Regulación a la baja de la expresión de SPARC disminuye el cáncer gástrico celular invasión y survival

regulación a la baja de la expresión de SPARC disminuye la invasión celular y la supervivencia cáncer gástrico
Resumen Antecedentes

proteína secretada ácida y rica en cisteína (SPARC) desempeña un papel clave en el desarrollo de muchos tejidos y tipos de órganos. expresión aberrante SPARC se encuentra en una amplia variedad de cánceres humanos, contribuye al desarrollo de tumores. Debido a que SPARC se encontró que se sobreexpresa en el tejido de cáncer gástrico humano, por lo tanto, para explorar la expresión de SPARC en líneas de cáncer gástrico y los mecanismos cancerígenos.
Métodos
expresión SPARC se evaluó en un panel de líneas celulares de cáncer gástrico humanos . líneas celulares de cáncer gástrico y MGC803 HGC 27 que expresan alto nivel de SPARC se transfectaron transitoriamente con pequeños RNAs de interferencia-SPARC específica y posteriormente evaluados para efectos sobre la invasión y proliferación.
Resultados
interferente pequeño knockdown RNA mediada de SPARC en MGC803 y HGC 27 células de cáncer gástrico se redujeron drásticamente su invasión. También se observó Desmontables de SPARC para aumentar significativamente la apoptosis de 27 células de cáncer gástrico y MGC803 HGC en comparación con el grupo transfectadas control.
Conclusiones
Nuestros datos muestran que la regulación negativa de SPARC inhibe la invasión y el crecimiento de células de cáncer gástrico humano. Por lo tanto, la orientación de SPARC podría ser un enfoque terapéutico eficaz contra el cáncer gástrico.
Introducción
El cáncer gástrico es la segunda causa de muerte por cáncer en todo el mundo y es uno de los tumores más agresivos y se asocia con frecuencia con los ganglios linfáticos metástasis, diseminación peritoneal, y la metástasis hematógena [1]. En general, el 65-70% de los nuevos casos y muertes por cáncer gástrico se produce en los países menos desarrollados [2]. En 2005, las tasas de incidencia de cáncer gástrico (0,3 millones de muertes y 0,4 millones de nuevos casos) ocupó el tercer lugar entre los cánceres más comunes en China [3]. Las terapias actuales para el cáncer en estadio avanzado o metastásico gástrica tienen poco efecto, la extirpación quirúrgica con resección de los ganglios linfáticos adyacentes ofrece la única posibilidad de curación, que es menos del 33% de los pacientes con cáncer gástrico. La tasa de supervivencia a 5 años es sólo del 30-40%, con un peor pronóstico para los tumores avanzados. La comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión del cáncer gástrico puede proporcionar conocimientos sobre nuevas dianas terapéuticas
proteína secretada ácida y rica en cisteína (SPARC, también conocida como osteonectina o BM-40). Pertenece a la familia de proteínas secretadas matricellular [4 ]. SPARC es un componente estructural de las matrices extracelulares que modula las interacciones célula-matriz, en particular durante el desarrollo de tejidos, la remodelación y reparación [5]. Muchos tipos de cánceres se caracterizan por la expresión regulada por incremento de SPARC [6]. La sobreexpresión de SPARC se ha documentado en varios tipos de tumores sólidos, como el de mama [7], de próstata [8], melanoma [9] y glioblastomas [10]. En contraste, los niveles más bajos de expresión de SPARC se han encontrado en otros tipos de cánceres, tales como de ovario [11], de colon [12], de páncreas [13, 14] y la leucemia mielógena aguda [15]. Estas observaciones sugieren que el efecto cancerigeno de SPARC es tipo específico de célula y puede ser dependiente de la célula tumoral medio ambiente circundante. Francia El conocimiento acerca de las funciones de SPARC en células de cáncer gástrico sigue siendo escasa. Se observó la sobreexpresión del gen SPARC en el cáncer gástrico humano en otras cinco informes [16-20]. Sin embargo, todos los estudios mencionados anteriormente no tenían detalle en líneas celulares de cáncer gástrico y el mecanismo carcinogénico. SPARC se ha asociado con etapas agresivas de cáncer gástrico y se correlaciona con mal pronóstico [16], lo que sugiere que la reducción de la expresión de SPARC puede tener un beneficio terapéutico. De hecho, la expresión de oligonucleótidos antisentido contra SPARC en células de melanoma bloqueado la formación de tumores [21]. Los mecanismos biológicos y moleculares precisos a través del cual una reducción en la expresión de SPARC podría contribuir a la terapia de tumores mejorada aún no se han investigado. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue caracterizar las funciones de SPARC en células de cáncer gástrico y explorar su mecanismo posiblemente cancerígenos.
Materiales y métodos
Cell Cultura y líneas celulares de cáncer gástrico humano NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 se obtuvieron del Instituto del cáncer de la Academia china de Ciencias Médicas. Todas las células se cultivaron en RPMI 1640 (GIBCO ™) el medio suplementado con 10% de suero bovino fetal, penicilina G (100 unidades /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) denominado medio completo. Las células se mantuvieron en cultivo monocapa a 37 ° C en aire humidificado con 5% de CO 2.
Productos químicos y reactivos
EDTA-2 sodio, naranja de acridina, bromuro de etidio (EB) y 3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazoliumbromide (MTT) fueron adquiridos de Sigma (St Louis, MO, EE.UU.). anticuerpo monoclonal de ratón específico para ß-actina fue de Sigma. Los anticuerpos policlonales de conejo específico a Bcl-2 (SC-492), caspasa-3 (sc-7148) y PARP (sc-7150) se compraron desde Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). anticuerpos monoclonales de ratón específicos para SPARC (sc-74295) y Bax (sc-7480) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology. De cabra anti-conejo (w3960) y anti-ratón (w3950) anticuerpos secundarios se adquirieron de Promega (Madison, WI, EE.UU.).
ARNi y transfección
humano SPARC siRNA y siRNA control fueron de Dharmacon Bioscience Corp (Chicago , IL, EE.UU.). cantidades equimolares de siRNAs se utilizaron según las instrucciones del fabricante con el control no director siRNA (CTRL). 150 000 células se sembraron por seis pocillos en DMEM con 10% de FBS y se dejó que se unieran durante la noche. cantidades equimolares de siRNAs fueron incubadas con el tránsito TKO reactivo de transfección de Mirus (Madison, WI, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las células se mantuvieron durante 48 h antes de los experimentos, a menos que se describa lo contrario
análisis de transferencia de Western
Veinte microgramos de proteínas totales se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. A continuación, la membrana se incubó con anticuerpos específicos para SPARC (Santa Cruz; 1: 500), o anti-β-actina (Sigma; 1: 1000) durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos unidos se visualizaron mediante quimioluminiscencia aumentada. Para confirmar la igual carga, las membranas fueron despojados durante 30 minutos a 50 ° C en tampón que contenía SDS al 2%, Tris 62,5 mM (pH 6,7), y 100 mM 2-mercaptoetanol y se volvieron a sondar con un anticuerpo anti-β-actina para demostrar una carga igual . La densidad de las bandas se cuantificó por análisis densitométrico utilizando el sistema de ImageTool (versión 3.0).
RT-PCR
RNA total (1-2 g) se sometió a transcripción inversa utilizando un kit de pre-amplificación superíndice (Invitrogen, Carlsbad , CA). Los cebadores se basan en secuencias reportadas en los bancos de germoplasma (NM 003118). secuencia sentido SPARC era 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'y SPARC secuencia anti-sentido 5' GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3 '. El tamaño del producto esperado de SPARC ADNc fue 512bp. ß-actina secuencia con sentido era 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'y ß-actina secuencia antisentido 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. El tamaño del producto esperado de ADNc de beta-actina fue 514bp. la amplificación PCR se realizó en 25 volúmenes de reacción mu l que contiene 0,2 mM dNTPs, 20 pmol de cada cebador oligonucleótido, y 0.2U Tag polimerasa en tampón de PCR. cDNA se amplificó en un controlador térmico de PCR con una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 5 min, seguido por ciclos de 95 ° C durante 1 min, 65 ° C durante 1 min, y 72 ° C durante 1 min, 27 ciclos, y un paso de extensión final de 72 ° C durante 10 min. La cantidad de a partir de ADNc se ajustó utilizando la intensidad de β-actina.
Ensayo de migración celular
La capacidad de las células para migrar a través de filtros se midió usando una cámara de invasión BioCoat Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Cultivo de células inserta con una membrana de PET de tamaño de poro 8 micras se utilizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. La cámara inferior incluye medio (0,75 ml) que contiene 10% de FCS, mientras que SPARC siRNA transfectadas o células de control transfectadas (1,0 × 10 5 en suspensión en 0,5 ml de medio que contiene 1% de FCS) se sembraron en la cámara superior y se incubaron durante la noche a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2. células remaning en la superficie superior se eliminaron mecánicamente. a continuación, las membranas se lavaron, se fijaron y se tiñeron con Diff-Quik (Medion Diagnostics). El número de células que migraron a la superficie inferior de los filtros se determinó contando las células teñidas con un microscopio óptico en tres campos independientes (0,25 mm 2 /pocillo). El crecimiento celular y la viabilidad de ensayo
la efecto de SPARC SiRNA sobre la viabilidad de las células se determinó por el ensayo MTT. Brevemente, las células 27 y MGC803 HGC se sembraron a 1 x 10 4 células por pocillo en placas de microtitulación de noventa y seis pocillos. Después de la incubación durante 72 h, se determinó la viabilidad celular. A continuación, 20 l de MTT (10 mg /ml en PBS de stock, se diluyó a la concentración de 1 mg /ml con los medios de trabajo) se añadió a cada pocillo y se incubaron durante 4 h. Después de la retirada cuidadosa del medio, se añadieron 200 l de sulfóxido de dimetilo a cada pocillo y se agitó cuidadosamente. La absorbancia se registró en el lector de microplaca (Elx 800; Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, EE.UU.) a una longitud de onda 570 nm. El efecto de SPARC siRNA en la inhibición del crecimiento celular se evaluó como porcentaje de viabilidad celular, donde se tomaron las células tratadas con vehículo como 100% viable.
Análisis del ciclo celular y la anexina V tinción
Para el análisis del ciclo celular por citometría de flujo, las células tratadas con siRNA se recogieron, se lavaron con PBS, se fijaron en etanol frío al 70%, y se almacenó a -20 ° C hasta su tinción. Después de la fijación, las células se lavaron con PBS y se incubaron con 50 mg /mL ARNasa (Sigma) durante 30 min a 37 ° C, antes de la tinción con 50 g /mL yoduro de propidio (Sigma). Se detectaron células apoptóticas en etapas tempranas y tardías utilizando un V-FITC Kit de Detección de Apoptosis anexina Biovision (Mountain View, CA, EE.UU.). En resumen, las células fueron transfectadas con siRNA. En 96 h después de la transfección, se recogieron y se centrifugaron los medios de cultivo y las células. Después del lavado, las células se resuspendieron en tampón de unión 490 l de anexina V, seguido de la adición de 5 l de anexina V-FITC y 5 l de yoduro de propidio. Las muestras se incubaron en la oscuridad durante 5 minutos a temperatura ambiente y se analizaron mediante citometría de flujo. Estadísticas
Los resultados se expresaron como media los niveles de expresión (± DE). t de Student
-test o prueba de suma de rangos se utilizaron para el análisis estadístico. Un valor de p < 0,05 se tomó como nivel de significación (a dos caras).
Resultados
expresión de SPARC en las células cultivadas de cáncer gástrico
primer lugar, evaluó la expresión endógena de SPARC en varias líneas celulares de cáncer gástrico humano. Se encontró que la proteína SPARC y ARNm eran frecuentes en las células MGC803 y HGC27, se produce a niveles más bajos de línea celular SGC7901 eran indetectables en líneas celulares BGC823 (Figura 1) NCI-N87 y. Figura 1 La expresión de SPARC en líneas celulares de cáncer gástrico. A, análisis por inmunotransferencia usando un anticuerpo policlonal de conejo SPARC (1: 500). B, reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa específica (RT-PCR) para SPARC. ß-actina se utilizó como control de carga. C, los niveles de expresión de ARNm de SPARC. Las autorradiografías se escanearon y se analizaron por densitometría seguido por la cuantificación relativa de ß-actina. Los resultados se muestran como la expresión (en%) en relación con ß-actina y son medios (± SD) de 3 experimentos.
Inhibición de la expresión endógena SPARC
Después de esta selección inicial, MGC803 células y las células que expresan HGC27 relativamente alta endógeno SPARC se establecieron knockdown expresar SPARC de manera transitoria para determinar la importancia de la expresión SPARC endógeno. Como se muestra en la Figura 2A, la expresión de SPARC se inhibió con transfectantes SPARC siRNA en los niveles de proteína. Estos resultados sugieren que estos SPARC siRNAs ejercer con éxito un efecto de silenciamiento de la expresión de SPARC. Figura 2 Efecto de SPARC caída en la migración celular en líneas celulares de cáncer gástrico MGC 803 y HGC 27 células. expresión A. SPARC en MGC 803 y HGC 27, el control y las células transfectadas SPARC siRNA se detectó mediante análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo policlonal de conejo SPARC (1: 500). ß-actina se utilizó como control de carga. B. Efectos de SPARC caída en la migración celular en líneas celulares de cáncer gástrico. SPARC expresión fue derribado en el MGC 803 y HGC 27 células usando SPARC siRNA y se sometió a un ensayo de migración usando un aparato de invasión de dos cámaras como se describe en Materiales y Métodos, histograma que muestra el porcentaje de inhibición del MGC 803 y HGC 27 invasión celular. El experimento se realizó por triplicado y el valor obtenido a partir de células transfectadas siRNA revueltos se estableció como 100%.
Regulación a la baja de la expresión de SPARC inhibida gástrico células de cáncer de invasión in vitro
Para determinar si SPARC siRNA podría reducir comportamientos celulares asociados con protumorigénicas la expresión de SPARC, primero se determinó el efecto de la disminución de la expresión de SPARC en la invasión de células tumorales. ensayo de invasión de células fueron entonces realizó utilizando cámaras Transwell. Se midió la capacidad de las células de cáncer gástrico para invadir a través de Matrigel, una matriz extracelular artificial, después de la transfección con un control de siRNA no director o SPARC siRNA. Disminución de la expresión SPARC dado lugar a la inhibición de la invasión por 69% y 79% en MGC803 y HGC27, respectivamente (Figura 2B, C). En conjunto, estos resultados indican claramente que la supresión de SPARC inhibe la capacidad de migración y la invasión de células y MGC803 HGC27 células.
Regulación a la baja de la expresión de SPARC inhibe el crecimiento de células de cáncer gástrico in vitro
Hemos investigado si SPARC siRNA podría disminuir la la supervivencia de células de cáncer gástrico. MGC 803 y HGC 27 células de cáncer gástrico transfectadas con siRNA SPARC sobrevivieron a la disminución de las tasas relativas a las células coincidentes transfectadas con un control no dirigido siRNA (Figura 3A). Regulación a la baja de la expresión de SPARC no indujo la detención del ciclo celular en células de cáncer gástrico. Se examinaron los efectos de SPARC siRNA sobre la progresión del ciclo celular. El silenciamiento de SPARC en MGC803 y HGC27 células no cambió poblaciones fase G1 o S a las 72 h después de la transfección con ARNip SPARC en comparación con el grupo control negativo (Figura 3B). Figura 3 Efectos de SPARC caída sobre el crecimiento celular en líneas celulares de cáncer gástrico. los datos mitad izquierda representan los datos obtenidos de MGC 803 células y las correctas representan datos obtenidos a partir de HGC 27 células. A. crecimiento basal se determinó después de 48 h en medio completo por el ensayo MTT. Los resultados se muestran como la media de crecimiento (en%) de la línea de células MGC 803 y HGC 27 respectivo y son medias (± SE) de las determinaciones por cuadruplicado de seis experimentos separados. Las células de los grupos de control de siRNA y se recogieron para el análisis del ciclo celular citometría. B. El silenciamiento de SPARC de siRNA transfección no cambió la distribución del ciclo celular en MGC 803 y HGC 27 células de cáncer gástrico. MGC 803 y HGC 27 células fueron transfectadas con siRNA SPARC o control negativo siRNA. En 72 h después de la transfección, el contenido de ADN se midió usando tinción de yoduro de propidio (PI) en citometría de flujo.
Inhibición de la expresión SPARC potencia la apoptosis en células de cáncer gástrico
investigamos si SPARC siRNA podría inducir la muerte celular en el cáncer gástrico líneas celulares. El tratamiento de las células MGC803 y HGC27 con SPARC siRNA aumentó células temprana de apoptosis, así como células apoptóticas tardías, en comparación con el control negativo tratamiento siRNA (Figura 4A), medida por el ensayo de Anexina V. Como era de esperar, la disminución de la supervivencia de las células transfectadas con siRNA SPARC se asoció con una mayor tasa de apoptosis en un 91% en MGC803 y el 92% en HGC27 células (Figura 4B). Estos hallazgos sugieren que SPARC está implicado en la apoptosis de mantener la supervivencia celular en algunas células de cáncer gástrico. Figura 4 SPARC resultados caída en la inducción de la apoptosis en líneas celulares de cáncer gástrico. Para el análisis de citometría de flujo, las células se cosecharon 96 h después de la transfección con siRNA SPARC o control negativo siRNA, luego teñidas con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI). los datos mitad izquierda representan los datos obtenidos de MGC 803 células y las correctas representan datos obtenidos a partir de HGC 27 células. Los porcentajes de anexina V /PI (a principios de apoptosis) y la anexina V /PI células (apoptosis tardía) se muestra en cada panel. Los valores en negrita indican la disminución de la expresión de SPARC aumento de la apoptosis en un 65% en MGC803 y 92% en HGC27 comparación con el control negativo siRNA.
Apoptótica efecto de SPARC siRNA tratamiento transfectadas en MGC 803 y las células HGC27
En un esfuerzo por dilucidar el se evaluaron mecanismo de la apoptosis inducida SPARC siRNA en MGC 803 células y HGC27 células, los niveles de expresión de las proteínas de apoptosis de regulación, tales como Bcl-2, Bax y la caspasa-3 y PARP. MGC 803 células y las células fueron transfectadas con HGC27 SPARC siRNA. Como se muestra en la Figura 5, hubo diferencias significativas en la expresión de Bax y Bcl-2 en células MGC 803 y células HGC27 en comparación con el grupo control negativo (P < 0,05 y P < 0,01). En respuesta a los estímulos apoptóticos, procaspasa-3 se escinde en un fragmento de 20 kDa, y la reacción autocatalítica subsiguiente conduce a la formación del fragmento activo 17 kDa. Cuando se activa la caspasa-3, PARP es escindido. Por lo tanto la escisión de PARP se utiliza como un indicador de la apoptosis. Con el fin de obtener pruebas directas que muestra la relación de la activación de caspasas y apoptosis, la procaspasa-3 escisión y PARP se examinaron en MGC 803 células y células HGC27 después de SPARC siRNA transfectadas. Como se muestra en la Figura 5, SPARC SiRNA induce la escisión de 32 kDa procaspasa-3 en su forma activa 17 kDa y la escisión de PARP apareció en MGC 803 células y HGC27 células. Figura 5 La expresión de proteínas de apoptosis en MGC 803 y células HGC27 después de la transfección con el control o SPARC siRNA. Los lisados ​​celulares se separaron en 10% de gel de SDS-PAGE, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y se sondaron con anti-PARP, anti-caspasa-3, anti-Bcl-2, y anti-Bax. Los contenidos de proteína se normalizaron mediante el sondeo de la misma membrana con anti-β-actina. . Los datos mitad izquierda representan los datos obtenidos de MGC 803 células y las correctas representan datos obtenidos a partir de HGC 27 células
Discusión
proteína secretada y rica en cisteína, SPARC (también conocido como osteonectina, o sótano-membrana-40 , BM-40), es un miembro de una familia de proteínas matricellular, cuya función es la de modular las interacciones célula-matriz y función de las células sin participar en el andamiaje estructural de la matriz extracelular. La sobreexpresión de SPARC se ha documentado en varios tipos de tumores sólidos, como el de mama [7], de próstata [8], melanoma [9] y glioblastomas [10]. En contraste, los niveles más bajos de expresión de SPARC se han encontrado en otros tipos de cánceres, tales como de ovario [11], de colon [12], de páncreas [13, 14] y la leucemia mielógena aguda [15]. Estas observaciones sugieren que el efecto cancerigeno de SPARC es tipo específico de célula y puede ser dependiente de la célula tumoral medio ambiente circundante. Francia El conocimiento acerca de las funciones de SPARC en células de cáncer gástrico sigue siendo escasa. Algunos estudios inmunohistoquímicos [16-20, 22] reportaron colectivamente una sobre regulación de SPARC en el cáncer gástrico en comparación con la mucosa no neoplásica. Wewer et al. [17] describe una expresión diferencial de SPARC en los compartimentos epiteliales y del estroma de seis especímenes de cáncer gástrico. Maeng [18] encontró que SPARC se expresa altamente en el estroma reactiva asociada con adenocarcinomas diferenciadas invasoras y que puede servir como un marcador de diagnóstico clínico útil para el cáncer de estómago. Wang et al. [16] también encontró una expresados ​​diferencialmente SPARC en pacientes con cáncer gástrico como se evaluó mediante el análisis conjunto de genes, RT-PCR cuantitativa, y la inmunotinción, mayor expresión de SPARC se asoció significativamente con la progresión tumoral y las etapas avanzadas de cáncer gástrico. Franke et al. [20] demostró en una serie de pacientes más grande que SPARC se expresa diferencialmente en el cáncer gástrico y que su expresión se correlaciona con la progresión tumoral y la diseminación nodal utilizando microarrays de tejidos (TMA), el nivel de expresión de SPARC, determinada por inmunohistoquímica, correlacionada en el cáncer gástrico de tipo intestinal con el crecimiento local del tumor, diseminación ganglionar, y el estadio tumoral de acuerdo con la Unión Internacional contra el cáncer. . Zhao ZS et al [19] encontró que SPARC se detectó en 334 de 436 casos de cáncer gástrico humano y fue altamente expresado en 239 tumores. En los estadios I, II, y III, la tasa de supervivencia a 5 años de los pacientes con una alta expresión de SPARC era significativamente inferiores a los de los pacientes con baja expresión. Un análisis más detallado multivariado sugirió que la regulación positiva de SPARC, MMP-2, y la integrina beta 1, eran indicadores pronósticos independientes para la enfermedad.
Hemos recogido 49 tejidos de cáncer gástrico y los tejidos normales correspondientes a través de procedimientos quirúrgicos (Jie Yin, Guowei Chen, Si Liu, Jianxun Zhao, Liu Yucun: la expresión de SPARC en el cáncer gástrico humano se asocia con las características clínico-patológicas, presentado). La distribución y la expresión de SPARC se observaron por inmunohistoquímica, transferencia Western y RT-PCR, respectivamente. proteína SPARC y mRNA expresaron significativamente mayor en tejidos de cáncer gástrico en comparación con los tejidos normales. Los grados de su expresión se asociaron con la diferenciación del tumor, la división de TNM, siembra peritoneal y la invasión vascular notablemente. Los pacientes con alta expresión de SPARC tienen peor pronóstico que aquellos con baja expresión de SPARC.
Tomados en conjunto, mayor expresión de SPARC se asoció significativamente con la progresión tumoral y estadios avanzados de cáncer gástrico. La reciente investigación de Inoue M et al [23], incluso identificó a SPARC como un antígeno diana candidato para la inmunoterapia de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer gástrico mediante microarrays de cDNA de todo el genoma. Es interesante que la terapia de la orientación de la subunidad SPARC puede ser un enfoque útil para suprimir el crecimiento del cáncer gástrico. Sin embargo, los mecanismos moleculares responsables de la oncogénesis de SPARC en el cáncer gástrico no se entiende por completo. A través de análisis de la expresión de un panel de líneas celulares de cáncer gástrico, demostramos que SPARC también se sobreexpresa en líneas celulares de cáncer gástrico humano Sevel. Por lo tanto, hemos probado nuestra hipótesis de que SPARC puede ser una molécula clave en la invasión del cáncer gástrico, y que la orientación SPARC puede presentar una nueva estrategia terapéutica para la lucha contra la invasión de cáncer gástrico.
Diseminación de las células cancerosas, ya sea localmente o en metástasis a distancia sitios, requiere que las células malignas adquieren la capacidad de invadir la membrana basal y de adherirse a otras matrices. Se ha sugerido que SPARC puede jugar un papel clave durante los pasos iniciales en el proceso de invasión tumoral y metástasis [24]. Además, SPARC puede inducir la expresión de metaloproteinasas o enzimas que posteriormente jugar un papel importante en la degradación de las membranas basales y componentes de la matriz extracelular [25]. SPARC se asoció con la invasividad de los meningiomas [26, 27] y gliomas [28]. Además, la supresión de la expresión de SPARC utilizando ARN antisentido inhibe la motilidad y la invasión de células de cáncer de mama humano in vitro [21].
Para determinar si SPARC siRNA podría reducir comportamientos celulares protumorigénicas asociadas con la expresión de SPARC, se determinó primero el efecto de la disminución de SPARC expresión en la invasión de células tumorales. Se midió la capacidad de las células de cáncer gástrico para invadir a través de Matrigel, una matriz extracelular artificial, después de la transfección con siRNA SPARC o un control no dirigido siRNA. Disminución de la expresión SPARC condujo a la inhibición de la invasión por 69% y 79% en MGC803 y HGC27, respectivamente. Por lo tanto, SPARC siRNA puede disminuir la invasión del cáncer gástrico in vitro.
Un estudio reciente encontró que SPARC protege las células de la apoptosis inducida por el estrés in vitro a través de una interacción con la integrina beta 1 heterodímeros que mejoran la activación y la actividad de la ILK prosupervivencia [28]. Los estudios iniciales utilizando estrategias de ARN antisentido abrogadas por completo el crecimiento del melanoma humano en ratones nude [21]. Horie et al. [29] demostraron que la regulación a la baja de la expresión de SPARC indujo inhibición del crecimiento con G 1 arresto en células de melanoma humano. Se ha informado de que SPARC promueve la supervivencia celular glioma a través de la activación de Akt a través de la señalización de integrina en condiciones libres de suero [30]. Estos informes sugieren fuertemente que SPARC desempeña un papel como un factor antiestrés.
Por otra parte, algunos artículos encontraron que SPARC puede promover la apoptosis en las células cancerosas. Yiu y colegas [11] demostraron que el tratamiento exógeno de diversas líneas celulares de cáncer de ovario con apoptosis inducida SPARC. Said y Motamed [31] encontraron una exposición SPARC aumentó escinde la caspasa 3 en células de carcinoma de ovario humano que apoyaron la antigua observación. De páncreas [13] y de ovario [30] mostraron mayor crecimiento y reducción de la apoptosis cuando se implanta en SPARC - /-. En las líneas celulares de cáncer colorrectal, la sobreexpresión de SPARC redujo la viabilidad celular y el aumento de la apoptosis en las células expuestas a diversos agentes quimioterapéuticos [32].
Estas observaciones aparentemente paradójicos dentro de cada tipo de cáncer y a través de diferentes tipos de cáncer se puede explicar por la comprensión de Tai de SPARC la biología [33]: péptidos de menor tamaño de SPARC en representación de los diferentes dominios de SPARC confieren actividades biológicas que, a veces, se oponen a las de otros fragmentos de la proteína SPARC o nativa. Dado que el perfil de la proteasa del microambiente del tumor puede ser diferente en diferentes tipos de cáncer, y como SPARC se conoce a someterse a la proteolisis por metaloproteinasas de la matriz [34], estas diferencias, en combinación con cambios en la composición local del moléculas de la matriz y citoquinas, que todos estar contribuyendo al complejo comportamiento de SPARC en diferentes tipos de cáncer.
para dilucidar los efectos de SPARC siRNA sobre el crecimiento celular de cáncer gástrico, ensayo de proliferación de MTT se realizó para comparar la proliferación entre SPARC siRNA transfectadas y control transfectadas MGC803 y HGC 27 Células. células de cáncer gástrico y MGC803 HGC27 transfectadas con siRNA SPARC sobrevivieron a la disminución de las tasas relativas a las células coincidentes transfectadas con un control no dirigido siRNA (Figura 3). La disminución de la supervivencia de las células transfectadas con siRNA SPARC se asoció con un aumento de las tasas de apoptosis tal como se mide por el ensayo de Anexina V. La disminución de la expresión de SPARC aumento de la apoptosis por 91% en MGC803 y 92% en HGC27 (Figura 4B).
Caspasas activas juegan un papel importante en la inducción de apoptosis. Cuando se activa la caspasa-3, PARP se escinde tarde. Por lo general, la escisión de PARP se utilizó como indicador de la apoptosis. En el presente estudio, encontramos SPARC siRNA activa la caspasa-3 para producir fragmentos escindidos de la caspasa-3 (p17) en células MGC 803 y HGC 27 a las 48 h. Al mismo tiempo, también se detectó la escisión de PARP. Los resultados indican que SPARC fragmentación de PARP así como aumento de la actividad de caspasa-3 en células MGC 803 inducida. México La familia Bcl-2 de proteínas han sido reportados para regular la apoptosis mediante el control de la permeabilidad de la membrana mitocondrial. SPARC hasta regula la expresión de Bax y abajo regulada la expresión de Bcl-2 en MGC 803 células y HGC 27 células. Se encontró que el siRNA SPARC podría inducir la apoptosis de células de cáncer gástrico y, simultáneamente, reducir la relación de Bcl-2 a Bax. Por lo tanto, la regulación de la expresión de Bcl-2 y Bax puede ser un mecanismo clave que subyace a la inducción de la apoptosis SPARC en células de cáncer gástrico.
Así que nuestros datos indicaron que la regulación a la baja de SPARC inhibe la proliferación celular de células de cáncer gástrico por la iniciación de la apoptosis, que la conciencia con melanoma y glioma, pero al contrario de cáncer de ovario y de páncreas. La inducción de la apoptosis fue en parte regulada a la vía mitocondrial tales como vía de caspasa de activación, así como la escisión de PARP. futuro estudio debe centrarse en el mecanismo exacto.
En conclusión, nuestros datos actual sugiere que SPARC jugó un papel importante en la apoptosis y metástasis de cáncer gástrico. En la actualidad, no existen métodos eficaces para curar el cáncer gástrico en la etapa tardía. Como expresión de SPARC elevado se asocia con una disminución de cáncer de supervivencia de los pacientes gástrico [16], creemos que nuestros resultados, lo que demuestra una disminución invasión y el aumento de la muerte celular con siRNA dirigido contra SPARC, sugieren que la disminución de la expresión de SPARC puede tener un beneficio terapéutico para los pacientes con cáncer gástrico.
Declaraciones
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Científico Tecnológico de apoyo del Fondo Nacional de Proyectos [30901417]. Agradecemos al profesor Yang Ke y Xiaojuan Du de la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, Beijing, China, para soporte técnico.
Autores archivos originales presentados para las imágenes
A continuación se presentan los enlaces a los archivos de los autores presentados original para imágenes. 'archivo original para la figura 1 13046_2010_306_MOESM2_ESM.jpeg autores 13046_2010_306_MOESM1_ESM.jpeg Autores archivo original para la figura 2 13046_2010_306_MOESM3_ESM.jpeg autores archivo original para la figura 3 13046_2010_306_MOESM4_ESM.jpeg autores archivo original para el archivo original de la figura 4 13046_2010_306_MOESM5_ESM.jpeg los autores de la figura 5 Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

• Metalotioneína 2A inhibe la activación de NF-kB y predice el resultado clínico segregados con el estadio TNM en pacientes con cáncer gástrico tras resection
• secuenciación profunda del carcinoma gástrico revela mutaciones somáticas relacionadas con medicine