Подавление экспрессии СПАРК уменьшает клеточный рак желудка вторжения и выживание

Подавление экспрессии СПАРК уменьшает клеточный рак желудка вторжение и выживание
Аннотация
Справочная информация
секретируемый белок кислой и богатой цистеина (SPARC) играет ключевую роль в развитии многих тканей и типов органов. Аберрантная выражение СПАРК был найден в широком разнообразии опухолей человека, способствует развитию опухоли. Поскольку СПАРК было установлено, что избыточно экспрессируется в желудочной ткани рака человека, поэтому мы, чтобы исследовать экспрессию СПАРК в желудочном линий рака и канцерогенных механизмов.
Методы
СПАРК выражение оценивали в панели желудочных линий раковых клеток человека , MGC803 и ТЖК 27 клеток желудка линии, экспрессирующие высокий уровень СПАРК были трансфицированы с SPARC специфических малых интерферирующих РНК и впоследствии оценить на предмет воздействия на вторжения и распространения.
Результаты
малых интерферирующих РНК-опосредованной нокдаун СПАРК в MGC803 и ТЖК 27 клетки рака желудка резко сократили свое вторжение. Нокдаун СПАРК также наблюдалось значительное увеличение апоптоза MGC803 и ТЖК 27 клеток рака желудка по сравнению с контрольной группой, трансфицированных.
Выводы
Полученные нами данные показали, что downregulating СПАРК ингибирует инвазию и рост клеток рака желудка человека. Таким образом, нацеливание SPARC может быть эффективным терапевтическим подходом против рака желудка.
Введение
Рак желудка является второй ведущей причиной смертности от онкологических заболеваний во всем мире и является одним из самых агрессивных опухолей и часто ассоциируется с лимфатического узла метастазирование, перитонеальный распространение и гематогенным метастазированием [1]. В целом, 65-70% новых случаев заболевания и смерти от рака желудка происходят в менее развитых странах [2]. В 2005 году показатели заболеваемости раком желудка (0,3 миллиона случаев смерти и 0,4 миллиона новых случаев) занимает третье место среди самых распространенных видов рака в Китае [3]. Современные методы терапии для продвинутой стадии или метастатическим раком желудка имеют небольшой эффект, хирургическое удаление с резекцией смежных лимфатических узлов дает единственный шанс на лечение, что составляет менее 33% пациентов с раком желудка. Уровень 5-летней выживаемости составляет всего 30-40%, с плохим прогнозом для продвинутых опухолей. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе развития рака желудка может дать представление о новых терапевтических мишеней
секретируемый белок кислой и богатой цистеина (СПАРК, также известный как остеонектин или БМ-40). Принадлежит к семейству matricellular секретируемых белков [4 ]. СПАРК является неструктурная компонентом внеклеточного матрикса, который модулирует клетка-матрица взаимодействий, в частности, во время развития ткани, ремоделирование и ремонт [5]. Многие виды рака характеризуются повышающей регуляции экспрессии СПАРК [6]. Сверхэкспрессия СПАРК было зарегистрировано в нескольких типах солидных опухолей, таких как рак молочной железы [7], предстательной железы [8], меланому [9] и глиобластомы [10]. В отличие от этого, более низкие уровни экспрессии SPARC были обнаружены в других типах рака, таких как яичников [11], ободочной и прямой кишки [12], поджелудочной железы [13, 14] и острого миелолейкоза [15]. Эти наблюдения указывают на то, что онкогенные эффект СПАРК является тип клеток специфический и может зависеть от опухолевой клетки окружающей среды.
Знания о функциях SPARC в желудочном раковых клеток все еще редкое явление. Сверхэкспрессия гена СПАРК наблюдалась при раке желудка человека в пяти других докладов [16-20]. Тем не менее, все упомянутые выше исследования не было ни одной детали в желудочном линий раковых клеток и канцерогенного механизма. СПАРК была связана с агрессивными стадиями рака желудка и коррелирует с плохим прогнозом [16], что свидетельствует о том, что снижение экспрессии может иметь СПАРК терапевтическую пользу. Действительно, экспрессия антисмысловых олигонуклеотидов против СПАРК в клетках меланомы блокировали образование опухоли [21]. Точные биологические и молекулярные механизмы, посредством которых снижение экспрессии может СПАРК способствовать улучшению терапии опухолей остаются быть исследованы. Таким образом, цель настоящего исследования состояла в том, чтобы охарактеризовать функции в желудочном SPARC раковых клеток и исследовать его, возможно, канцерогенным механизм.
Материалы и методы
клеточной культуре
человека линии клеток желудка, NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 были получены из Института рака китайской академии медицинских наук. Все клетки культивировали в среде RMPI 1640 (GIBCO ™) среде, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллином G (100 ед /мл) и стрептомицина (100 мкг /мл), называется полной среды. Клетки поддерживали в монослойной культуре при 37 ° С в увлажненном воздухе с 5% CO <суб> 2.
Химикаты и реагенты
ЭДТА-2 натрия, акридинового оранжевого цвета, бромид этидия (ЕВ) и 3- [4, 5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенил tetrazoliumbromide (МТТ) были приобретены у Sigma (Сент-Луис, штат Миссури, США). Мышиные моноклональные антитела, специфичные к бета-актина от Sigma. Кроличьи поликлональные антитела, специфичные к Bcl-2 (SC-492), каспазы-3 (SC-7148) и ППА (SC-7150) были куплены у Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, США). Мышиные моноклональные антитела, специфичные к СПАРК (SC-74295) и Вах (SC-7480) были получены от Santa Cruz Biotechnology. Козы к антителам кролика (w3960) и анти-мышь (w3950) вторичные антитела были приобретены у Promega (Madison, WI, USA).
RNAi и трансфекция
Human СПАРК миРНК и миРНК контроля были из Dharmacon Bioscience Corp (Чикаго , IL, USA). Эквимолярные количества миРНК были использованы в соответствии с инструкциями изготовителя с управлением ненацеливании миРНК (CTRL). 150 000 клеток высевали в шесть лунку в DMEM с 10% FBS и было разрешено прикрепить на ночь. Эквимолярные количества киРНК инкубировали с транзитными-техническим нокаутом от Реагент трансфекции Mirus (Madison, WI, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Клетки выдерживали в течение 48 ч до экспериментов, если иное не указано
Вестерн-блот-анализа
Двадцать микрограммов общего белка разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на PVDF мембрану. Затем мембрану инкубировали с антителами, специфичными для архитектуры SPARC (Santa Cruz; 1: 500), или анти-бета-актина (Sigma, 1: 1000) в течение ночи при температуре 4 ° С. Св занные антитела визуализировали с помощью усиленной хемилюминесценции. Для того, чтобы подтвердить, равную нагрузку, мембраны были лишены в течение 30 минут при 50 ° С в буфере, содержащем 2% SDS, 62,5 мМ Трис (рН 6,7) и 100 мМ 2-меркаптоэтанола и зондировали с анти-бета-актин антитела, чтобы продемонстрировать равную нагрузку , Плотность полос количественно с помощью денситометрическом анализа с использованием ImageTool (версия 3.0) системы.
RT-PCR
Суммарную РНК (1-2 мкг) подвергали обратной транскрипции с использованием надиндекса комплекта предварительной амплификации (Invitrogen, Carlsbad , Калифорния). Праймеры были основаны на последовательности сообщили о геномами (NM 003118). СПАРК смысловой последовательностью 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'и СПАРК последовательность несмысловая 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3'. Ожидаемый размер продукта СПАРК кДНК 512bp. ß-актина смысловой последовательностью 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'и ß-актина последовательность несмысловая 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. Ожидаемый размер продукта из бета-актина кДНК 514bp. ПЦР-амплификацию проводили в 25 мкл объема реакционной смеси, содержащей 0,2 мкМ дНТФ, 20 пмоль каждого олигонуклеотидного праймера и 0.2U Tag-полимеразы в PCR-буфере. кДНК амплифицировали на терморегулято- ПЦР с первоначальной денатурации при 95 ° С в течение 5 мин, а затем циклов при 95 ° С в течение 1 мин, 65 ° С в течение 1 мин и 72 ° С в течение 1 мин, 27 циклов, и конечная стадия удлинения от 72 ° С в течение 10 мин. Величина пускового кДНК регулировали с использованием бета-актин интенсивности. Анализа миграции
Cell
способность клеток мигрировать через фильтры измеряли с использованием инвазии камеры Biocoat Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Клеточные культуры вставляет с 8 мкм размер пор ПЭТ мембрана были использованы в соответствии с протоколом производителя. В нижней камере включены среду (0,75 мл), содержащей 10% FCS, в то время как СПАРК миРНК трансфицированы или контрольные трансфицированные клетки (1,0 × 10 5 суспендировали в 0,5 мл среды, содержащей 1% FCS), высевали в верхнюю камеру и инкубировали в течение ночи при 37 ° с в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO <суб> 2. Remaning клетки на верхней поверхности были удалены механическим способом. Мембраны затем промывали, фиксированы и окрашивали Diff-Quik (Medion Diagnostics). Число клеток, которые мигрировали к нижней поверхности фильтров определяли подсчетом окрашенных клеток под световым микроскопом в трех независимых полях (0,25 мм 2 /лунку).
Роста клеток и жизнеспособность анализа
эффект СПАРК миРНК на жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-анализе. В кратком изложении, MGC803 и ТЖК 27 клетки высевают при 1 × 10 4 клеток на лунку в девяносто шесть-луночных микротитрационных планшетах. После инкубации в течение 72 ч, жизнеспособность клеток была определена. Затем 20 мкл МТТ (10 мг /мл в PBS запаса, разбавляют до рабочей концентрации 1 мг /мл с помощью носителя) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 4 часов. После тщательного удаления среды, 200 мкл диметилсульфоксида добавляли в каждую лунку и осторожно встряхивают. Поглощение регистрировали на микропланшет-ридере (ELX 800, Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, США) при 570 нм длиной волны. Эффект СПАРК миРНК на ингибирование роста клеток оценивали, как жизнеспособность в процентах клеток, где транспортное средство Обработанные клетки принимают за 100% жизнеспособность. Анализа
клеточного цикла и аннексина V окрашивающим Китай для анализа клеточного цикла методом проточной цитометрии, клетки обрабатывали миРНК собирали, промывали PBS, фиксировали в холодном 70% этаноле и хранили при -20 ° с до окрашивания. После фиксации клетки промывали PBS и инкубировали с 50 мкг /mL РНКазы А (Sigma) в течение 30 мин при температуре 37 ° С, перед тем окрашивания 50 мкг /mL пропидиума йодистого (Sigma). Апоптотических клеток в ранних и поздних стадиях были обнаружены с использованием аннексина V-FITC Апоптоз Detection Kit от BioVision (Mountain View, CA, USA). Вкратце, клетки были трансфицированы миРНК. На 96 ч после трансфекции, питательные среды и клетки собирали и центрифугировали. После промывки клетки ресуспендировали в 490 мкл аннексина V буфера связывания, с последующим добавлением йодида пропидиума V-FITC и 5 мкл аннексина 5 мкл. Образцы инкубировали в темноте в течение 5 мин при комнатной температуре и анализировали с использованием проточной цитометрии. Выражались Статистика пользователя
Результаты, как средние уровни экспрессии (± стандартное отклонение). т Студенческий
-теста или суммы рангов теста были использованы для статистического анализа. Р-значение &л; 0.05 был взят уровень значимости (двусторонний).

Результаты Экспрессия СПАРК в культуре клеток рака желудка
Сначала мы оценивали эндогенную экспрессию СПАРК в нескольких желудочных линиях раковых клеток человека. Мы обнаружили, что белок и СПАРК мРНК были распространены в MGC803 и HGC27 клеток, были получены при более низких уровнях клеточной линии SGC7901 были undectable в NCI-N87 и клеточных линий BGC823 (рисунок 1). Рисунок 1. Экспрессия СПАРК в желудочном линиях раковых клеток. А, анализ помощи иммуноблота с использованием кроличьей поликлональной антитела SPARC (1: 500). B, Удельная обратной транскриптазы полимеразной цепной реакции (RT-PCR) анализ для SPARC. b-актин использовали в качестве контроля нагрузки. C, Относительные уровни экспрессии мРНК СПАРК. Авторадиограммах сканировали и анализировали с помощью денситометра с последующим количественным по отношению к бета-актина. Результаты представлены в виде выражения (в%) по отношению к бета-актина и являются средством (± SD) из 3-х экспериментов.
Ингибирование экспрессии эндогенного SPARC
После этого первичного скрининга MGC803 клетки и клетки, экспрессирующие HGC27 относительно высокую эндогенные СПАРК были установлены нокдаун выражения SPARC в переходном образом, чтобы определить важность экспрессии эндогенного SPARC. Как показано на фигуре 2А, ​​экспрессия СПАРК ингибируется с СПАРК киРНК трансфектантов в уровне белка. Эти результаты свидетельствуют о том, что эти СПАРК миРНК успешно оказывают влияние глушителей для экспрессии SPARC. Рисунок 2 Влияние архитектуры SPARC нокдаун на миграцию клеток в желудочных линиях раковых клеток MGC 803 и ТЖК 27 клеток. Выражение А. СПАРК в MGC 803 и ТЖК 27, контроль и СПАРК миРНК трансфекции клеток определяли с помощью иммуноблот-анализа с использованием кроличьей поликлональной антитела SPARC (1: 500). b-актин использовали в качестве контроля нагрузки. B. Воздействие на СПАРК нокдаун миграции клеток в желудочных линиях раковых клеток. Выражение СПАРК был сбит в MGC 803 и ТЖК 27 клеток с помощью миРНК SPARC и подвергают анализа миграции с использованием двухкамерного вторжения устройство, как описано в разделе Материалы и методы, гистограмму, показывающую процент ингибирования MGC 803 и ТЖК 27 инвазии клеток. Эксперимент был проведен в трех экземплярах и значение, полученное из закодированных миРНК трансфекции клеток была установлена ​​как 100%.
Подавление экспрессии СПАРК тормозится клеток рака желудка в пробирке вторжение
Чтобы определить, является ли СПАРК миРНК может уменьшить protumorigenic клеточные поведения, связанные с выражение СПАРК, мы сначала определили влияние снижение экспрессии на СПАРК инвазии опухолевых клеток. Инвазии клеток для анализа были затем осуществляли с использованием Transwell камер. Мы измерили способность клеток рака желудка вторгнуться через Матригель, искусственного внеклеточного матрикса, после трансфекции с ненацеливании управления миРНК или SPARC миРНК. Снижение экспрессии SPARC привело к торможению вторжения на 69% и 79% в MGC803 и HGC27, соответственно (рис 2B, C). Взятые вместе, эти результаты четко показывают, что подавление СПАРК ингибирует миграцию и инвазию способность MGC803 клеток и клеток HGC27.
Отрицательная регуляция экспрессии СПАРК ингибирует рост клеток рака желудка в пробирке
Мы исследовали, могут ли СПАРК миРНК уменьшайте выживаемость клеток рака желудка. MGC 803 и ТЖК 27 Клетки рака желудка, трансфицированные СПАРК миРНК выжили при пониженной скорости по отношению к совпавших клеток, трансфецированных с ненацеливании контролем миРНК (рис 3А). Подавление экспрессии СПАРК не вызывает остановку клеточного цикла в клетках рака желудка. Мы исследовали влияние СПАРК миРНК на прогрессии клеточного цикла. Сайленсинг SPARC в MGC803 и HGC27 клетки не изменяют G1 или S фазы популяции через 72 часа после трансфекции с СПАРК миРНК по сравнению с отрицательной контрольной группой (рис 3B). Рисунок 3. Влияние архитектуры SPARC нокдаун на рост клеток в желудочных линиях раковых клеток. левая половина данные представляют собой данные, полученные от MGC 803 клеток и правильными представляют собой данные, полученные из ТЖК 27 клеток. Рост А. Базальный определяли через 48 ч в полной среде с помощью анализа МТТ. Результаты представлены в виде среднего роста (в%) соответствующего клеточной линии MGC 803 и ТЖК 27 и среднее (± SE) из четырех повторностях определений из шести отдельных экспериментов. Клетки из киРНК и контрольных групп собирали для анализа цитометрии клеточного цикла. B. Сайленсинг SPARC с помощью миРНК трансфекции не изменялся распределение клеточного цикла в MGC 803 и ТЖК 27 клеток рака желудка. MGC 803 и ТЖК 27 клетки были трансфицированы СПАРК миРНК или отрицательный контроль миРНК. Через 72 ч после трансфекции, измеряют содержание ДНК с использованием пропидийиодидом (PI) окрашивание на проточной цитометрии.
Подавление экспрессии SPARC усиливает апоптоз в раковых клетках желудка
мы исследовали, может ли СПАРК миРНК вызвать гибель клеток при раке желудка Сотовые линии. Лечение MGC803 и HGC27 клеток с СПАРК миРНК увеличилась в начале апоптоза клеток, а также поздние апоптотических клеток, по сравнению с отрицательным контролем миРНК лечения (рис 4A), измеренная с помощью аннексина V анализа. Как и ожидалось, снизился выживаемости клеток, трансфицированных миРНК СПАРК было связано с увеличением уровня апоптоза на 91% в MGC803 и 92% в HGC27 клеток (рис 4б). Эти данные позволяют предположить, что СПАРК участвует в апоптоза для поддержания выживания клеток в некоторых клеток рака желудка. Рисунок 4 SPARC нокдауна результаты в индукции апоптоза в желудочном линиях раковых клеток. Для анализа методом проточной цитометрии, клетки собирали 96 ч после трансфекции миРНК или СПАРК отрицательный контроль миРНК, а затем окрашивали аннексина V-FITC и пропиди иодидом (PI). левая половина данные представляют собой данные, полученные от MGC 803 клеток и правильными представляют собой данные, полученные из ТЖК 27 клеток. Процентное содержание аннексина V /PI (начало апоптоза) и аннексина V /PI (конец) апоптотических клеток показан на каждой панели. Значения, выделенные жирным шрифтом указывают на уменьшение экспрессии SPARC увеличилась апоптоз на 65% в MGC803 и 92% в HGC27 по сравнению с отрицательным контролем миРНК.
Апоптотических эффект СПАРК миРНК трансфицированных лечения в MGC 803 и HGC27 клетки
В попытке пролить свет на механизм СПАРК миРНК индуцированного апоптоза в клетках MGC 803 и HGC27 клеток, уровни экспрессии апоптотических-регуляторных белков, таких как Bcl-2, Bax и каспазы-3 и PARP были оценены. MGC 803 клетки и клетки HGC27 были трансфицированы СПАРК миРНК. Как показано на рисунке 5, Были существенные различия в выражениях Bax и Bcl-2 в клетках MGC 803 и клеток HGC27 по сравнению с отрицательной контрольной группой (Р &ЛТ; 0,05 и P ≪ 0,01). В ответ на апоптотических раздражители, прокаспаза-3 расщепляется в кД фрагменте 20, а последующая Автокаталитическая реакция приводит к образованию активного 17 кДа фрагмент. Когда каспазы-3 активируется, ППА расщепляется. Таким образом, расщепление PARP используется как индикатор апоптоза. Для того, чтобы получить прямые доказательства, показывающие взаимосвязь активации каспазы и апоптоза, прокаспаза-3 и расщепление PARP были исследованы в клетках MGC 803 и клеток HGC27 после СПАРК миРНК трансфицированы. Как показано на рисунке 5, СПАРК миРНК индуцированное расщепление 32 кДа прокаспазы-3 в активную 17 кД форму и расщепление PARP появились в MGC 803 клеток и HGC27 клетки. Рисунок 5 Выражение белков апоптоза в MGC 803 и клеток HGC27 после трансфекции либо контроля или SPARC миРНК. Клеточные лизаты были разделены на 10% геле SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и зондируют анти-PARP, анти-каспазы-3, анти-Bcl-2 и анти-Вах. Содержание белка нормализовали путем зондирования той же мембраны с анти-бета-актина. . Половинки данных, оставшихся представляют данные, полученные MGC 803 клеток и правильными представляют собой данные, полученные из ТЖК 27 клеток
Обсуждение
секретируемого белка и богатый цистеином, SPARC (также известный как остеонектин, или подвальном мембранно-40 , БМ-40), является членом семейства белков matricellular, функция которого состоит в модуляции клетка-матрица взаимодействий и функции клеток без участия в структурных эшафот внеклеточного матрикса. Сверхэкспрессия СПАРК было зарегистрировано в нескольких типах солидных опухолей, таких как рак молочной железы [7], предстательной железы [8], меланому [9] и глиобластомы [10]. В отличие от этого, более низкие уровни экспрессии SPARC были обнаружены в других типах рака, таких как яичников [11], ободочной и прямой кишки [12], поджелудочной железы [13, 14] и острого миелолейкоза [15]. Эти наблюдения указывают на то, что онкогенные эффект СПАРК является тип клеток специфический и может зависеть от опухолевой клетки окружающей среды.
Знания о функциях SPARC в желудочном раковых клеток все еще редкое явление. Некоторые иммуногистохимического исследования [16-20, 22] в совокупности сообщили о повышающей регуляции в СПАРК рака желудка по сравнению с неопухолевых слизистой оболочки. Wewer и др. [17] описали дифференциальную экспрессию СПАРК в эпителиальных и стромальных отсеков шести образцов рака желудка. Maeng [18] обнаружили, что СПАРК высоко экспрессирована в реактивной строме, связанной с инвазивными дифференцированной аденокарциномы, и что он может служить полезным клинического диагностического маркера рака желудка. Wang и др. [16] также обнаружили дифференциально экспрессируются в SPARC больных раком желудка, как оценивали с помощью анализа ряда генов, количественного RT-PCR и иммунное окрашивание, экспрессия выше СПАРК была в значительной степени связано с развитием опухоли и на поздних стадиях рака желудка. Franke и др. [20] показали на большом серии пациента, что СПАРК дифференциально экспрессируется в рака желудка и его экспрессия коррелирует с опухолевой прогрессии и узловой распространения с использованием микрочипов ткани (TMAS), уровень экспрессии SPARC, определяемой с помощью иммуногистохимии, коррелируют при раке желудка кишечного типа с ростом местной опухоли, узловой распространения и стадии опухоли в соответствии с Международным союзом против рака. Чжао З. С. и др. [19] обнаружили, что СПАРК был обнаружен в 334 из 436 случаев рака желудка человека и экспрессируется на высоком уровне в 239 опухолей. В стадии I, II, и III, 5-летняя выживаемость больных с высоким уровнем экспрессии СПАРК была значительно ниже, чем у пациентов с низким уровнем экспрессии. Далее многофакторный анализ показал, что положительная регуляция SPARC, ММР-2 и интегрину бета1, были независимыми прогностическими показателями заболевания.
Мы собрали 49 желудочные раковых тканей и соответствующих нормальных тканей с помощью хирургических процедур (Jie Инь, Guowei Чен, Si Лю, Jianxun Чжао, Лю Yucun: Экспрессия в СПАРК рака желудка человека связано с клинико-патологическими особенностями, который был представлен). Распределение и экспрессия СПАРК наблюдались с помощью иммуногистохимии, Вестерн-блоттинга и ОТ-ПЦР, соответственно. СПАРК белка и мРНК выражено значительно выше в желудочных раковых тканей по сравнению с нормальными тканями. Степень его выражения были связаны с дифференциацией опухоли, TNM деление, перитонеального высева и сосудистой инвазии замечательно. Пациенты с высоким уровнем экспрессии СПАРК имеют худший прогноз, чем те, с низким уровнем экспрессии СПАРК.
Взятые вместе, экспрессия выше СПАРК была в значительной степени связано с развитием опухоли и поздних стадиях рака желудка. Последние исследования Inoue M и др [23] даже identifed SPARC в качестве кандидата антигена-мишени для иммунотерапии различных видов рака, включая рак желудка по общегеномного кДНК микрочипов. Это интересно, что терапия ориентации субъединицу SPARC может оказаться полезным подходом для подавления роста опухоли желудка. Однако молекулярные механизмы, ответственные за онкогенеза СПАРК при раке желудка не совсем понял. С помощью анализа экспрессии полотнища желудочных линий раковых клеток, мы показали, что СПАРК также избыточно экспрессируется в Sevel желудка линий раковых клеток человека. Таким образом, мы проверили наши гипотезы, что SPARC может быть ключевой молекулой в желудочном инвазии рака, и что нацеливание SPARC может представлять новую терапевтическую стратегию для борьбы с нашествием рака желудка.
Распространение раковых клеток, либо локально, либо в отдаленных метастазов сайтов, требует, что злокачественные клетки приобретают способность вторгнуться базальную мембрану и прилипать к другим матрицам. Было высказано предположение, что может СПАРК играть ключевую роль на начальных этапах в процессе опухолевой инвазии и метастазированию [24]. Кроме того, СПАРК может индуцировать экспрессию металлопротеиназ или ферменты, которые впоследствии играют важную роль в деградации базальной мембраны и компонентов внеклеточного матрикса [25]. SPARC был связан с инвазивности менингиомы [26, 27] и глиомы [28]. Кроме того, подавление экспрессии СПАРК с помощью антисмысловой РНК ингибирует моторику и инвазию клеток рака молочной железы человека в пробирке [21].
Чтобы определить, если СПАРК миРНК может уменьшить protumorigenic клеточные поведения, связанные с выражением СПАРК, мы сначала определили влияние пониженной СПАРК выражение вторжения опухолевых клеток. Мы измерили способность клеток рака желудка вторгнуться через Матригель, искусственного внеклеточного матрикса, после трансфекции миРНК СПАРК или ненацеливании управления миРНК. Снижение экспрессии СПАРК приводило к ингибированию инвазии на 69% и 79% в MGC803 и HGC27, соответственно. Таким образом, СПАРК миРНК может уменьшить желудка вторжения рака в пробирке.
Недавнее исследование показало, что СПАРК защищает клетки от стресс-индуцированного апоптоза в пробирке через взаимодействие с интегрином β 1 гетеродимеры, которые усиливают активацию ILK и prosurvival активность [28]. Первые исследования с использованием антисмысловых стратегий РНК полностью аннулировал роста меланомы человека у голых мышей [21]. Хори и др. [29] показали, что подавление экспрессии СПАРК индуцированное ингибирование роста с G <суб> 1 арест в клетках меланомы человека. Сообщалось, что СПАРК способствует выживанию клеток глиомы через Akt активации посредством передачи сигналов интегрина под бессывороточной условиях [30]. Эти отчеты убедительно свидетельствуют, что СПАРК играет определенную роль как фактор антистрессового.
С другой стороны, некоторые статьи обнаружили, что СПАРК может способствовать апоптоз в раковых клетках. Йиу и его коллеги [11] показали, что экзогенный лечение различных овариальных линий раковых клеток с СПАРК индуцированного апоптоза. Саид и Мотамед [31] обнаружили подверженность СПАРК увеличилась расщепляется каспазы 3 в клетках карциномы яичника человека, которые поддерживали прежнее наблюдение. Поджелудочная [13] и рак яичников [30] выставлены больший рост и снижение апоптоза при имплантации в СПАРК - /-. В колоректального линиях раковых клеток, избыточная экспрессия СПАРК снижается жизнеспособность клеток и усиливают апоптоз в клетках, подвергшихся воздействию различных химиотерапевтических агентов [32]. Эти изображения, казалось бы, парадоксальные наблюдения внутри каждого типа рака и через различные рака можно объяснить пониманием Таи СПАРК биологии [33]: небольшие пептидные фрагменты СПАРК, представляющие различные области СПАРК придают биологической активности, которые порой, выступают против тех из других фрагментов или нативного белка SPARC. Поскольку профиль протеазы микроокружения опухоли могут отличаться в различных типах рака, а также СПАРК, как известно, подвергаются протеолиза матриксных металлопротеиназ [34], эти различия в сочетании с изменениями в локальном составе молекул матрикса и цитокинов, могут все вносить свой вклад в сложное поведение СПАРК в различных типах рака.
для выяснения влияния СПАРК миРНК на желудочную роста раковых клеток, анализ пролиферации МТТ проводили для сравнения пролиферации между СПАРК миРНК трансфицировали и контроль трансфицировали MGC803 и ТЖК 27 клетки. MGC803 и HGC27 рака желудка клетки, трансфицированные СПАРК миРНК выжили при пониженной скорости по отношению к совпавших клеток, трансфецированных с ненацеливании контролем миРНК (рисунок 3). Снижение выживаемости клеток, трансфицированных миРНК СПАРК было связано с увеличением уровня апоптоза, как измерено с помощью аннексина V анализа. Снижение экспрессии СПАРК увеличилось апоптозу на 91% в MGC803 и 92% в HGC27 (фиг.4В). Фотоигра каспазы играют важную роль в индукции апоптоза. Когда каспазы-3 был активирован, ППА расщепляется поздно. Обычно расщепление PARP использовали как показатель апоптоза. В настоящем исследовании мы обнаружили СПАРК миРНК активированного каспазы-3 для получения расщепленные каспазы-3 (р17) фрагментов в MGC 803 клеток и ТЖК 27 в 48 ч. В то же время, также было обнаружено расщепление PARP. Эти результаты указывают на то, что СПАРК индуцированной фрагментации PARP, а также повышенную активность каспазы-3 в клетках MGC 803.
The Bcl-2 белков семейства Сообщалось, что регулируют апоптоз путем регулирования проницаемости митохондриальной мембраны. СПАРК вверх регулировал экспрессию Вах и вниз регулирует экспрессию Bcl-2 в MGC 803 клеток и ТЖК 27 клеток. Мы обнаружили, что СПАРК миРНК может индуцировать клетку рака желудка апоптоз и одновременно снизить отношение Bcl-2 к Bax. Таким образом, регуляция экспрессии Bcl-2 и Вах может быть ключевой механизм, лежащий SPARC индукции апоптоза в клетках рака желудка.
Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что снижение экспрессии СПАРК ингибирует клеточную пролиферацию клеток рака желудка апоптозом инициации, что совесть меланома и глиома, но в отличие от рака яичников и рака поджелудочной железы. Индукцию апоптоза была частично регулируемой в митохондриальной пути, такие как активации каспазы пути, а также расщепление PARP. Будущие исследования необходимо сосредоточить внимание на точный механизм.
В заключение, наши нынешние данные свидетельствуют о том, что СПАРК сыграли важную роль в апоптозе и метастазирования рака желудка. В настоящее время не существует эффективных подходов для отверждения на поздней стадии рака желудка. Поскольку повышенная экспрессия СПАРК связано со снижением рака желудка выживаемость пациентов [16], мы полагаем, что наши результаты, продемонстрировав уменьшилось вторжение и увеличение гибели клеток с миРНК, направленной против СПАРК, свидетельствуют о том, что снижение экспрессии SPARC может иметь терапевтический эффект для больных раком желудка.
декларациях
Выражение признательности
Эта работа была поддержана Национальным научно-Technologic фонд поддержки проекта [30901417]. Мы благодарим профессора Ян Кэ и Xiaojuan Du Пекинского университета Центра медицинских наук, Пекин, Китай, для технической поддержки.
Авторы 'оригинальные файлы представлены для изображений изображения Ниже приведены ссылки на авторов оригинала, представленных файлов для изображений. 'Исходный файл для фигурного 1 13046_2010_306_MOESM2_ESM.jpeg Авторского 13046_2010_306_MOESM1_ESM.jpeg авторов исходного файла для Рисунок 2 13046_2010_306_MOESM3_ESM.jpeg Авторского исходного файла для Рисунок 3 13046_2010_306_MOESM4_ESM.jpeg Авторского исходного файла для исходного файла Рисунок 4 13046_2010_306_MOESM5_ESM.jpeg Авторского на рисунке 5 конкурирующие интересы
авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

• Металлотионеин 2A ингибирует активации пути NF-kB и предсказывает клинический исход отделены со стадией TNM в бол…
• Глубокое секвенирование рака желудка обнаруживает соматические мутации, имеющие отношение к персонализиров…