Nedregulering af SPARC udtryk falder mavekræft cellulære invasion og overlevelse

Nedregulering af SPARC udtryk falder mavekræft cellulære invasion og overlevelse
abstrakt
Baggrund
udskilt protein surt og rig på cystein (SPARC) spiller en central rolle i udviklingen af ​​mange væv og orgel typer. Aberrant SPARC ekspression blev fundet i en lang række forskellige humane cancere, bidrager til tumorudvikling. Fordi SPARC viste sig at være overudtrykt i human gastrisk cancer væv, vi derfor at undersøge ekspressionen af ​​SPARC i gastrisk cancer linjer og de kræftfremkaldende mekanismer.
Metoder Salg SPARC ekspression blev undersøgt i et panel af humane gastriske cancercellelinier . MGC803 og HGC 27 mavekræft cellelinjer, der udtrykker høj grad af SPARC blev kortvarigt transficeret med SPARC-specifikke små interfererende RNA og evalueres efterfølgende for virkninger på invasion og spredning.
Resultater
små interfererende RNA-medieret knockdown af SPARC i MGC803 og HGC 27 gastriske kræftceller faldet drastisk deres invasion. Knockdown af SPARC blev også observeret at øge den apoptose af MGC803 og HGC 27 gastriske kræftceller sammenlignet med kontrol transficeret gruppe.
Konklusioner
Vores data viser, at nedregulering af SPARC hæmmer invasion og væksten af ​​humane gastriske kræftceller. Således kunne målretning af SPARC være en effektiv terapeutisk tilgang mod mavekræft.
Introduktion
mavekræft er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan og er en af ​​de mest aggressive tumorer og ofte forbundet med lymfeknude metastase, peritoneal udbredelse, og hæmatogen metastaser [1]. I det hele 65-70% af nye tilfælde og dødsfald som følge af mavekræft forekommer i mindre udviklede lande [2]. I 2005 frekvensen af ​​mavekræft (0,3 millioner dødsfald og 0,4 millioner nye tilfælde) rangeret tredjedel blandt de mest almindelige kræftformer i Kina [3]. Aktuelle behandlinger af fremskreden eller metastatisk mavekræft har ringe effekt, kirurgisk fjernelse med resektion af tilstødende lymfeknuder tilbyder den eneste chance for helbredelse, hvilket er mindre end 33% af patienter med mavekræft. Det 5-års overlevelse er kun 30-40%, med en dårligere prognose for avancerede tumorer. Forståelse af de molekylære mekanismer bag udviklingen af ​​mavekræft kan give indsigt i nye terapeutiske mål
udskilt protein surt og rig på cystein (SPARC, også kendt som osteonectin eller BM-40). Tilhører matricellular familie af udskilte proteiner [4 ]. SPARC er et ikke-strukturelt element af ekstracellulære matricer, der modulerer celle-matrix-interaktioner, især under vævsudvikling, remodeling og reparere [5]. Mange cancertyper er karakteriseret ved opreguleret ekspression af SPARC [6]. Overekspression af SPARC er blevet dokumenteret i en række typer af faste tumorer, såsom bryst- [7], prostata [8], melanom [9] og glioblastomer [10]. I modsætning hertil har lavere niveauer af SPARC ekspression blevet fundet i andre typer af cancere, såsom ovariecancer [11], kolorektal [12], pancreascancer [13, 14] og akut myeloid leukæmi [15]. Disse observationer antyder, at tumorigen virkning SPARC er celletype specifik og kan være afhængig af tumor celle omgivende miljø.
Viden om SPARC funktioner i gastriske cancerceller er stadig sparsom. Overekspression af SPARC genet blev observeret i human gastrisk cancer i fem andre rapporter [16-20]. Men alle ovennævnte undersøgelser havde ingen detaljer i gastrisk cancer cellelinjer og kræftfremkaldende mekanisme. SPARC er blevet forbundet med aggressive stadier af mavekræft og er korreleret med dårlig prognose [16], hvilket tyder på, at reduktionen af ​​SPARC ekspression kan have terapeutiske fordele. Faktisk ekspression af antisense-oligonukleotider mod SPARC i melanomceller blokeret tumordannelse [21]. De præcise biologiske og molekylære mekanismer, hvorigennem en reduktion i SPARC udtryk kan bidrage til forbedret tumor terapi mangler at blive undersøgt. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at karakterisere SPARC funktioner i gastrisk kræftceller og udforske dens muligvis kræftfremkaldende mekanisme.
Materialer og metoder
Cell kultur
Humane mavekræft cellelinjer NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 blev opnået fra Cancer Institute of Chinese Academy of Medical Science. Alle celler blev dyrket i RMPI 1640 (GIBCO ™) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, penicillin G (100 enheder /ml) og streptomycin (100 ug /ml) betegnes komplet medium. Celler blev holdt i monolagskultur ved 37 ° C i befugtet luft med 5% CO 2. Salg Kemikalier og reagenser
EDTA-2 natrium, acridinorange, ethidiumbromid (EB) og 3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazoliumbromide (MTT) blev erhvervet fra Sigma (St Louis, MO, USA). Muse monoklonalt antistof specifikt til p-actin var fra Sigma. Kanin polyklonale antistoffer specifikke for Bcl-2 (sc-492), blev caspase-3 (sc-7148) og PARP (sc-7150) købt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Muse monoklonale antistoffer specifikke for SPARC (sc-74.295) og Bax (sc-7480) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology. Gede-anti-kanin (w3960) og anti-muse (w3950) sekundære antistoffer blev erhvervet fra Promega (Madison, WI, USA).
RNAi og transfektion
Humant SPARC siRNA og kontrol siRNA var fra Dharmacon Bioscience Corp (Chicago , IL, USA). Ækvimolære mængder af siRNA'er blev brugt som pr fabrikantens anvisninger med kontrol ikke-targeting siRNA (CTRL). 150 000 celler blev udpladet pr seks brønde i DMEM med 10% FBS og fik lov til at binde natten over. Ækvimolære mængder af siRNA'er blev inkuberet med transit-TKO transfektionsreagens fra Mirus (Madison, WI, USA) i henhold til fabrikantens anvisninger. Celler blev holdt i 48 timer før forsøg, medmindre andet er beskrevet
Western blot-analyse
Tyve mikrogram totale proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran. Membranen blev derefter inkuberet med antistoffer specifikke for SPARC (Santa Cruz; 1: 500), eller anti-β-actin (Sigma; 1: 1.000) natten over ved 4 ° C. Bundne antistoffer blev visualiseret under anvendelse forøget kemiluminescens. For at bekræfte lige belastning blev membraner strippet i 30 minutter ved 50 ° C i buffer indeholdende 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,7), og 100 mM 2-mercaptoethanol og genprobet med et anti-β-actin-antistof til at påvise lig loading . Densiteten af ​​båndene blev kvantificeret ved densitometrisk analyse under anvendelse af ImageTool (version 3.0) system.
RT-PCR
Totalt RNA (1-2 ug) blev revers transkriberet under anvendelse af en SuperScript præ-amplifikation (Invitrogen, Carlsbad , CA). Primere var baseret på sekvenser indberettet på Genebank (NM 003.118). SPARC sense sekvens var 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'og SPARC anti-sense sekvens 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3'. Den forventede produkt størrelse SPARC cDNA var 512bp. ß-actin sense-sekvens var 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'og ß-actin anti-sense sekvens 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. Den forventede produkt størrelse ß-actin cDNA var 514bp. PCR-amplifikation blev udført i 25 pi reaktionsrumfang indeholdende 0,2 uM dNTP'er, 20 pmol af hver oligonukleotidprimer, og 0.2U Tag-polymerase i PCR-buffer. cDNA blev amplificeret på en PCR termisk controller med en indledende denaturering ved 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af cykler ved 95 ° C i 1 min, 65 ° C i 1 min og 72 ° C i 1 min, 27 cyklusser, og et endeligt forlængelsestrin på 72 ° C i 10 min. Mængden af ​​udgangsmateriale cDNA blev justeret med β-actin intensitet.
Cellemigrationsassay
cellers evne til at vandre gennem filtrene, blev målt ved anvendelse af en BioCoat Matrigel invasion kammer (BD Biosciences, San Jose, CA). Celledyrkning indsætter med en 8 um porestørrelse PET membran blev anvendt i overensstemmelse med protokollen af ​​producenten. Bundkammeret indeholdt medium (0,75 ml) indeholdende 10% FCS, hvorimod SPARC siRNA transficeret eller kontrol-transficerede celler (1,0 x 10 5 suspenderet i 0,5 ml medium indeholdende 1% FCS) blev podet ind i det øvre kammer og inkuberet natten over ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO 2. Remaning celler på den øvre overflade blev mekanisk fjernet. Membraner blev derefter vasket, fikseret og farvet ved Diff-Quik (Medion Diagnostics). Antallet af celler, som migrerede til den nedre overflade af filtrene blev bestemt ved tælling farvede celler under et lysmikroskop i tre uafhængige felter (0,25 mm 2 /brønd).
Cellevækst og levedygtighed assay
virkning SPARC SiRNA på levedygtigheden af ​​celler blev bestemt ved MTT-assayet. Kort fortalt blev MGC803 og HGC 27 celler udpladet ved 1 x 10 4 celler per brønd i seksoghalvfems brønds mikrotiterplader. Efter inkubation i 72 timer blev cellelevedygtighed bestemt. Derefter 20 pi MTT (10 mg /ml i PBS lager, fortyndet til arbejde koncentration på 1 mg /ml med medier) sattes til hver brønd og inkuberet i 4 timer. Efter omhyggelig fjernelse af mediet, blev 200 pi dimethylsulfoxid tilsat til hver brønd og omrystet omhyggeligt. Absorbansen blev optaget på mikropladelæser (ELX 800; Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, USA) på en 570 nm bølgelængde. Virkningen af ​​SPARC siRNA på cellevækstinhibering blev vurderet som levedygtighed procent celle, hvor vehikelbehandlede celler blev sat til 100% levedygtige.
Cellecyklusanalyse og annexin V-farvning Hus Til flowcytometrisk cellecyklusanalyse, cellerne behandlet med siRNA blev opsamlet, vasket med PBS, fikseret i kold 70% ethanol og opbevaret ved -20 ° C indtil farvning. Efter fiksering blev cellerne vasket med PBS og inkuberet med 50 ug /mL RNaseA (Sigma) i 30 minutter ved 37 ° C, før farvning med 50 ug /mL propidiumiodid (Sigma). Apoptotiske celler i tidlige og sene stadier blev påvist ved hjælp af et annexin V-FITC Apoptose Detection Kit fra BioVision (Mountain View, CA, USA). Kort fortalt blev cellerne transficeret med siRNA. Ved 96 timer efter transfektion blev dyrkningsmedier og celler opsamlet og centrifugeret. Efter vask blev cellerne resuspenderet i 490 pi annexin V bindingsbuffer, efterfulgt af tilsætning af 5 pi annexin V-FITC og 5 pi propidiumiodid. Prøverne blev inkuberet i mørke i 5 minutter ved stuetemperatur og analyseret under anvendelse af flowcytometri. Salg Statistik Salg Resultater blev udtrykt som middel ekspressionsniveauer (± SD). Students t
-test eller rank sum test blev anvendt til statistisk analyse. En p-værdi < 0.05 blev taget som signifikansniveau (to-sidet).
Resultater
Ekspression af SPARC i dyrkede gastriske kræftceller
Vi først evalueret den endogene udtryk for SPARC i flere humane gastrisk cancer cellelinjer. Vi fandt, at SPARC protein og mRNA var fremherskende i MGC803 og HGC27 celler, blev produceret ved lavere niveauer ved SGC7901 cellelinie var undectable i NCI-N87 og BGC823 cellelinjer (figur 1). Figur 1 Ekspression af SPARC i gastriske cancercellelinier. A, Immunblotanalyse anvendelse af et kanin polyklonalt SPARC antistof (1: 500). B, Specifik revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR) analyse for SPARC. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. C, Relative SPARC mRNA ekspressionsniveauerne. Autoradiogrammer blev scannet og analyseret ved densitometri efterfulgt af kvantificering i forhold til p-actin. Resultaterne er vist som ekspression (i%) i forhold til p-actin og er middeltal (± SD) af 3 eksperimenter.
Inhibering af endogen SPARC ekspression
Efter denne indledende screening, MGC803 celler og HGC27 celler, der udtrykker relativt høj endogen SPARC blev fastsat knockdown udtrykker SPARC i en transient måde til at bestemme betydningen af ​​endogen SPARC ekspression. Som vist i figur 2A, blev SPARC ekspression inhiberes med SPARC siRNA transfektanter i proteinniveauer. Disse resultater antyder, at disse SPARC siRNA'er held udøve en lyddæmpende effekt for SPARC ekspression. Figur 2 Effekt af SPARC knockdown på celle migration i gastrisk cancer cellelinjer MGC 803 og HGC 27 celler. A. SPARC ekspression i MGC 803 og HGC 27, kontrol og SPARC siRNA transficerede celler blev påvist ved immunoblot-analyse under anvendelse af et kanin polyklonalt SPARC antistof (1: 500). p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. B. Virkninger af SPARC knockdown på celle migration i gastrisk cancer cellelinjer. SPARC ekspression blev slået ned i MGC 803 og HGC 27 celler ved anvendelse SPARC siRNA og underkastes en migration assay under anvendelse af en to kamre invasion Apparat som beskrevet i Materialer og metoder, histogram, der viser procent inhibering af MGC 803 og HGC 27 celleinvasion. Eksperimentet blev udført tre gange og den opnået fra scrambled siRNA transficerede celler værdi blev sat til 100%.
Nedregulering af SPARC ekspression inhiberes gastrisk invasion cancerceller in vitro
at bestemme om SPARC siRNA kunne reducere protumorigenic cellulære adfærd forbundet med SPARC udtryk, vi først bestemmes effekten af ​​nedsat SPARC ekspression på tumorceller invasion. Celleinvasion assay blev derefter udført under anvendelse af Transwell kamre. Vi målte kapacitet gastriske cancerceller til at invadere gennem matrigel, en kunstig ekstracellulær matrix, efter transfektion med en ikke-målrettet kontrol siRNA eller SPARC siRNA. Nedsat SPARC ekspression førte til inhibering af invasion med 69% og 79% i MGC803 og HGC27 henholdsvis (figur 2B, C). Tilsammen indikerer disse resultater tydeligt, at undertrykkelse af SPARC hæmmer migration og invasion evne MGC803 celler og HGC27 celler.
Nedregulering af SPARC udtryk hæmmer væksten af ​​mavekræft celler in vitro
Vi undersøgte, om SPARC siRNA kunne mindske overlevelse af gastriske cancerceller. MGC 803 og HGC 27 mavekræft celler transficeret med SPARC siRNA overlevede faldet satser i forhold til matchede celler transficeret med en ikke-targeting kontrol siRNA (figur 3A). Nedregulering af SPARC udtryk inducerede ikke cellecyklus arrest i gastriske kræftceller. Vi undersøgte effekten af ​​SPARC siRNA på cellecyklusprogression. Nedregulering af SPARC i MGC803 og HGC27 celler ændrede ikke G1 eller S-fase populationer ved 72 timer efter transfektion med SPARC siRNA i sammenligning med den negative kontrolgruppe (figur 3B). Figur 3 Virkninger af SPARC knockdown på cellevækst i gastrisk cancer cellelinjer. Den venstre halvdel data repræsenterer data fra MGC 803 celler og de rigtige repræsenterer data fra HGC 27 celler. blev bestemt A. Basal vækst efter 48 timer i komplet medium ved MTT-assayet. Resultaterne er vist som middelværdi vækst (i%) af det respektive MGC 803 og HGC 27 cellelinie og er middeltal (± SE) af firdobbelte bestemmelser fra seks særskilte forsøg. Celler fra siRNA og kontrolgrupper blev indsamlet til cytometri cellecyklusanalyse. B. Silencing af SPARC af siRNA transfektion ændrede ikke cellecyklusfordeling i MGC 803 og HGC 27 gastriske kræftceller. MGC 803 og HGC 27 celler blev transficeret med SPARC siRNA eller negativ kontrol siRNA. Ved 72 h efter transfektion blev DNA-indhold målt ved anvendelse af propidiumiodid (PI) farvning på flowcytometri.
Inhibering af SPARC ekspression øger apoptose i gastriske cancerceller
Vi undersøgte, om SPARC siRNA kunne inducere celledød i gastrisk cancer cellelinier. Behandlingen af ​​MGC803 og HGC27 celler med SPARC siRNA steg tidligt apoptotiske celler såvel som sene apoptotiske celler sammenlignet med negativ kontrol siRNA behandling (figur 4A) som målt ved Annexin V assay. Som forventet blev nedsat overlevelse af cellerne transficeret med SPARC siRNA forbundet med en større procentdel af apoptose med 91% i MGC803 og 92% i HGC27 celler (figur 4B). Disse resultater antyder, at SPARC er involveret i apoptose at opretholde cellulær overlevelse i nogle gastriske cancerceller. Figur 4 SPARC knockdown resultater i induktion af apoptose i gastriske cancercellelinier. Til flowcytometrisk analyse blev celler høstet 96 timer efter transfektion med SPARC siRNA eller negativ kontrol siRNA, derefter farvet med annexin V-FITC og propidiumiodid (PI). Den venstre halvdel data repræsenterer data fra MGC 803 celler og de rigtige repræsenterer data fra HGC 27 celler. Procentdelen af ​​annexin V /PI (tidlig apoptotisk) og annexin V /PI (sent apoptotiske) celler er vist i hvert panel. Værdier med fed skrift indikerer faldende SPARC udtryk øget apoptose med 65% i MGC803 og 92% i HGC27 sammenlignet med negativ kontrol siRNA.
Apoptotisk effekt af SPARC siRNA transficeret behandling i MGC 803 og HGC27 celler
I et forsøg på at belyse mekanisme SPARC siRNA apoptose i MGC 803 celler og HGC27 celler, ekspressionsniveauer af apoptotiske-regulering proteiner, såsom Bcl-2, Bax og caspase-3 og PARP blev evalueret. MGC 803 celler og HGC27 celler blev transficeret med SPARC siRNA. Som vist i figur 5, der var signifikante forskelle i udtryk for Bax og Bd-2 i MGC 803 celler og HGC27 celler i sammenligning med den negative kontrolgruppe (P < 0,05 og P < 0,01). Som reaktion på apoptotiske stimuli, er procaspase-3 spaltet i en kDa fragmentet 20, og den efterfølgende autokatalytisk reaktion fører til dannelsen af ​​den aktive kDa fragmentet 17. Når caspase-3 er aktiveret, PARP spaltes. Således spaltning af PARP anvendes som en indikator for apoptose. For at opnå direkte bevis viser forholdet mellem caspaseaktivering og apoptose blev procaspase-3 spaltning og PARP undersøgt i MGC 803 celler og HGC27 celler efter SPARC siRNA transficeret. Som vist i figur 5, SPARC SiRNA inducerede spaltning af 32 kDa procaspase-3 til dets aktive 17 kDa formen og spaltning af PARP optrådte i MGC 803 celler og HGC27 celler. Figur 5 Ekspressionen af ​​apoptose proteiner i MGC 803 og HGC27 celler efter transfektion med enten kontrol eller SPARC siRNA. Cellelysaterne blev adskilt på 10% SDS-PAGE-gel, overført til nitrocellulosemembran og probet med anti-PARP, anti-caspase-3, anti-Bcl-2 og anti-Bax. Proteinindhold blev normaliseret ved at probe den samme membran med anti-β-actin. . De venstre halvdels data repræsenterer data opnået fra MGC 803 celler og de rigtige repræsenterer data opnået fra HGC 27 celler
Diskussion
udskilt protein og rig på cystein, SPARC (også kendt som osteonectin eller kælder-membran-40 , BM-40), er et medlem af en familie af matricellular proteiner, hvis funktion er at modulere celle-matrix interaktioner og cellefunktion uden at deltage i den strukturelle stillads af den ekstracellulære matrix. Overekspression af SPARC er blevet dokumenteret i en række typer af faste tumorer, såsom bryst- [7], prostata [8], melanom [9] og glioblastomer [10]. I modsætning hertil har lavere niveauer af SPARC ekspression blevet fundet i andre typer af cancere, såsom ovariecancer [11], kolorektal [12], pancreascancer [13, 14] og akut myeloid leukæmi [15]. Disse observationer antyder, at tumorigen virkning SPARC er celletype specifik og kan være afhængig af tumor celle omgivende miljø.
Viden om SPARC funktioner i gastriske cancerceller er stadig sparsom. Nogle immunhistokemiske undersøgelser [16-20, 22] kollektivt rapporteret en opregulering af SPARC i mavekræft sammenlignet med nonneoplastic slimhinde. Wewer et al. [17] beskrevet en differentiel ekspression af SPARC i epitel og stroma rummene i seks mavekræft prøver. Maeng [18] fandt, at SPARC er stærkt udtrykt i reaktiv stroma forbundet med invasive differentierede adenokarcinomer og at det kan tjene som en nyttig klinisk diagnostisk markør for mavekræft. Wang et al. [16] også fundet et differentielt udtrykt SPARC i mavecancerpatienter som vurderet ved gen array analyse, kvantitativ RT-PCR, og immunfarvning, højere SPARC ekspression blev signifikant associeret med tumorudvikling og fremskredne stadier af mavecancer. Franke et al. [20] demonstreret på en større patient serie, SPARC differentielt udtrykkes i gastrisk kræft, og at dens udtryk korrelerer med tumor progression og nodal spredning ved hjælp væv microarrays (TMA'er), Niveauet af ekspressionen af ​​SPARC, bestemt ved immunhistokemi, korreleret i tarm-typen mavekræft med den lokale tumorvækst, nodal spredning, og tumor stadie i henhold til International Union Against cancer. Zhao ZS et al. [19] fandt, at SPARC blev påvist i 334 af 436 humane tilfælde mavekræft og var stærkt udtrykt i 239 tumorer. I fase I, II og III, 5-års overlevelse på patienter med en høj ekspression af SPARC var signifikant lavere end hos patienter med lavt udtryk. Yderligere multivariat analyse foreslog, at opregulering af SPARC, MMP-2, og integrin beta1, var uafhængige prognostiske indikatorer for sygdommen.
Vi har indsamlet 49 mavekræft væv og tilsvarende normale væv gennem kirurgiske procedurer (Jie Yin, Guowei Chen, Si Liu, Jianxun Zhao, Yucun Liu: Ekspression af SPARC i human mavekræft er forbundet med de kliniske-patologiske træk, indsendt). Fordelingen og udtryk for SPARC blev observeret ved immunhistokemi, Western Blotting og RT-PCR, hhv. SPARC-protein og mRNA udtrykkes signifikant højere i gastrisk cancer væv sammenlignet med normalt væv. De grader af sit udtryk var forbundet med differentiering af tumor, TNM division, peritoneal såning og vaskulær invasion bemærkelsesværdigt. Patienter med høj ekspression af SPARC har dårligere prognose end dem med lav udtryk for SPARC.
Tilsammen højere SPARC ekspression blev signifikant associeret med tumor progression og fremskredne stadier af mavekræft. Nyere forskning af Inoue M et al [23], selv identifed SPARC som kandidat target antigen til immunterapi af forskellige kræftformer, herunder gastrisk kræft ved genom-dækkende cDNA microarray. Det er spændende, at terapi rettet mod SPARC underenheden kan være en nyttig metode til at undertrykke gastrisk kræft vækst. Imidlertid er de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for onkogenese af SPARC i mavekræft ikke helt forstået. Gennem ekspression analyse af et panel af gastrisk cancer cellelinjer, viste vi, at SPARC også overudtrykkes i Sevel humane gastriske cancercellelinier. Derfor testede vi vores hypoteser, SPARC kan være et centralt molekyle i gastrisk invasion kræft, og at målrette SPARC kan præsentere en ny terapeutisk strategi for anti-invasion af mavekræft.
Udbredelse af kræftceller, enten lokalt eller på fjernt metastatisk sites, kræver, at maligne celler erhverve evnen til at invadere basalmembranen og at holde sig til andre matricer. Det er blevet foreslået, at SPARC kan spille en central rolle under de indledende trin i processen med tumorinvasion og metastase [24]. Desuden kan SPARC inducere ekspressionen af ​​metalloproteinaser eller enzymer, der efterfølgende spiller en vigtig rolle i nedbrydningen af ​​basalmembraner og ekstracellulære matrixkomponenter [25]. SPARC var forbundet med invasivitet af meningiomas [26, 27] og gliomer [28]. Endvidere suppression af SPARC ekspression anvendelse af antisense-RNA inhiberede motilitet og invasion af humane brystcancerceller in vitro [21].
At bestemme om SPARC siRNA kunne reducere protumorigenic cellulære adfærd forbundet med SPARC ekspression, vi først bestemmes virkningen af ​​nedsat SPARC ekspression på tumorcelleinvasion. Vi målte kapacitet gastriske cancerceller til at invadere gennem matrigel, en kunstig ekstracellulær matrix, efter transfektion med SPARC siRNA eller en ikke-målrettet kontrol siRNA. Nedsat SPARC ekspression førte til inhibering af invasion med 69% og 79% i MGC803 og HGC27 hhv. Således kan SPARC siRNA falde mavekræft invasion in vitro.
En nylig undersøgelse viste, at SPARC beskytter celler fra stress-induceret apoptose in vitro gennem et samspil med integrin p1 heterodimerer der forbedrer ILK aktivering og prosurvival aktivitet [28]. Indledende undersøgelser under anvendelse af antisense-RNA strategier ophævet fuldstændigt humant melanom vækst i nøgne mus [21]. Horie et al. [29] viste, at nedregulering af SPARC udtryk induceret væksthæmning med G 1 anholdelse i humane melanom celler. Det er blevet rapporteret, at SPARC fremmer gliom celleoverlevelse gennem Akt aktivering via integrin signalering under serumfrie betingelser [30]. Disse rapporter tyder på, at SPARC spiller en rolle som antistress faktor.
På den anden side, nogle artikler fundet, at SPARC kan fremme apoptose i kræftceller. Yiu og kolleger [11] viste, at eksogen behandling af forskellige æggestokkene cancercellelinier med SPARC induceret apoptose. Said og Motamed [31] fundet SPARC eksponering øget kløvet caspase 3 i humane ovariecancer celler, som støttede den tidligere observation. Pancreas [13] og ovariecancer [30] udviste større vækst og reduceret apoptose når implanteret i SPARC - /-. I kolorektale cancer cellelinjer, overekspression af SPARC reducerede cellernes levedygtighed og øget apoptose i celler udsat for forskellige kemoterapeutiske stoffer [32].
Disse tilsyneladende paradoksale observationer inden for hver type kræft og på tværs af forskellige kræftformer kan forklares med Tai forståelse af SPARC biologi [33]: mindre peptidfragmenter af SPARC repræsenterer de forskellige domæner af SPARC giver biologiske aktiviteter som til tider er imod de andre fragmenter eller den native SPARC protein. Da protease profil tumormikromiljøet kan variere i forskellige kræfttyper, og som SPARC vides at undergå proteolyse af matrixmetalloproteinaser [34], disse forskelle i kombination med ændringer i den lokale sammensætning af matrixmolekyler og cytokiner, kan alle være at bidrage til den komplekse adfærd SPARC i forskellige typer af kræft.
for at belyse effekten af ​​SPARC siRNA på gastrisk vækst kræftcelle, blev MTT proliferation assay udført for at sammenligne spredningen mellem SPARC siRNA transficeret og kontrol transficeret MGC803 og HGC 27 celler. MGC803 og HGC27 mavekræft celler transficeret med SPARC siRNA overlevede faldet satser i forhold til matchede celler transficeret med en ikke-targeting kontrol siRNA (figur 3). Den nedsatte cellernes overlevelse transficeret med SPARC siRNA var forbundet med forøgede apoptose som målt ved Annexin V assay. Faldende SPARC ekspression øget apoptose med 91% i MGC803 og 92% i HGC27 (figur 4B).
Aktive caspaser spiller en vigtig rolle i induktionen af ​​apoptose. Når caspase-3 blev aktiveret, PARP spaltes sent. Sædvanligvis spaltningen af ​​PARP blev anvendt som en indikator for apoptose. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi SPARC siRNA aktiveret caspase-3 til frembringelse af spaltede caspase-3 (p17) fragmenter i MGC 803 celler og HGC 27 ved 48 h. Samtidig blev spaltningen af ​​PARP også detekteret. Resultaterne indikerer, at SPARC induceret fragmentering af PARP samt øget caspase-3-aktivitet i MGC 803 celler.
Bcl-2-familien proteiner er blevet rapporteret at regulere apoptose ved styring af mitochondriemembranpermeabilitet. SPARC opreguleret ekspression af Bax og nedreguleres ekspressionen af ​​Bcl-2 i MGC 803 celler og HGC 27 celler. Vi fandt, at SPARC siRNA kunne inducere gastrisk cancercellelinie apoptose og samtidig reducere forholdet mellem Bcl-2 til Bax. Derfor kan reguleringen af ​​Bcl-2 og Bax udtryk være en central mekanisme bag SPARC induktion af apoptose i gastriske kræftceller.
Så vores data viste, at nedregulering af SPARC hæmmede celledeling af gastriske cancerceller ved apoptose indvielse, hvilket samvittighed med melanom og gliom, men i modsætning til i æggestokkene og kræft i bugspytkirtlen. Induktionen af ​​apoptose var delvist reguleret til mitokondriel vejen, såsom aktivering caspase pathway samt spaltning af PARP. Fremtidig undersøgelse skal fokusere på den nøjagtige mekanisme.
Afslutningsvis vores nuværende data foreslog, at SPARC spillet en vigtig rolle i apoptose og metastase af mavekræft. På nuværende tidspunkt er der ingen effektive metoder til hærdning sent stadium mavekræft. Som forhøjet SPARC udtryk er forbundet med nedsat gastrisk kræftpatient overlevelse [16], mener vi, at vores resultater, hvilket viser nedsat invasion og øget celledød med siRNA rettet mod SPARC, tyder på, at faldende SPARC udtryk kan have terapeutisk fordel for gastrisk kræftpatienter.
erklæringer
Tak
Dette arbejde blev støttet af National Scientific Technologic støtte Fund Project [30901417]. Vi takker professor Yang Ke og Xiaojuan Du af Peking University Health Science Centre, Beijing, Kina, til teknisk support.
Forfatternes oprindelige indsendt filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 13046_2010_306_MOESM1_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 1 13046_2010_306_MOESM2_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 2 13046_2010_306_MOESM3_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 3 13046_2010_306_MOESM4_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 4 13046_2010_306_MOESM5_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 5 konkurrerende interesser
forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

• Metallothionein 2A hæmmer NF-KB-aktivering og forudsiger kliniske resultat adskilt med TNM stadie i mavecancerpatienter efter radikal resection
• Deep sekventering af gastrisk karcinom afslører somatiske mutationer er relevante for personlig medicine