Silazni SPARC izražavanja smanjuje rak želuca staničnu invaziju i survival

silazni SPARC izražavanja smanjuje rak želuca staničnu invaziju i opstanak pregled apstraktne pregled pozadine
izlučuje protein kiselo i bogato cistein (SPARC) igra ključnu ulogu u razvoju mnogih tkiva i vrste organa. Aberantna ekspresija SPARC nađeno je u širokom rasponu ljudskih tumora, doprinosi razvoju tumora. Zato SPARC nađeno je da je prekomjerna ekspresija u tkivu karcinoma želuca, stoga istražiti ekspresiju SPARC u želučanim linije raka i kancerogene mehanizama.
Način
SPARC ekspresija procijenjena je u panelu staničnih linija raka želuca , MGC803 i HGC 27 želučani rak stanične linije koje eksprimiraju visoku razinu SPARC prolazno su transfecirane SPARC specifične male interferirajuće RNA i nakon toga ispitani učinci na invaziju i proliferaciju. Pregled rezultata pregled mala interferirajuća RNA posredovano obaranje SPARC u MGC803 i HGC 27 želučane stanice raka drastično smanjila svoje invazije. Također je uočena obaranje SPARC značajno povećati apoptozu MGC803 i HGC 27 želučanih stanica raka u usporedbi s kontrolnom skupinom transficirana. pregled Zaključci
Naši podaci su pokazali da snižavanje od SPARC inhibira invaziju i rast ljudskih stanica raka želuca. Dakle, ciljanje SPARC može biti učinkovit terapijski pristup u borbi protiv raka želuca. Pregled Uvod pregled, Rak želuca je drugi vodeći uzrok smrti od raka povezanih u svijetu i jedan je od najagresivnijih tumora i često je povezana s limfnog čvora metastaza, peritonealni širenje i hematogenozni metastaze [1]. U cjelini, 65-70% novih slučajeva i smrtnih slučajeva od raka želuca javljaju u manje razvijenim zemljama. [2] U 2005. godini Stope incidencije raka želuca (0,3 milijuna smrti i 0,4 milijuna novih slučajeva) zauzela je treće mjesto među najčešćim oblicima raka u Kini. [3] Trenutna terapija za uznapredovalom stadiju ili metastatskim karcinomom želuca imaju mali učinak, kirurško uklanjanje s resekcijom susjednih limfnih čvorova nudi jedinu šansu za izlječenje, što je manje od 33% bolesnika s karcinomom želuca. Stopa preživljavanja 5 godina je samo 30-40%, s lošijom prognozom za uznapredovalih tumora. Razumijevanje molekularni mehanizmi na kojima se temelji razvoj raka želuca se pružaju uvid u novim terapijskim metama
izlučenog proteina kiseli i bogate cisteinom (SPARC, također poznat kao osteonectin ili BM-40), pripada matricellular obitelji izlučenih proteina [4 ]. SPARC je nestrukturnih komponenta izvanstaničnog matriksa koji modulira stanica-matriks, a posebno tijekom razvoja tkiva pregradnja i popravak [5]. Mnoge vrste raka karakterizira doreguliran ekspresijom SPARC [6]. Pojačanom ekspresijom SPARC je dokumentirana u nekoliko vrsta solidnih tumora, kao što su dojke [7], prostate [8], melanoma [9], a glioblastoma [10]. Nasuprot tome, niže razine ekspresije SPARC su pronađeni kod drugih tipova raka, kao što su ovarija [11], kolorektalni [12], pankreasa [13, 14] i akutne mijeloične leukemije [15]. Ova opažanja ukazuju na to da tumore učinak SPARC je vrsta stanica specifičan i može biti ovisan o tumorske stanice okoline.
Znanja o SPARC funkcija u želučanim stanicama raka je još uvijek rijetke. Prekomjerna ekspresija gena SPARC je zabilježena u ljudskoj raka želuca u pet drugih izvješća [16-20]. Međutim, svi gore navedeni studije nije detaljno u želučanom staničnih linija raka i kancerogeni mehanizam. SPARC je povezan s agresivnim fazama raka želuca iu korelaciji je s lošom prognozom [16], što sugerira da je smanjenje SPARC izražavanja može imati terapeutski učinak. Doista, ekspresija antisense oligonukleotidima protiv SPARC u stanicama melanoma blokira stvaranja tumora [21]. Točne bioloških i molekularni mehanizmi kroz koje se smanjenje SPARC izražavanja mogu doprinijeti poboljšanoj terapiji tumora koje treba istražiti. Stoga je cilj ovog istraživanja bio je karakterizirati SPARC funkcije u želučanim stanicama raka i istražiti svoje mogućnosti kancerogeni mehanizam.
Materijali i metode pregled kulturi stanica pregled ljudska rak želuca stanične linije NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 dobiveni su iz Cancer Institute kineske akademije medicinskih znanosti. Sve stanice se uzgajaju u RMPI 1640 (GIBCO ™) medij, uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma, penicilin G (100 jedinica /ml), i streptomicinom (100 ug /ml) nazivaju se kompletan medij. Stanice su održavane u jednoslojnoj kulturi, na 37 ° C u vlažnom zraku s 5% CO 2.
Kemikalije i reagensi pregled EDTA-2 natrij akridin narančasto, etidij bromid (EB) i 3- [4 5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazoliumbromide (MTT) nabavljeni su od tvrtke Sigma (St. Louis, MO, USA). Mišje monoklonsko protutijelo specifično za p-aktin od Sigma. Zec antitijela za specifična za Bcl-2 (SC-492), kaspaze-3 (SC-7148) i PARP (SC-7150) su došli iz Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Mišja monoklonska antitijela specifična za SPARC (SC-74295), i Bax (sc-7480) su dobiveni od Santa Cruz Biotechnology. Anti-zečje (w3960) i anti-miš (w3950) sekundarna antitijela su kupljena od Promega (Madison, WI, USA). Pregled RNAi i Transfekcija pregled ljudskim SPARC siRNA i kontrolnim siRNA su iz Dharmacon Bioscience Corp (Chicago IL, USA). Podjednaka količina iRNK su se prema uputama proizvođača s kontrolnim ne-ciljanje siRNA (CTRL). 150 000 stanice su stavljene po šest jamica u DMEM sa 10% FBS te su puštene da se pričvrste preko noći. Podjednaka količina iRNK su inkubirani s provoznim TKO reagensa za transfekciju iz mirus (Madison, WI, USA) prema uputama proizvođača. Stanice su održavane na 48 sati prije pokusa, osim ako nije drukčije opisano pregled Western blot analize pregled dvadeset mikrograma ukupnih proteina su razdvojeni pomoću SDS-PAGE i prenesen na PVDF membrani. Membrana je potom inkubirana s antitijelima specifičnim za SPARC (Santa Cruz, 1: 500), ili anti-p-aktin (Sigma, 1: 1000) preko noći pri 4 ° C. Vezanih antitijela su vizualizirani pomoću hemiluminiscencija. Za potvrdu jednak utovar, membrane su bile skinute tijekom 30 minuta na 50 ° C u puferu koji sadrži 2% SDS, 62.5 mM Tris (pH 6.7), i 100 mM 2-merkaptoetanola i ponovno ispitane sa anti-P-aktin antitijelo se dokazalo jednaku utovar , Gustoća vrpci kvantificira denzitometrijsku analizom pomoću ImageTool (verzija 3.0) sustava.
RT-PCR pregled Ukupna RNA (1-2 ug) je obratnoj transkripciji pomoću eksponent unaprijed pojačanje kit (Invitrogen, Carlsbad , CA). Početnici su na temelju sekvenci prijavljenih na GENEBANK (NM 003118). SPARC osjećaj sekvencija 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'i SPARC anti-sense slijed 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3'. Očekivani Veličina proizvod SPARC cDNA bilo 512bp. ß-aktin osjećaj sekvencija 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'i ß-aktin anti-sense slijed 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. Očekivani Veličina proizvod ß-aktin cDNA bilo 514bp. PCR amplifikacija je provedena u 25 ul reakcije volumena koji sadrži 0.2 uM dNTP, 20 pmol svakog primera oligonukleotida i 0.2U oznaka polimeraze u pufer za PCR. cDNA je na PCR termalnom kontroler s početnim denaturacije na 95 ° C 5 min, a zatim ciklusi od 95 ° C za 1 minutu, 65 ° C 1 min, a na 72 ° C tijekom 1 min, 27 ciklusa i završnog produženog stupnja na 72 ° C tijekom 10 min. Količina polazni cDNA podešen p-aktin intenzitet. Pregled Migracija stanica test pregled sposobnost stanica da migrira preko filtera je izmjerena pomoću Biocoat Matrigel invazijskoj komori (BD Biosciences, San Jose, CA). Stanične kulture unosi s 8 um veličina pora PET membrana su korišteni u skladu s protokolom proizvođača. Donja komora uključuje medij (0,75 ml) koja sadrži 10% FCS, a SPARC siRNA transfektirana ili s kontrolnim transfeciranim stanicama (1,0 × 10 5 suspendirane u 0.5 ml medija koji sadrži 1% FCS) su posađene u gornje komore i inkubiraju preko noći na 37 ° C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO 2. Preostali dio stanice na gornjoj površini su mehanički ukloniti. Membrane su zatim oprane, fiksni, a obojeni Diff-Quik (Medion Diagnostics). Broj stanica koje su migrirale na donju površinu filtera određena je brojanjem stanica obojenih pod svjetlosnim mikroskopom na tri nezavisne polja (0,25 mm 2 /well). Pregled rasta stanica i vijabilnost test
učinak SPARC siRNA na održivost stanica je određena MTT pokusom. Ukratko, MGC803 i HGC 27 stanice su stavljene na 1 × 10 4 stanica po jažici u devedeset šest mikrotitracijskih ploča. Nakon inkubacije od 72 h, stanična vijabilnost određena je. Zatim 20 ul MTT (10 mg /ml u PBS skladištu, razrijeđena na radne koncentracije od 1 mg /ml s medija) se doda u svaku jažicu i inkubirano 4 sata. Nakon pažljivog uklanjanja medija, 200 ul dimetil sulfoksida se doda u svaku jažicu i pažljivo promućka. Apsorbancija je snimljen na čitaču mikro ploče (ELX 800, Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, USA) pri 570 nm valne duljine. Učinak SPARC siRNA na inhibiciju rasta stanica je ocijenjena kao postotak vijabilnosti gdje stanice tretirani uzete su kao 100% izvediv. Analiza staničnog ciklusa pregled i aneksin V bojanja
za analizu staničnog ciklusa protočnom citometrijom, stanice obrađene siRNA se skupe, isperu s PBS, fiksiraju u hladnom 70% etanolu, te pohranjeni na -20 ° C do obojenja. Nakon fiksiranja, stanice su isprane s PBS-om i inkubirane s 50 | ig /mL RNaseA (Sigma) 30 minuta pri 37 ° C, prije bojanja s 50 ug /mL propidij jodida (Sigma). Apoptotičke stanice u ranim i kasnim fazama su detektirani pomoću V-FITC Detection Kit aneksin apoptoze iz BioVision (Mountain View, CA, USA). Ukratko, stanice su transfektirane s siRNA. Na 96 sati nakon transfekcije, mediji i kultura stanice su sakupljene i centrifugirane. Nakon pranja, stanice su resuspendirane u 490 jal aneksin V pufera za vezanje, nakon čega se doda 5 jal aneksin V-FITC i 5 ul propidij jodida. Uzorci su inkubirani u tami tijekom 5 min na sobnoj temperaturi i analizirana pomoću protočne citometrije.
Statistički podaci | Rezultati su izraženi kao srednje ekspresijske razine (± SD). Studentov t-test pregled ili rang sum testu su korišteni za statističku analizu. P-vrijednost < 0,05 je uzeta kao nivou značajnosti (obostrani). | Rezultati
Izražavanje SPARC u kulturi stanica želuca raka pregled Mi smo prvi put ocijenjeni endogene izraz SPARC u nekoliko ljudskih staničnih linija raka želuca. otkrili smo da SPARC i mRNA prisutni u MGC803 i HGC27 stanice, proizvedene su na nižim razinama proizvodi SGC7901 stanične linije su undectable u NCI-N87 i staničnih linija BGC823 (Slika 1). Na slici 1 ekspresiju SPARC u staničnim linijama raka želuca. A, Imunoblot analiza korištenjem zečjeg poliklonalnog antitijela SPARC (1: 500). B Specifično reverzne transkriptaze lančane reakcije polimeraze (RT-PCR) analiza SPARC. P-aktin je korišten kao kontrola za punjenje. C, relativna SPARC mRNA ekspresije. Autoradiographs su skenirani i analizirani densitometrijom praćeno određivanjem u odnosu na p-aktin. Rezultati su prikazani kao izraz (u%) u odnosu na p-aktin i sredstva (± SD) 3 eksperimenta. Pregled Inhibicija endogene SPARC ekspresije pregled Nakon tog početnog screening, MGC803 stanice i stanice koje eksprimiraju HGC27 relativno visoku endogenih SPARC uspostavljeni su obaranje izražavanje SPARC na prolazan način kako bi se utvrdilo je važnost endogenog SPARC izražavanja. Kao što je prikazano na Slici 2A, ekspresija SPARC inhibirana s SPARC siRNA transfektanata u razini proteina. Ovi rezultati ukazuju na to da je riječ o SPARC siRNA uspješno izvršiti utišavanje učinak za SPARC izražavanja. Slika 2 Učinak SPARC obaranje na migraciju stanica u želučanoj staničnim linijama karcinoma MGC 803 i HGC 27 stanica. A. SPARC izraz u MGC 803 i HGC 27, kontrolu i SPARC siRNA transficiranih stanica detektira imunoblot analizom korištenjem zečjeg poliklonalnog SPARC antitijela (1: 500). P-aktin je korišten kao kontrola za punjenje. B. Učinak SPARC obaranje na stanične migracije na želučani staničnim linijama raka. SPARC izraz je srušen u MGC 803 i HGC 27 stanica pomoću SPARC siRNA i podvrgnuti testu migracije pomoću dvije komore aparata za invaziju kao što je opisano u materijalima i metodama, histogram koji prikazuje postotak inhibicije MGC 803 i HGC 27. invazije stanica. Pokus je učinjeno u tri primjerka, a dobivene od kodiranih siRNA inficiranim stanicama vrijednost postavljena je kao 100%. Pregled silazni SPARC izražavanja inhibirana želučane invaziju stanica raka in vitro pregled biste utvrdili je li SPARC siRNA mogao smanjiti protumorigenic stanične ponašanja koje je povezano s SPARC izraz, prvo utvrditi učinak smanjenog SPARC izražavanja na invaziju tumorskih stanica. Invazija stanica test su potom izvedena primjenom transjažičnih komora. Izmjerili smo kapacitet želuca stanica raka da napadnu kroz Matrigel, umjetnom izvanstaničnog matriksa, nakon transfekcije s ne-ciljanje kontrolnoj siRNA ili SPARC siRNA a. Smanjena SPARC izraz doveo do inhibicije invazije 69% i 79% u MGC803 i HGC27, odnosno (Slika 2 B, C). Uzeti zajedno, ovi rezultati jasno pokazuju da potiskivanje SPARC inhibira migraciju i invaziju sposobnost MGC803 stanica i HGC27 stanica. Pregled silazni SPARC izražavanja inhibira rast stanica želuca raka in vitro pregled Istraživali smo da li SPARC siRNA mogao smanjiti preživljavanja želučanih stanica raka. MGC 803 i HGC 27 želučani stanice raka su transfektirane s SPARC siRNA preživio smanjila stopa u odnosu na podudaraju stanica transficiranih s ne-ciljanje kontrolu siRNA (Slika 3A). Podreguliranje SPARC ekspresije nije inducirao arest staničnog ciklusa u želuca stanica raka. Ispitali smo učinke SPARC siRNA na progresiju staničnog ciklusa. Odsutnost SPARC u MGC803 i HGC27 stanice nisu promijenili G1 ili S faze populacije na 72 h s posttransfection SPARC siRNA u usporedbi s negativnom kontrolnom skupinom (slika 3B). Slika 3 Učinci SPARC obaranje na rast stanica u staničnim linijama raka želuca. lijevoj polovici podaci predstavljaju podatke dobivene iz MGC 803 stanica i one prave predstavljaju podatke dobivene iz HGC 27 stanica. rast A. Bazalna je određen nakon 48 sati u kompletnom mediju po MTT pokusom. Rezultati su prikazani kao srednja rast (u%) odgovarajućeg MGC 803 i HGC 27 staničnu liniju i sredstva (± SE) za četverostrukim određivanja od šest različitih eksperimenata. Stanice siRNA i kontrolne grupe su prikupljene za analizu staničnog ciklusa citometrijom. B. odsutnost SPARC po siRNA transfekcijom nije promijenio raspodjelu staničnog ciklusa u MGC 803 i HGC 27 želučanih stanica raka. MGC 803 i HGC 27 stanice su transfektirane s SPARC siRNA ili negativna kontrola siRNA. U 72 sata poslije infekcije, sadržaj DNA mjerena je pomoću propidij jodid (PI) bojenje na protočnom citometrijom. Pregled Inhibicija SPARC izražavanja poboljšava apoptozu u stanicama raka želuca pregled Istraživali smo da li SPARC siRNA mogao izazvati smrt stanica karcinoma želuca staničnih linija. Liječenje MGC803 i HGC27 stanica s SPARC siRNA povećava ranije apoptoze stanica, kao i kasnih apoptoze stanica, u usporedbi s negativna kontrola siRNA tretmana (slika 4a) koja se mjeri pomoću testa Annexin V. Kao što se i očekivalo, smanjila opstanak stanicama zaraženim s SPARC siRNA bila povezana s povećanim stopama apoptoze za 91% u MGC803 i 92% u HGC27 stanica (slika 4b). Ovi rezultati sugeriraju da SPARC sudjeluje u apoptozi za održavanje stanične opstanak u nekim želučanih stanica raka. Slika 4 SPARC obaranje rezultata indukcije apoptoze u staničnim linijama raka želuca. Za protočnom citometrijskom analizom, stanice se prikupe 96 sati nakon transfekcije s SPARC siRNA ili negativna kontrola siRNA, potom bojane s Annexin V-FITC i propidij jodida (PI). lijevoj polovici podaci predstavljaju podatke dobivene iz MGC 803 stanica i one prave predstavljaju podatke dobivene iz HGC 27 stanica. Postoci aneksin V /PI (početkom apoptoze) i aneksin V /PI (kasna apoptoze) stanice prikazan je na svakoj ploči. Vrijednosti u bold ukazuju smanjuje ekspresiju SPARC povećala apoptoza za 65% u MGC803 i 92% u HGC27 usporedbi s negativnom kontrolom siRNA.
Apoptotičnih učinak SPARC siRNA transficirana liječenje u MGC 803 i HGC27 stanice
U nastojanju da se razjasni Procijenjeni su mehanizam inducirane apoptoze SPARC siRNA u MGC 803 stanicama i HGC27 stanica, razina ekspresije proteina apoptoze-regulation poput Bcl-2, Bax i kaspase-3 i PARP. MGC 803 stanice i HGC27 stanice su transfektirane s SPARC siRNA. Kao što je prikazano na slici 5, bile su značajne razlike u izrazima Bax i bcl-2 u MGC 803 stanica i HGC27 stanica u odnosu na negativna kontrolna grupa (P < 0,05 i P < 0,01). Kao odgovor na apoptotički stimulus, procaspase-3 odcjepljuje u kDa fragmenta 20, a kasnije autokatalitički reakcija dovodi do stvaranja aktivnog 17 kDa fragmenta. Kada se uključi kaspaze-3, PARP se cijepa. Tako cijepanje PARP koristi se kao pokazatelj apoptoze. Kako bi se dobio izravne dokaze odnos apoptotskih i apoptoze, procaspase-3 cijepanja i PARP su ispitani u MGC 803 stanicama i HGC27 stanica nakon SPARC siRNA transficirana. Kao što je prikazano na slici 5, SPARC siRNA izazvana cijepanja 32 kDa procaspase-3 u njegov aktivan 17 kDa oblik i cijepanjem PARP pojavila u MGC 803 stanica i HGC27 stanice. Slika 5 Izraz apoptoze proteina u MGC 803 i HGC27 stanica nakon transfekcije s obje kontrole ili SPARC siRNA. Stanični lizati su odvojeni na 10% SDS-PAGE gelu, prebaci na nitroceluloznu membranu i obilježeni sa anti-PARP, anti-kaspaze-3, anti-Bcl-2, i anti-Bax. Sadržaj proteina su normalizirani ispitivanjem iste membrane s anti-P-aktin. . Na lijevoj polovici podaci predstavljaju podatke dobivene iz MGC 803 stanica i one prave predstavljaju podatke dobivene iz HGC 27 stanica pregled Rasprava
luči proteine ​​i bogata cistein, SPARC (također poznat kao osteonectin ili podrum-membrana-40 , BM-40) je član obitelji matricellular proteina, čija je funkcija da moduliraju stanica-matriks i funkcije stanice bez sudjelovanja u strukturnoj kostura ekstracelularnog matriksa. Pojačanom ekspresijom SPARC je dokumentirana u nekoliko vrsta solidnih tumora, kao što su dojke [7], prostate [8], melanoma [9], a glioblastoma [10]. Nasuprot tome, niže razine ekspresije SPARC su pronađeni kod drugih tipova raka, kao što su ovarija [11], kolorektalni [12], pankreasa [13, 14] i akutne mijeloične leukemije [15]. Ova opažanja ukazuju na to da tumore učinak SPARC je vrsta stanica specifičan i može biti ovisan o tumorske stanice okoline.
Znanja o SPARC funkcija u želučanim stanicama raka je još uvijek rijetke. Neki imunohistokemijske studije [16-20, 22] kolektivno izvijestio up-regulacije SPARC karcinoma želuca u usporedbi s neoplastičnom sluznice. Wewer et al. [17] opisali su diferencijalna ekspresija SPARC u epitelnim i strome pregradaka šest želučane uzoraka raka. Maeng [18] su otkrili da SPARC jako je izražen u reaktivnom stromi koja je povezana s invazivnih adenokarcinoma diferenciranih te da to može biti koristan klinički dijagnostički biljeg za karcinom želuca. Wang i sur. [16] također pronašao različito izražena SPARC u bolesnika s rakom želuca što je procijenjeno gen array analizu, kvantitativno RT-PCR-om, te imunološkim, izraz veća SPARC je značajno povezana s progresijom tumora i naprednim stadijima raka želuca. Franke et al. [20] pokazano na većim serijama pacijenata koji SPARC različito se izražava u želučanom karcinomima te da njegova ekspresija korelira s progresijom tumora i limfnih čvorova širenja korištenjem microarrays tkiva (TMAs), razina ekspresije SPARC, određuje imunohistokemijski, korelaciji u intestinalni tipa raka želuca s rastom lokalnih tumora, limfnih čvorova širenja i tumora fazi prema Međunarodnoj unije protiv raka. Zhao ZS et al. [19] su otkrili da SPARC otkriven je u 334 u 436 humanih slučajeva raka želuca te je visoko izražen u 239 tumora. U fazama I, II i III, stopa preživljavanja od 5 godina od bolesnika s visokom ekspresijom SPARC bila je znatno niže od onih u bolesnika s niskom ekspresijom. Nadalje multivarijatna analiza sugerira da uzlazni SPARC, MMP-2 i integrina beta1, bili neovisni prognostički pokazatelji bolesti. Pregled, prikupili smo 49 želučanog tkiva raka i odgovara normalna tkiva kroz kirurške zahvate (Jie Yin, GuoWei Chen, Si Liu, Jianxun Zhao, Yucun Liu: Izražavanje SPARC u ljudskom raka želuca je povezana s kliničkim-patološke značajke, podnosi). Distribucija i izraz SPARC uočene su imunohistokemijski, Western hibridizacija i RT-PCR, respektivno. SPARC proteina i mRNA izražena je značajno viša u želučanom tkivu karcinoma u usporedbi s normalnim tkivima. Stupnjevi njezina izraza su povezani s diferencijacijom tumora, TNM podjele, peritonejsku sijanje i vaskularne invazije znakovito. Bolesnici s visokom ekspresijom SPARC imaju lošiju prognozu od onih s niskim izrazom SPARC.
Uzeti zajedno, izraz veća SPARC je značajno povezana s progresijom tumora i naprednim stadijima raka želuca. Novija istraživanja Inoue M et al [23] i identificiran SPARC kao ciljna antigen za imunoterapiju različitih vrsta raka uključujući rak želuca do genoma širok cDNA microarray. To je uzbudljivo da terapija ciljanje SPARC podjedinica može biti koristan pristup potisnuti rast raka želuca. Međutim, molekularni mehanizmi, odgovorni za onkogenezom SPARC u karcinomu želuca nije u potpunosti razumljiv. Putem ekspresije analize ploče želučanih staničnim linijama raka, pokazali smo da SPARC također izraženo u sevel staničnih linija raka želuca. Dakle, mi smo testirali naše hipoteze da SPARC može biti ključna molekula u želučanom invazije karcinoma, a to ciljanje SPARC može predstavljati novi terapijski strategiju za suzbijanje invazije karcinoma želuca. Pregled Širenje stanica raka, bilo lokalno ili na udaljenoj metastazama web stranice, zahtijeva da se maligne stanice steći sposobnost da napadne bazalnu membranu i da se pridržavaju druge matrice. On je predložio da SPARC može igrati ključnu ulogu u početnim koracima u procesu tumorske invazije i metastaziranja [24]. Osim toga, može SPARC induciraju ekspresiju metaloproteinaza ili enzima koji naknadno igra važnu ulogu u razgradnji bazalnih membrana i komponente ekstracelularnog matriksa [25]. SPARC bio povezan s invazivnosti od meningeoma [26, 27] i glioma [28]. Nadalje, suzbijanje SPARC izražavanja pomoću RNA inhibiraju pokretljivost i invaziju stanica ljudskog karcinoma dojke in vitro [21].
Bi se utvrdilo da li SPARC siRNA mogao smanjiti protumorigenic stanične ponašanja koje je povezano s SPARC izražavanja, prvo utvrditi učinak smanjen SPARC izraz invazije tumorskih stanica. Izmjerili smo kapacitet želuca stanica raka da napadnu kroz Matrigel, umjetnom izvanstaničnog matriksa, nakon transfekcije s SPARC siRNA ili kontrole siRNA ne-ciljanje. Smanjena ekspresija SPARC dovela je do inhibicije invaziju za 69%, odnosno 79% u MGC803 i HGC27, respektivno. Dakle, SPARC siRNA može smanjiti želučanu invazije in vitro.
Nedavno istraživanje pokazalo je da SPARC štiti stanice od stresa izazvanog apoptoze in vitro kroz interakciju s integrinom β1 heterodimera koji povećavaju aktivaciju sorte i prosurvival aktivnost [28]. Početne studije koje koriste RNA strategija potpuno ukida rast ljudskog melanoma na miševe [21]. Horie et al. [29] su pokazali da podreguliranje SPARC ekspresije inducirane inhibicije rasta s G 1 arest u ljudskim stanicama melanoma. To je izvijestio da je SPARC potiče preživljavanje glioma stanica kroz Akt aktivacije kroz signalizaciji integrina u uvjetima bez seruma [30]. Ta izvješća snažno sugeriraju da SPARC igra ulogu kao faktor Antistres.
S druge strane, neki članci su otkrili da SPARC mogu promovirati apoptozu u stanicama raka. Yiu i kolege [11] pokazalo je da egzogeni liječenje raznih jajnika staničnim linijama karcinoma s SPARC inducirane apoptoze. Said i Motamed [31] pronašao SPARC izloženost porastao cijepaju kaspaze 3 u ljudskim stanicama karcinoma jajnika koji podržava bivšeg promatranje. Gušterače [13] i jajnika [30] izlagao veći rast i smanjuje apoptozu kada je ubačen u SPARC - /-. U kolorektalnog karcinoma staničnim linijama, pojačanom ekspresijom SPARC smanjena stanica održivost i pojačanu apoptozu u stanicama izloženim različitim kemoterapijskih agenasa [32].
Te naizgled paradoksalne opažanja unutar svake vrste raka i preko različitih vrsta raka može se objasniti Tai razumijevanja SPARC biologija [33]: manji peptidne fragmente SPARC koji predstavljaju različite domene SPARC daju biološke aktivnosti koje s vremena na vrijeme, protive onima drugih fragmenata ili nativnom SPARC proteina. Od profila proteaze mikrookoliša tumora mogu se razlikovati u različitim tipovima raka, kao i SPARC je poznato da se podvrgne proteolizu od matričnih metaloproteinaza [34], te razlike u kombinaciji s promjenama u lokalnoj sastav matrice molekula i citokine, mogu svi se doprinosi kompleksnog ponašanja SPARC u različitim vrstama raka.
da se razjasni učinke SPARC siRNA na rast želučane stanice raka, MTT proliferacija Ispitivanje je provedeno za usporedbu proliferaciju između SPARC siRNA transfektirana i kontrola transfektirane MGC803 i HGC 27 Stanice. MGC803 i HGC27 želučani stanice raka su transfektirane s SPARC siRNA preživio smanjila stopa u odnosu na podudaraju stanica transficiranih s ne-ciljanje kontrolu siRNA (Slika 3). Smanjena opstanak stanica transficiranih SPARC siRNA povezana s povećanjem stope apoptoze mjerena testom Annexin V. Smanjuje SPARC ekspresija povećala apoptoza 91% u MGC803 i 92% u HGC27 (Slika 4B).
Aktivni kaspaza igra važnu ulogu u indukciji apoptoze. Kada je aktiviran kaspaze-3, PARP odcjepljuje kasno. Obično cijepanje PARP je korišten kao indikator apoptoze. U ovom istraživanju, otkrili smo SPARC siRNA aktivirane kaspaze-3 za proizvodnju cijepana kaspaza-3 (P17) fragmente MGC 803 stanica i HGC 27 na 48 sati. Istovremeno, cijepanjem PARP je također otkriven. Rezultati pokazuju da SPARC izazvana fragmentaciju PARP, kao i povećanu aktivnost kaspaze-3 u MGC 803 stanica.
Bcl-2 obitelji proteini su izvijestili da regulira apoptozu kontroliranjem mitohondrijsku propusnost stanične membrane. SPARC se regulira ekspresiju Bax i dolje regulira ekspresiju bcl-2 u MGC 803 stanica i HGC 27 stanica. otkrili smo da SPARC siRNA induciraju želučani rak staničnoj apoptozi i istovremeno smanjuju odnos Bcl-2 u Bax. Stoga, regulacija Bcl-2 i Bax izražavanja može biti ključni mehanizam u podlozi SPARC indukciju apoptoze u želučanih stanica raka.
Dakle, naši podaci pokazuju da smanjena regulacija SPARC inhibiran staničnu proliferaciju želučanih stanica raka za pokretanje apoptoze, što savjesti s melanomom i gliom, no za razliku od jajnika i raka gušterače. Indukcija apoptoze je djelomično regulirana mitohondrija puteva poput aktivacije kaspaze put, kao i cijepanja PARP. Budućnost studija treba usredotočiti na točan mehanizam.
U zaključku, naš trenutni podaci predložio da SPARC igrao važnu ulogu u apoptozi i metastaziranja raka želuca. Trenutno ne postoje učinkoviti pristupi za liječenje kasnog stadija raka želuca. Kao što je povišen SPARC izraz je povezana sa smanjenom rak želuca bolesnika preživljavanje [16], vjerujemo da naši rezultati, koji pokazuju smanjen invaziju i povećana smrt stanica s siRNA usmjerene protiv SPARC, ukazuju na to da se smanjuje ekspresiju SPARC može imati terapijsku korist za bolesnika s rakom želuca.
deklaracijama
Zahvale
ovaj rad je podržan od strane Nacionalnog znanstveno tehnološke sporednu projekta Fonda [30901417]. Zahvaljujemo profesor Yang Ke i Xiaojuan du od Peking University Health Science Center, Peking, Kina, tehničke podrške.
Autorov izvorni poslanih datoteka za slike
Ispod su linkovi na autora izvornika dostavljenih datoteka za slike. Izvorna datoteka za Slika 1 13046_2010_306_MOESM2_ESM.jpeg autorskim 13046_2010_306_MOESM1_ESM.jpeg autora izvorne datoteke za sliku 2 13046_2010_306_MOESM3_ESM.jpeg autorskim izvorne datoteke na Slici 3 13046_2010_306_MOESM4_ESM.jpeg autorskim izvorne datoteke za Slika 4 13046_2010_306_MOESM5_ESM.jpeg autorskim izvorne datoteke za lik 5 suprotstavljenih interesa
autori izjavljuju da nemaju konkurentne interese. pregled

• Metalotioneina 2A inhibira aktivaciju NF-kB put i predviđa klinički ishod razvrstavaju s TNM fazi u bolesnika s rakom želuca sljedeće radikalne resekcije
• Duboko sekvencioniranje želučanog karcinoma otkriva somatske mutacije relevantne za personalizirane medicine