC i magsäckscancer jämfört med icke-neoplastisk slemhinna. Wewer et al. [17] beskrivit en differentiell expression av SPARC i epiteliala och stromala fack sex magcancer exemplar. Maeng [18] fann att SPARC uttrycks starkt i reaktiv stroma i samband med invasiva differentierade adenokarcinom och att det kan tjäna som en användbar klinisk diagnostisk markör för magcancer. Wang et al. [16] fann också en differentiellt uttryckt SPARC i mag cancerpatienter som bedöms av genen array analys, kvantitativ RT-PCR, och immunfärgning, högre SPARC uttryck var signifikant associerad med tumörprogression och avancerade stadier av magcancer. Franke et al. [20] visade på ett större patient serie som SPARC är differentiellt uttryckt i magcancer och att dess uttryck korrelerar med tumörprogression och nodal spridning med hjälp av vävnads microarrays (TMA), Nivån av uttryck av SPARC, bestäms av immunohistokemi, korrelerade i intestinal-typ magsäckscancer med lokal tumörtillväxt, nodal spridning och tumörstadium enligt den internationella unionen mot cancer. Zhao ZS et al. [19] fann att SPARC upptäcktes i 334 av 436 humana mag cancerfall och högt uttryckt i 239 tumörer. I stegen I, II och III, 5-års överlevnad av patienter med en hög uttryck för SPARC var betydligt lägre än hos patienter med lågt uttryck. Ytterligare multivariat analys föreslog att uppreglering av SPARC, MMP-2, och integrin beta1, var oberoende prognostiska indikatorer för sjukdomen.
Vi har samlat 49 magcancer vävnader och motsvarande normala vävnader genom kirurgiska ingrepp (Jie Yin, Guowei Chen, Si Liu, Jianxun Zhao, Yucun Liu: Expression av SPARC i human magsäckscancer är förknippad med de kliniska-patologiska drag lämnade). Fördelningen och uttryck av SPARC observerades genom immunhistokemi, Western blotting och RT-PCR, respektive. SPARC-protein och mRNA uttryckt betydligt högre i magcancer vävnader jämfört med normala vävnader. Graden av dess uttryck var associerade med differentiering av tumör, TNM division, peritoneal sådd och vaskulär invasion anmärkningsvärt. Patienter med högt uttryck av SPARC har sämre prognos än de med lågt uttryck av SPARC.
Sammantaget högre SPARC uttryck var signifikant associerad med tumörprogression och avancerade stadier av magcancer. Ny forskning av Inoue M et al [23] även identifieras SPARC som kandidat målantigen för immunterapi av olika cancerformer, inklusive magcancer av genomet hela cDNA microarray. Det är spännande att behandling med inriktning på SPARC-subenheten kan vara en användbar metod för att undertrycka gastrisk cancertillväxt. Emellertid är de molekylära mekanismer som ansvarar för onkogenes av SPARC i magcancer inte helt klarlagd. Genom uttrycksanalys av en panel av gastriska cancercellinjer visade vi att SPARC också överuttrycks i Sevel humana gastriska cancercellinjer. Därför testade vi våra hypoteser som SPARC kan vara en viktig molekyl i magcancer invasion och att rikta SPARC kan utgöra en ny terapeutisk strategi för anti-invasion av magcancer.
Spridning av cancerceller, antingen lokalt eller på avlägsna metastaserad platser, kräver att maligna celler förvärva förmågan att invadera basalmembranet och att ansluta sig till andra matriser. Det har föreslagits att SPARC kan spela en viktig roll under de inledande stegen i processen för tumörinvasion och metastas [24]. Dessutom kan SPARC inducera uttrycket av metalloproteinaser eller enzymer som sedan spela en viktig roll i nedbrytningen av basalmembran och extracellulära matriskomponenter [25]. SPARC associerades med invasions av meningiom [26, 27] och gliom [28]. Dessutom undertryckande av SPARC uttryck med hjälp av antisens-RNA hämmade motilitet och invasion av humana bröstcancerceller in vitro [21].
Att bestämma om SPARC siRNA kan minska protumorigenic cellulära beteenden i samband med SPARC uttryck, först bestämde vi effekten av minskad SPARC uttryck på tumörcellinvasion. Vi mätte kapaciteten hos gastriska cancerceller att invadera genom Matrigel, en konstgjord extracellulär matris, efter transfektion med SPARC siRNA eller en icke-målsökande kontroll siRNA. Minskade SPARC uttryck ledde till hämning av invasion av 69% och 79% i MGC803 och HGC27, respektive. Således kan SPARC siRNA minska magcancer invasion in vitro. Review En nyligen genomförd studie fann att SPARC skyddar cellerna från stressinducerad apoptos in vitro genom en interaktion med grin p1 heterodimerer som ökar ILK aktivering och prosurvival aktivitet [28]. Initiala studier med användning av antisens-RNA-strategier upphävde fullständigt human melanomtillväxt i nakna möss [21]. Horie et al. [29] visade att nedreglering av SPARC uttryck inducerad tillväxthämning med G 1 rest i humana melanomceller. Det har rapporterats att SPARC främjar gliom cellöverlevnad genom Akt aktivering genom integrin-signalering under serumfria förhållanden [30]. Dessa rapporter tyder starkt på att SPARC spelar en roll som en antistress faktor.
Å andra sidan, några artiklar fann att SPARC kan främja apoptos i cancerceller. Yiu och medarbetare [11] visade att exogen behandling av olika äggstockscancercellinjer med SPARC-inducerad apoptos. Said och Motamed [31] fann SPARC exponering ökade klyvs kaspas 3 i humana äggstockscancerceller som stödde tidigare observation. Bukspottskörteln [13] och äggstockscancer [30] uppvisade ökad tillväxt och minskad apoptos när de implanteras i SPARC - /-. I kolorektala cancercellinjer, överuttryck av SPARC minskad cellviabilitet och ökad apoptos i celler som utsätts för olika kemoterapeutiska medel [32].
Dessa till synes paradoxala observationer inom varje typ av cancer och mellan olika cancerformer kan förklaras av Tai förståelse av SPARC biology [33]: mindre peptidfragment av SPARC representerar de olika områdena i SPARC ger biologiska verksamhet som ibland motsätter de av andra fragment eller det nativa SPARC protein. Eftersom proteaset profil av tumören mikro kan skilja sig i olika typer av cancer, och som SPARC är känd för att genomgå proteolys av matrismetalloproteinaser [34], dessa skillnader, i kombination med förändringar i den lokala sammansättningen av matrismolekyler och cytokiner, kan alla vara bidragande till den komplexa beteendet hos SPARC i olika typer av cancer.
att belysa effekterna av SPARC siRNA på magcancer celltillväxt, var MTT proliferationsanalys utfördes för att jämföra proliferationen mellan SPARC siRNA transfekterade och kontroll-transfekterade MGC803 och HGC 27 celler. MGC803 och HGC27 gastric cancerceller transfekterade med SPARC siRNA levde på minskade priser i förhållande till matchade celler transfekterade med en icke-inriktning kontroll siRNA (Figur 3). Den minskade överlevnaden av celler som transfekterats med SPARC siRNA förknippades med ökad förekomst av apoptos mätt med Annexin V analysen. Minskande SPARC expression ökade apoptos genom 91% i MGC803 och 92% i HGC27 (Figur 4B).
Aktiva kaspaser spelar en viktig roll i induktionen av apoptos. När kaspas-3 aktiverades är PARP klyvs sent. Vanligtvis klyvningen av PARP användes som en indikator på apoptos. I föreliggande studie fann vi SPARC siRNA aktiverad kaspas-3 för att producera kluvna kaspas-3 (P17) -fragment i MGC 803-celler och HGC 27 vid 48 h. Samtidigt, var klyvningen av PARP detekterades också. Tyder resultaten på att SPARC inducerad fragmentering av PARP såväl som ökad kaspas-3-aktivitet i MGC 803 celler.
Bcl-2-familjen proteiner har rapporterats att reglera apoptos genom reglering av mitokondriell membranpermeabilitet. SPARC upp regleras uttrycket av Bax och ner regleras uttrycket av Bcl-2 i MGC 803 celler och HGC 27 celler. Vi fann att SPARC siRNA kunde framkalla magcancer cell apoptos och samtidigt minska förhållandet mellan Bcl-2 till Bax. Därför kan regleringen av Bcl-2 och Bax uttryck vara en viktig mekanism som ligger bakom SPARC induktion av apoptos i gastric cancerceller.
Så våra data indikerade att nedreglering av SPARC inhiberade celltillväxt av gastric cancerceller genom apoptos initiering, vilket samvete med melanom och gliom, men i motsats till äggstockscancer och cancer i bukspottkörteln. Induktion av apoptos var delvis reglerad till mitokondrie vägen t.ex. aktiverings kaspas vägen samt klyvning av PARP. Framtida studier måste fokusera på den exakta mekanismen.
Sammanfattningsvis vår nuvarande data antyder att SPARC spelade viktiga roller i apoptos och metastasering av magcancer. För närvarande finns det inga effektiva metoder för att bota sent stadium magsäckscancer. Som förhöjd SPARC uttryck är förknippad med minskad magsäckscancer patientöverlevnad [16], tror vi att våra resultat att visa på minskad invasion och ökad celldöd med siRNA riktade mot SPARC, tyder på att minska SPARC uttryck kan ha terapeutisk fördel för gastric cancerpatienter.
Deklarationer
Tack
Detta arbete stöddes av National Scientific Tecnològic stöd projektexportfonden [30901417]. Vi tackar professor Yang Ke och Xiaojuan Du i Peking University Health Science Centre, Beijing, Kina, för teknisk support.
Författar original lämnat filer för Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 13046_2010_306_MOESM1_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 1 13046_2010_306_MOESM2_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 2 13046_2010_306_MOESM3_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 3 13046_2010_306_MOESM4_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 4 13046_2010_306_MOESM5_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 5 konkurrerande intressen
författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

• Metallotionein 2A hämmar NF-kB vägen aktivering och förutsäger kliniskt utfall segregerade med TNM stadium i mag cancerpatienter efter radikal resektion
• Djup sekvensering av magcancer avslöjar somatiska mutationer som är relevanta för personlig medicin