La régulation négative de l'expression SPARC diminue le cancer gastrique invasion cellulaire et la survie

La régulation négative de l'expression SPARC diminue le cancer gastrique invasion cellulaire et la survie
Résumé de l'arrière-plan
protéine sécrétée acide et riche en cystéine (SPARC) joue un rôle clé dans le développement de nombreux tissus et types d'organes. l'expression aberrante SPARC n'a été trouvée dans une grande variété de cancers humains, contribue au développement de la tumeur. Parce que SPARC a été trouvé pour être surexprimé dans les tissus du cancer de l'estomac humain, nous avons donc d'explorer l'expression de SPARC dans les lignes de cancer gastrique et les mécanismes cancérogènes.
Méthodes
SPARC expression a été évaluée dans un panel de lignées de cellules cancéreuses gastriques humaines . des lignées cellulaires de cancer gastrique MGC803 et HGC 27 exprimant un niveau élevé de SPARC ont été transitoirement transfectées avec de petits ARN spécifiques SPARC interférents et évalués pour les effets sur l'invasion et la prolifération par la suite
. Résultats
Petit interférant knockdown de l'ARN médiée de SPARC dans MGC803 et HGC 27 cellules de cancer gastrique ont diminué de façon spectaculaire leur invasion.
Knockdown de SPARC a également été observée pour augmenter de manière significative l'apoptose des 27 cellules de cancer gastrique MGC803 et HGC par rapport au groupe de contrôle transfectées. Conclusions
Nos données ont montré que la régulation négative de SPARC inhibe l'invasion et la croissance des cellules cancéreuses gastriques humaines. Le cancer gastrique de Ainsi, le ciblage de SPARC pourrait être une approche thérapeutique efficace contre le cancer gastrique. Introduction est la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde entier et est l'une des tumeurs les plus agressives et est fréquemment associée à des ganglions lymphatiques métastase, dissémination péritonéale, et la métastase hématogène [1]. Dans l'ensemble, 65-70% des nouveaux cas et des décès par cancer gastrique surviennent dans les pays moins développés [2]. En 2005, les taux d'incidence du cancer gastrique (0,3 million de décès et 0,4 millions de nouveaux cas) au troisième rang parmi les cancers les plus fréquents en Chine [3]. Les thérapies actuelles pour stade avancé ou de cancer gastrique métastatique ont peu d'effet, l'ablation chirurgicale avec résection des ganglions lymphatiques adjacents offre la seule chance de guérison, qui est inférieure à 33% des patients atteints de cancer gastrique. Le taux de survie à 5 ans est seulement 30-40%, avec un bon pronostic pour les tumeurs avancées. La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents de la progression du cancer gastrique peut fournir des indications sur de nouvelles cibles thérapeutiques
protéine sécrétée acide et riche en cystéine (SPARC, également connu sous le nom ostéonectine ou BM-40). Appartient à la famille matricellular de protéines sécrétées [4 ]. SPARC est une composante non structurale des matrices extracellulaires qui module les interactions cellule-matrice, en particulier au cours du développement des tissus, le remodelage et la réparation [5]. De nombreux types de cancers sont caractérisés par une expression régulée à la hausse de SPARC [6]. La surexpression de SPARC a été documentée dans plusieurs types de tumeurs solides, comme les cancers du sein [7], de la prostate [8], le mélanome [9] et les glioblastomes [10]. En revanche, les niveaux inférieurs d'expression SPARC ont été trouvés dans d'autres types de cancers, tels que l'ovaire [11], colorectal [12], du pancréas [13, 14] et de la leucémie myéloïde aiguë [15]. Ces observations suggèrent que l'effet tumorigène du SPARC est de type cellulaire spécifique et peut dépendre de la cellule tumorale environnement.
Les connaissances sur les fonctions SPARC dans les cellules de cancer gastrique est encore clairsemée. La surexpression du gène SPARC a été observée dans le cancer gastrique humain dans cinq autres rapports [16-20]. Cependant, toutes les études mentionnées ci-dessus avaient aucun détail dans les lignées cellulaires de cancer gastrique et un mécanisme cancérigène. SPARC a été associée à des étapes agressives du cancer gastrique et est corrélée à un mauvais pronostic [16], ce qui suggère que la réduction de l'expression SPARC peut avoir un bénéfice thérapeutique. En effet, l'expression d'oligonucléotides antisens contre SPARC dans les cellules de mélanome a bloqué la formation de tumeurs [21]. Les mécanismes biologiques et moléculaires précis par lequel une réduction de l'expression SPARC pourrait contribuer au traitement de la tumeur améliorée restent à étudier. Par conséquent, le but de la présente étude était de caractériser les fonctions SPARC dans les cellules de cancer de l'estomac et d'explorer son mécanisme peut-être cancérogène. Matériaux et méthodes humaines lignées cellulaires de cancer gastrique
culture cellulaire NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 ont été obtenus de l'Institut du cancer de l'Académie chinoise des sciences médicales. Toutes les cellules ont été cultivées dans RPMI 1640 (GIBCO ™) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, de la pénicilline G (100 unités /ml) et streptomycine (100 ug /ml), appelé milieu complet. Les cellules ont été maintenues en culture monocouche à 37 ° C dans l'air humidifié avec 5% de CO 2.
Produits chimiques et les réactifs EDTA 2
sodium, l'orange d'acridine, le bromure d'éthidium (EB) et de 3- [4, 5-diméthylthiazol-2-yl] -2,5-diphényl tetrazoliumbromide (MTT) ont été achetés auprès de Sigma (St Louis, MO, USA). Anticorps monoclonal de souris spécifique à la ß-actine était de Sigma. anticorps polyclonaux de lapin spécifique à Bcl-2 (sc-492), caspase-3 (sc-7148) et PARP (sc-7150) ont été achetés à Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Souris des anticorps monoclonaux spécifiques à SPARC (sc-74295) et Bax (sc-7480) ont été obtenus à partir de Santa Cruz Biotechnology. Chèvre anti-lapin (w3960) et anti-souris (w3950) anticorps secondaires ont été achetés chez Promega (Madison, WI, USA). ARNi et Human SPARC siRNA de transfection et siRNA de contrôle étaient de Dharmacon Bioscience Corp (Chicago , IL, USA). Des quantités équimolaires de siRNA ont été utilisés selon les instructions du fabricant avec un contrôle non-ciblage siRNA (CTRL). 150 000 cellules ont été étalées par six puits dans du DMEM avec 10% de FBS et ont été laissées se fixer pendant une nuit. Des quantités équimolaires de siRNA ont été incubées avec TransIT-TKO Transfection Réactif de Mirus (Madison, WI, USA) selon les instructions du fabricant. Les cellules ont été maintenues pendant 48 heures avant les expériences, sauf indication contraire
analyse par transfert de Western
Vingt microgrammes de protéines totales ont été séparées par SDS-PAGE et transférées sur une membrane de PVDF. La membrane a ensuite été incubée avec des anticorps spécifiques pour SPARC (Santa Cruz, 1: 500) ou anti-β-actine (Sigma; 1: 1000) pendant une nuit à 4 ° C. Les anticorps liés ont été visualisés en utilisant une chimioluminescence améliorée. Pour confirmer un chargement égal, les membranes ont été dépouillées pendant 30 minutes à 50 ° C dans un tampon contenant 2% de SDS, Tris 62,5 mM (pH 6,7) et 2 mM de mercaptoéthanol 100 et resondés avec un anticorps anti-β-actine pour montrer une charge égale . La densité des bandes a été quantifiée par analyse densitométrique en utilisant la ImageTool (version 3.0) du système.
ARN total de RT-PCR (02/01 du pg) a une transcription inverse en utilisant un kit de préamplification Superscript (Invitrogen, Carlsbad , CALIFORNIE). Des amorces ont été basées sur des séquences rapportées sur Genebank (NM 003118). séquence sens SPARC était 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'et SPARC séquence anti-sens 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3'. La taille du produit attendu de SPARC ADNc était 512bp. ß-actine séquence sens était 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'et la ß-actine séquence anti-sens 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. La taille attendue du produit de l'ADNc de ß-actine a été 514bp. L'amplification par PCR a été effectuée dans des volumes de 25 ul contenant réactionnelles 0,2 pm dNTP, 20 pmol de chaque amorce oligonucléotidique, et 0,2 U Tag polymerase dans un tampon de PCR. L'ADNc a été amplifié sur un contrôleur thermique PCR avec une dénaturation initiale à 95 ° C pendant 5 minutes, suivi par des cycles de 95 ° C pendant 1 min, 65 ° C pendant 1 min et 72 ° C pendant 1 min, 27 cycles, et une étape d'extension finale de 72 ° C pendant 10 min. La quantité de départ d'ADNc a été ajustée en utilisant l'intensité de la β-actine.
Test de migration cellulaire
la capacité des cellules à migrer à travers les filtres a été mesurée en utilisant une chambre d'invasion de Matrigel BioCoat (BD Biosciences, San Jose, CA). La culture cellulaire introduit avec une taille de pores de la membrane PET 8 um ont été utilisées selon le protocole du fabricant. Le fond de chambre comprise milieu (0,75 ml) contenant du FCS à 10%, tandis que SPARC ARNsi transfectée ou des cellules témoins transfectées (1,0 x 10 5 suspension dans 0,5 ml de milieu contenant 1% de FCS) ont été ensemencées dans la chambre supérieure et incubées pendant une nuit à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2. cellules remaning sur la surface supérieure ont été mécaniquement enlevés. Les membranes ont ensuite été lavées, fixées et colorées par Diff-Quik (Medion Diagnostics). Le nombre de cellules qui ont migré vers la surface inférieure des filtres est déterminée par comptage des cellules colorées au microscope optique en trois champs indépendants (0,25 mm 2 /puits)
La croissance cellulaire et la viabilité essai The. effet de SPARC ARNi sur la viabilité des cellules a été déterminée par le dosage MTT. En bref, MGC803 et HGC 27 cellules ont été plaquées à 1 x 10 4 cellules par puits dans des plaques de microtitrage à quatre-vingt seize puits. Après incubation pendant 72 heures, la viabilité cellulaire a été déterminée. Ensuite, 20 ul de MTT (bromure de 10 mg /ml dans du PBS stock dilué à une concentration de 1 mg /ml avec des milieux de travail) a été ajouté à chaque puits et mis en incubation pendant 4 h. Après élimination minutieuse du milieu, 200 pi de diméthylsulfoxyde ont été ajoutés à chaque puits et on agite soigneusement. L'absorbance a été enregistrée sur le lecteur de microplaques (ELX 800; Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, USA) à une longueur d'onde de 570 nm. L'effet de SPARC ARNsi sur l'inhibition de la croissance cellulaire a été évaluée comme la viabilité des cellules en pourcentage dans laquelle les cellules traités par le véhicule ont été pris comme 100% viables. L'analyse du cycle cellulaire
et annexine V coloration
Pour l'analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux, les cellules traitées avec ARNsi ont été collectés, lavés avec du PBS, fixées dans de l'éthanol froid à 70% et stocké à -20 ° C jusqu'à ce que la coloration. Après fixation, les cellules ont été lavées avec du PBS et incubées avec 50 pg /mL RNase (Sigma) pendant 30 min à 37 ° C, avant la coloration avec 50 ug /mL iodure de propidium (Sigma). Les cellules apoptotiques dans les stades précoces et tardifs ont été détectés à l'aide d'un kit de annexine V-FITC Apoptosis Detection de BioVision (Mountain View, CA, USA). En bref, les cellules ont été transfectées avec le siRNA. À 96 h après la transfection, les milieux de culture et les cellules ont été recueillies et centrifugées. Après lavage, les cellules ont été remises en suspension dans 490 ul de tampon de liaison d'annexine V, suivie par l'addition de 5 pi d'annexine V-FITC et 5 ul d'iodure de propidium. Les échantillons ont été incubés dans l'obscurité pendant 5 min à température ambiante et analysées par cytométrie de flux. Les résultats de Statistique ont été exprimés en moyenne des niveaux d'expression (± SD). t
-test ou la somme des rangs test de Student ont été utilisés pour l'analyse statistique. Une valeur de p < 0,05 a été pris comme niveau de signification (recto-verso).
Résultats de l'expression de SPARC dans les cellules cancéreuses gastriques cultivées
Nous avons d'abord évalué l'expression endogène de SPARC dans plusieurs lignées cellulaires de cancer gastrique humain. Nous avons trouvé que la protéine SPARC et l'ARNm étaient répandues dans les cellules MGC803 et HGC27, ont été produites à des niveaux inférieurs de la lignée cellulaire SGC7901 étaient indétectable dans NCI-N87 et des lignées cellulaires BGC823 (Figure 1). La figure 1: Expression de SPARC dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Une analyse par immunotransfert en utilisant un système SPARC anticorps polyclonal de lapin (1: 500). B, la réaction de transcriptase polymerase chain inverse spécifique (RT-PCR) pour SPARC. la ß-actine a été utilisée comme témoin de chargement. C, les niveaux relatifs d'expression SPARC ARNm. Les autoradiographies ont été numérisés et analysés par densitométrie suivi par la quantification par rapport à la ß-actine. Les résultats sont présentés à titre d'expression (en%) par rapport à la ß-actine et sont des moyens (± écart-type) de 3 expériences de. L'inhibition de l'expression de SPARC endogène
Suite à cette sélection initiale, MGC803 cellules et HGC27 cellules exprimant relativement élevée endogène SPARC ont été établies exprimant SPARC knockdown de manière transitoire pour déterminer l'importance de l'expression de SPARC endogène. Comme on le voit sur la figure 2A, l'expression de SPARC a été inhibée avec des transfectants SPARC ARNsi dans les niveaux de protéine. Ces résultats suggèrent que ces SPARC siRNA exercer avec succès un effet de silence pour l'expression SPARC. Figure 2: Effet de SPARC effet de choc sur la migration des cellules gastriques dans des lignées de cellules cancéreuses MGC 803 et HGC 27 cellules. l'expression R. SPARC dans MGC 803 et 27 HGC, le contrôle et les cellules transfectées SPARC ARNsi a été détectée par une analyse par immunotransfert en utilisant un système SPARC anticorps polyclonal de lapin (1: 500). la ß-actine a été utilisée comme témoin de chargement. B. Effets de SPARC effet de choc sur la migration cellulaire dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. expression SPARC a été renversé en MGC 803 et HGC 27 cellules en utilisant SPARC siRNA et soumis à un test de migration en utilisant un appareil d'invasion de deux chambré comme décrit dans Matériaux et procédés, histogramme montrant pour cent d'inhibition de MGC 803 et HGC 27 invasion cellulaire. L'expérience a été effectuée en triple et la valeur obtenue à partir de cellules transfectées siARN brouillés a été fixé à 100%
. La régulation négative de l'expression SPARC inhibée gastrique cellules cancéreuses invasion in vitro
Pour déterminer si SPARC siRNA pourrait réduire les comportements cellulaires protumorigenic associés à expression de SPARC, on détermine d'abord l'effet de l'expression de SPARC a diminué sur l'invasion des cellules tumorales. essai d'invasion de cellules ont ensuite été réalisée en utilisant Transwell chambres. Nous avons mesuré la capacité des cellules de cancer gastrique à envahir à travers le Matrigel, une matrice extracellulaire artificielle, après transfection par un siRNA contrôle non ciblant ou SPARC ARNsi. Diminution de l'expression SPARC a conduit à l'inhibition de l'invasion par 69% et 79% en MGC803 et HGC27, respectivement (figure 2B, C). La régulation négative de l'ensemble, ces résultats indiquent clairement que la suppression de SPARC inhibe la capacité des cellules et MGC803 HGC27 migration et l'invasion des cellules. SPARC d'expression inhibe la croissance des cellules cancéreuses in vitro gastriques
Nous avons examiné si l'ARNsi SPARC peut diminuer la la survie des cellules cancéreuses gastriques. MGC 803 et HGC 27 cellules cancéreuses gastriques transfectées avec l'ARNsi ont survécu SPARC à des vitesses par rapport à des cellules adaptées transfectées avec un témoin non-cible siRNA (figure 3A) a diminué. La régulation négative de l'expression SPARC n'a pas induit un arrêt du cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses gastriques. Nous avons examiné les effets de l'ARNsi SPARC sur la progression du cycle cellulaire. Silencing de SPARC dans MGC803 et HGC27 cellules n'a pas changé les populations G1 ou en phase S à 72 h après transfection avec SPARC siRNA en comparaison avec le groupe témoin négatif (figure 3B). La Figure 3 Effets de SPARC effet de choc sur la croissance cellulaire dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. les données de la moitié gauche représentent les données obtenues à partir de MGC 803 cellules et les bons représentent les données obtenues à partir de HGC 27 cellules. la croissance A. Basal a été déterminée après 48 h dans un milieu complet par le test MTT. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne croissance (en%) de la lignée de cellules respectives MGC 803 et 27 HGC et des moyens (± ET) de déterminations en quadruple de six expériences distinctes. Les cellules provenant des groupes d'ARNsi et de contrôle ont été collectés pour l'analyse du cycle cellulaire par cytométrie. B. silençage de SPARC par transfection de siRNA n'a pas modifié la distribution du cycle cellulaire dans MGC 803 et HGC 27 cellules cancéreuses gastriques. MGC 803 et HGC 27 cellules ont été transfectées avec SPARC siRNA ou siRNA contrôle négatif. À 72 h post-transfection, la teneur en ADN a été mesurée en utilisant l'iodure de propidium (PI) coloration cytométrie de flux
. L'inhibition de l'expression SPARC améliore l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques
Nous avons étudié si SPARC siRNA pourrait induire la mort cellulaire dans le cancer gastrique des lignées cellulaires. Le traitement des cellules avec HGC27 MGC803 et SPARC ARNsi a augmenté au début des cellules apoptotiques ainsi que des cellules apoptotiques tardives, par rapport au traitement témoin négatif siRNA (figure 4A), telle que mesurée par le test Annexin V. Comme prévu, la diminution de la survie des cellules transfectées avec l'ARNsi SPARC a été associée à une augmentation du taux d'apoptose par 91% en MGC803 et 92% en HGC27 cellules (figure 4B). Ces résultats suggèrent que SPARC est impliqué dans l'apoptose pour maintenir la survie cellulaire dans certaines cellules de cancer gastrique. La figure 4 SPARC résultats effet de choc dans l'induction de l'apoptose dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Pour l'analyse cytométrique de flux, les cellules ont été récoltées 96 h après la transfection avec l'ARNsi SPARC ou de siRNA contrôle négatif, puis colorées avec de l'iodure annexine V-FITC et de propidium (PI). les données de la moitié gauche représentent les données obtenues à partir de MGC 803 cellules et les bons représentent les données obtenues à partir de HGC 27 cellules. Les pourcentages de l'annexine V /PI (début apoptotique) et annexine V /PI (fin apoptotique) cellules est représenté dans chaque panneau. Les valeurs en caractères gras indiquent diminution de l'expression de SPARC ont augmenté l'apoptose de 65% en MGC803 et 92% en comparaison avec HGC27 siRNA contrôle négatif.
Apoptotique effet de SPARC siRNA traitement transfectées dans MGC 803 et cellules HGC27
Dans un effort pour élucider la mécanisme de SPARC dans l'apoptose induite par le siRNA MGC 803 cellules et HGC27 cellules, les niveaux d'expression des protéines apoptotiques-régulation tels que Bcl-2, Bax et de la caspase-3 et de PARP ont été évalués. MGC 803 cellules et les cellules ont été transfectées avec HGC27 SPARC siRNA. Comme le montre la Figure 5, Il y avait des différences significatives dans les expressions de Bax et Bcl-2 dans MGC 803 cellules et cellules HGC27 en comparaison avec le groupe témoin négatif (P < 0,05 et P < 0,01). En réponse à des stimuli apoptotiques, procaspase-3 est clivé en un fragment de 20 kDa, et la réaction autocatalytique ultérieure conduit à la formation du fragment de 17 kDa actif. Lorsque la caspase-3 activée, la PARP est clivé. Ainsi, le clivage de la PARP est utilisé comme un indicateur de l'apoptose. Afin d'obtenir une preuve directe montrant la relation entre l'activation des caspases et l'apoptose, procaspase-3 clivage et PARP ont été examinés dans MGC 803 cellules et cellules HGC27 après SPARC siRNA transfectées. Comme on le voit sur la figure 5, SPARC ARNi induite par le clivage de 32 kDa procaspase-3 dans sa forme active de 17 kDa et le clivage de la PARP est apparue dans MGC 803 cellules et HGC27 cellules. Figure 5 L'expression des protéines de l'apoptose dans MGC 803 et les cellules HGC27 après transfection avec le contrôle ou SPARC siRNA. Les lysats cellulaires ont été séparés sur un gel 10% SDS-PAGE, transférés sur une membrane de nitrocellulose et sondé avec un anticorps anti-PARP, anti-caspase-3, anti-Bcl-2 et anti-Bax. les teneurs en protéines ont été normalisées par sondage de la même membrane avec un anticorps anti-β-actine. . Les données de la moitié gauche représentent les données obtenues à partir de MGC 803 cellules et les bons représentent les données obtenues à partir de HGC 27 cellules de la discussion
protéine sécrétée et riche en cystéine, SPARC (également connu sous le nom ostéonectine, ou membrane basale-40 BM-40) est un membre d'une famille de protéines matricellular, dont la fonction est de moduler les interactions cellule-matrice et la fonction des cellules sans participer à l'échafaudage structurel de la matrice extracellulaire. La surexpression de SPARC a été documentée dans plusieurs types de tumeurs solides, comme les cancers du sein [7], de la prostate [8], le mélanome [9] et les glioblastomes [10]. En revanche, les niveaux inférieurs d'expression SPARC ont été trouvés dans d'autres types de cancers, tels que l'ovaire [11], colorectal [12], du pancréas [13, 14] et de la leucémie myéloïde aiguë [15]. Ces observations suggèrent que l'effet tumorigène du SPARC est de type cellulaire spécifique et peut dépendre de la cellule tumorale environnement.
Les connaissances sur les fonctions SPARC dans les cellules de cancer gastrique est encore clairsemée. Certaines études immunohistochimiques [16-20, 22] collectivement fait état d'une régulation à la hausse de SPARC dans le cancer gastrique par rapport à la muqueuse non néoplasique. Wewer et al. [17] décrit une expression différentielle de SPARC dans les cellules épithéliales et stromales de compartiments de six spécimens de cancer gastrique. Maeng [18] a révélé que SPARC est fortement exprimé dans le stroma réactive associée à adénocarcinomes différenciées invasives et qu'elle peut servir de marqueur de diagnostic clinique utile pour le cancer de l'estomac. Wang et al. [16] a également trouvé un différentiellement exprimé SPARC chez les patients atteints de cancer gastrique évaluée par l'analyse des réseaux de gènes, RT-PCR quantitative, et immunocoloration, l'expression de SPARC plus élevé était significativement associée à la progression de la tumeur et les stades avancés de cancer gastrique. Franke et al. [20] a montré une plus grande série patient SPARC est exprimé de manière différentielle dans les cancers gastriques et que son expression est corrélée avec la progression tumorale et la dissémination nodale en utilisant des microréseaux tissulaires (TMA), le niveau d'expression de SPARC, déterminée par immunohistochimie, corrélés dans le cancer gastrique de type intestinal avec une croissance local de la tumeur, la propagation nodal, et le stade de la tumeur selon l'Union internationale contre le cancer contre. Zhao ZS et al. [19] a révélé que SPARC a été détecté dans 334 des 436 cas de cancer de l'estomac de l'homme et a été fortement exprimé dans 239 tumeurs. Dans les stades I, II et III, le taux de survie à 5 ans des patients avec une forte expression de SPARC était significativement plus faible que ceux des patients ayant une faible expression. En outre l'analyse multivariée a suggéré que la régulation positive de SPARC, MMP-2, et l'intégrine beta1, étaient des indicateurs pronostiques indépendants pour la maladie.
Nous avons recueilli 49 tissus de cancer gastrique et les tissus normaux correspondants par des procédures chirurgicales (Jie Yin, Guowei Chen, Si Liu, Jianxun Zhao, Yucun Liu: expression de SPARC dans le cancer gastrique humain est associé aux caractéristiques cliniques-pathologique, soumis). La distribution et l'expression de SPARC n'a été observé par immunohistochimie, Western Blot et la RT-PCR, respectivement. la protéine SPARC et l'ARNm exprimé significativement plus élevé dans les tissus du cancer de l'estomac par rapport à des tissus normaux. Les degrés de son expression ont été associés à la différenciation de la tumeur, la division TNM, l'ensemencement péritonéale et l'invasion vasculaire remarquablement. Les patients présentant une expression élevée de SPARC ont plus mauvais pronostic que ceux avec une faible expression de SPARC.
Pris ensemble, l'expression de SPARC plus élevé était significativement associée à la progression de la tumeur et des stades avancés de cancer gastrique. Des recherches récentes de Inoue M et al [23], même identifé SPARC comme antigène cible candidate pour l'immunothérapie de divers cancers, dont le cancer gastrique par l'ensemble du génome ADNc microarray. Il est excitant que la thérapie ciblant la sous-unité SPARC peut être une approche utile pour supprimer la croissance du cancer gastrique. Cependant, les mécanismes moléculaires responsables de l'oncogenèse de SPARC dans le cancer gastrique ne sont pas entièrement compris. Grâce à l'analyse de l'expression d'un panel de lignées cellulaires de cancer gastrique, nous avons montré que SPARC est également surexprimé dans des lignées humaines Sevel de cellules cancéreuses gastriques. Par conséquent, nous avons testé nos hypothèses SPARC peut être une molécule clé dans l'invasion de cancer de l'estomac, et que le ciblage SPARC peut présenter une nouvelle stratégie thérapeutique anti-invasion du cancer gastrique.
Diffusion des cellules cancéreuses, soit localement ou au métastatique à distance les sites, exige que les cellules malignes acquièrent la capacité d'envahir la membrane basale et à adhérer à d'autres matrices. Il a été suggéré que SPARC peut jouer un rôle clé au cours des premières étapes du processus d'invasion tumorale et les métastases [24]. En outre, SPARC peut induire l'expression de métalloprotéases ou des enzymes qui jouent ultérieurement un rôle important dans la dégradation des membranes basales et les composants de la matrice extracellulaire [25]. SPARC a été associée à l'invasivité des méningiomes [26, 27] et [28] gliomes. En outre, la suppression de l'expression SPARC en utilisant l'ARN antisens motilité inhibée et l'invasion des cellules cancéreuses du sein humain in vitro [21].
Pour déterminer si SPARC siRNA pourrait réduire les comportements cellulaires protumorigenic associés à l'expression de SPARC, nous avons déterminé d'abord l'effet de la diminution de SPARC expression de l'invasion des cellules tumorales. Nous avons mesuré la capacité des cellules de cancer gastrique à envahir à travers le Matrigel, une matrice extracellulaire artificielle, après transfection avec l'ARNsi SPARC ou un contrôle non ciblant ARNsi. Diminution de l'expression SPARC a conduit à l'inhibition de l'invasion de 69% et 79% en MGC803 et HGC27, respectivement. Ainsi, SPARC siRNA peut diminuer l'invasion de cancer gastrique in vitro.
Une étude récente a révélé que SPARC protège les cellules de l'apoptose induite par le stress in vitro par une interaction avec l'intégrine ß1 hétérodimères qui améliorent l'activation de ILK et l'activité prosurvival [28]. Des études initiales en utilisant des stratégies d'ARN antisens complètement abrogée la croissance du mélanome humain chez la souris nude [21]. Horie et al. [29] ont montré que la régulation négative de l'expression de SPARC a induit une inhibition de croissance par G 1 arrêt dans les cellules de mélanome humain. Il a été rapporté que SPARC favorise la survie des cellules de gliome par l'activation d'Akt par la signalisation des intégrines dans des conditions sans sérum [30]. Ces rapports suggèrent fortement que SPARC joue un rôle en tant que facteur de antistress.
D'autre part, certains articles ont constaté que SPARC peut favoriser l'apoptose dans les cellules cancéreuses. Yiu et ses collaborateurs [11] ont démontré que le traitement exogène des diverses lignées cellulaires de cancer ovarien à l'apoptose induite par SPARC. Said et Motamed [31] ont trouvé l'exposition SPARC augmenté clivé caspase 3 dans des cellules de carcinome ovarien humain qui a soutenu l'ancienne observation. Pancréatique [13] et de l'ovaire [30] ont présenté une plus grande croissance et l'apoptose réduite lorsqu'ils sont implantés dans SPARC - /-. Dans les lignées cellulaires du cancer colorectal, la surexpression de SPARC réduit la viabilité cellulaire et l'apoptose accrue dans les cellules exposées à divers agents chimiothérapeutiques [32].
Ces observations apparemment paradoxales au sein de chaque type de cancer et à travers différents cancers peut être expliqué par la compréhension de Tai de SPARC biologie [33]: petits fragments peptidiques de SPARC représentant les différents domaines de la SPARC confèrent des activités biologiques qui parfois, opposent à ceux d'autres fragments ou la protéine SPARC native. Etant donné que le profil de la protéase du microenvironnement tumoral peut varier en fonction de différents types de cancers, et comme SPARC est connu pour subir une protéolyse par la matrice métalloprotéinases [34], ces différences, en association avec des changements dans la composition locale des molécules de la matrice et des cytokines, peuvent tous soit sur le comportement complexe de SPARC dans différents types de cancer.
pour élucider les effets de SPARC siRNA sur la croissance des cellules du cancer gastrique, un test MTT de prolifération a été réalisée pour comparer la prolifération entre SPARC ARNsi transfecté et le contrôle transfecté MGC803 et HGC 27 cellules. les cellules cancéreuses gastriques et MGC803 HGC27 transfectées avec l'ARNsi ont survécu SPARC à des vitesses par rapport à des cellules adaptées transfectées avec un témoin non-cible siRNA (figure 3) a diminué. La diminution de la survie des cellules transfectées avec l'ARNsi SPARC a été associée à une augmentation du taux d'apoptose, telle que mesurée par le test Annexin V. Diminution de l'expression de SPARC apoptose accrue de 91% en MGC803 et 92% en HGC27 (figure 4B).
Caspases actives jouent un rôle important dans l'induction de l'apoptose. Lors de la caspase-3 a été activée, PARP clivée est en retard. Habituellement, le clivage de la PARP a été utilisé comme indicateur de l'apoptose. Dans la présente étude, nous avons trouvé SPARC siRNA activé caspase-3 pour produire des fragments clivés caspase-3 (p17) dans MGC 803 cellules et HGC 27 à 48 h. Dans le même temps, le clivage de la PARP a également été détectée. Les résultats indiquent que SPARC la fragmentation de la PARP ainsi qu'une augmentation de l'activité caspase-3 dans MGC 803 cellules induites.
La famille Bcl-2 des protéines ont été rapportées pour réguler l'apoptose en contrôlant la perméabilité de la membrane mitochondriale. SPARC jusqu'à régulé l'expression de Bax et une régulation négative de l'expression de Bcl-2 dans les cellules et MGC 803 HGC 27 cellules. Nous avons constaté que SPARC ARNsi pourrait induire l'apoptose des cellules gastriques du cancer et réduire simultanément le rapport de Bcl-2 Bax. Par conséquent, la régulation de Bcl-2 et Bax expression peut être un mécanisme essentiel sous-jacent SPARC induction de l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques. So nos données indiquent que la régulation négative de SPARC a inhibé la prolifération cellulaire de cellules de cancer gastrique par apoptose initiation, qui conscience avec le mélanome et le gliome, mais contrairement au cancer de l'ovaire et du pancréas. L'induction de l'apoptose est régulée en partie à la voie mitochondriale tels que la voie d'activation des caspases, ainsi que le clivage de la PARP. Future étude doit se concentrer sur le mécanisme exact.
En conclusion, nos données actuelles suggère que SPARC a joué un rôle important dans l'apoptose et les métastases du cancer gastrique. À l'heure actuelle, il n'y a pas des approches efficaces pour le traitement du cancer gastrique à un stade avancé. Comme expression de SPARC élevée est associée à une diminution du cancer survie du patient gastrique [16], nous croyons que nos résultats, démontrant une diminution invasion et la mort cellulaire accrue avec le siRNA dirigé contre SPARC, suggèrent que la diminution de l'expression de SPARC peut avoir un bénéfice thérapeutique pour les patients atteints de cancer gastrique.
Déclarations de les Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Fonds national Technologic scientifique soutien du projet [30901417]. Nous remercions le Professeur Yang Ke et Xiaojuan Du du Centre des sciences de la santé de l'Université de Pékin, Beijing, Chine, pour le soutien technique.
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Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts.

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