Downregulation za SPARC izražanja zmanjšuje raka želodca celično invazijo in preživetje

Downregulation za SPARC izražanja zmanjšuje raka želodca celično invazijo in preživetje
Abstract
Ozadje
izloča protein kisla in bogata v cisteinamidno (SPARC) ima ključno vlogo pri razvoju številnih tkiva in tipe organov. Abnormalnih SPARC izraz je na voljo v različnih človeških rakih, prispeva k razvoju tumorjev. Ker je bilo ugotovljeno, SPARC kot močno izraženi v človeški želodčnega tkiva raka, zato smo raziskati izražanje SPARC v želodčnih raka linije in rakotvornih mehanizmov.
Metode
SPARC izraz je bil ocenjen na plošči človeških želodčnega raka celičnih linijah . MGC803 in HGC 27 želodca rakave celične linije izražajo visoko stopnjo SPARC so prehodno transfekciji s SPARC specifične manjših motečih RNA in nato oceniti učinkov na invazijo in orožja.
Rezultati
mala moteče-RNA posredovano rasklapanje za SPARC v MGC803 in HGC 27 želodca rakave celice močno zmanjšala svojo invazijo. Prav tako so opazili rasklapanje za SPARC znatno poveča apoptozo MGC803 in HGC 27 želodčnih celic raka v primerjavi s kontrolno transfektirane skupino.
Sklepi
Naši podatki so pokazali, da downregulating za SPARC zavira invazijo in rast človeških želodčnih rakavih celic. Tako lahko ciljanje SPARC kot učinkovit terapevtski pristop proti raku želodca.
Uvod
želodca rak drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu in je eden izmed najbolj agresivnih tumorjev in je pogosto povezana z bezgavke metastaze, peritonealna razširjanje in hematogenim metastaze [1]. Na splošno 65-70% novih primerov in smrti zaradi raka želodca se pojavljajo v manj razvitih državah [2]. V letu 2005 je stopnja pojavnosti raka želodca (0,3 milijona smrtnih primerov in 0,4 milijona novih primerov) na tretjem mestu med najpogostejšimi raka na Kitajskem [3]. Sedanje terapije za končni fazi ali metastatskega raka želodca imajo le malo vpliva, kirurška odstranitev z resekcijo sosednjih bezgavk ponuja edino možnost za ozdravitev, kar je manj kot 33% bolnikov z rakom želodca. Stopnja preživetja 5 let je samo 30-40%, s slabšo prognozo za napredne tumorjev. Razumevanje molekularne mehanizme, ki podpirajo napredovanje raka želodca lahko zagotovi vpogled v novih terapevtskih ciljev
izloča protein kisla in bogata cistein (SPARC, znan tudi kot osteonectin ali BM-40). Pripada matricellular družino izločajo beljakovine [4 ]. SPARC je nonstructural sestavina zunajceličnih matric, ki modulira celične matrike interakcij, zlasti med razvojem tkiva, preoblikovanje in popravilo [5]. Mnoge vrste raka značilna molekul izražanje SPARC [6]. Čezmernim SPARC je bila dokumentirana v več vrstah trdnih tumorjev, kot dojk [7], prostate [8], melanom [9] in glioblastoma [10]. V nasprotju s tem pa so bile nižje ravni SPARC izražanja v drugih vrst raka, kot jajčnikov [11], debelega črevesa [12], trebušne slinavke [13, 14] in akutne mieloične levkemije [15]. Te ugotovitve kažejo, da je tumorogen učinek SPARC celični tip specifično in je lahko odvisna od tumorske celice, ki obdaja okolje.
Znanje o funkcijah SPARC v želodčnih rakavih celic je še vedno malo. Čezmernim gena SPARC so opazili pri človeškega raka želodca v petih drugih poročilih [16-20]. Vendar vse zgoraj omenjene študije ni imel podrobnosti v želodcu raka celičnih linij in kancerogenih mehanizma. SPARC je bila povezana z agresivnim fazah raka želodca in je v korelaciji s slabo prognozo [16], kar kaže, da ima lahko znižanje SPARC izražanja terapevtsko korist. Dejansko izraz antisense oligonukleotidov proti SPARC v celice melanoma blokira nastanek tumorjev [21]. Natančne biološke in molekularne mehanizme, preko katerih bi lahko znižanje SPARC izražanja prispevajo k boljšemu zdravljenju tumorja je treba še raziskati. Zato je bil cilj te študije za opredelitev SPARC funkcij v želodčnih rakavih celic in raziskati svojo morebiti kancerogeni mehanizem.
Materiali in metode
celični kulturi
linije človekovih želodčni rak celic NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 smo pridobili iz Cancer Institute kitajske akademije medicinske znanosti. Vse celice v RMPI zrasla 1640 (GIBCO ™) medija, dopolnjenega z 10% fetalnega govejega seruma, penicilina G (100 enot /ml) in streptomicin (100 mg /ml), imenovana celotna medij. Celice so bile vzdrževane v eni plasti kulturi pri 37 ° C v navlaženem zraku s 5% CO 2.
Kemikalij in reagentov
EDTA-2 natrij, akridin oranž, etidijev bromid (EB) in 3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazoliumbromide (MTT) smo nabavili pri Sigma (St. Louis, MO, ZDA). Miš monoklonsko protitelo specifično za p-aktin je od Sigme. Rabbit poliklonska protitelesa specifična za Bcl-2 (sc-492), so kaspaze-3 (sc-7148) in PARP (sc-7150) kupila od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, ZDA). Mouse monoklonska protitelesa, specifična za SPARC (sc-74295) in Bax (sc-7480), so bili pridobljeni iz Santa Cruz Biotechnology. Goat anti-zajec (w3960) in anti-mouse (w3950) sekundarna protitelesa so bile kupljene od Promega (Madison, WI, ZDA).
RNAi in transfekciji
Human SPARC siRNA in nadzora siRNA je bilo iz Dharmacon biološke znanosti Corp (Chicago , IL, USA). Ekvimolarne količine siRNAs so bili uporabljeni kot po navodilih proizvajalca s nadzor brez ciljanja siRNA (CTRL). 150 000 celice zasadimo na šestih jamico v DMEM z 10% FBS in je bilo dovoljeno, da se veže preko noči. Ekvimolarne količine siRNAs inkubiramo s tranzitom-TKO transfekciji Reagent od Mirus (Madison, WI, ZDA) po navodilih proizvajalca. Celice smo vzdrževali 48 ur pred poskusov, razen če ni drugače opisano
Western blot analizo
bile Dvajset mikrogramov celokupnih proteinov ločene z SDS-PAGE in prenesli na PVDF membrano. Membrana smo potem inkubirali s protitelesi, specifičnimi za SPARC (Santa Cruz, 1: 500), in anti-P-aktin (Sigma; 1: 1,000) preko noči pri 4 ° C. Vezane protitelesa smo prikazali s pomočjo okrepljenega kemiluminscenco. Za potrditev enako nalagajo, smo membrane odstranimo 30 minut pri 50 ° C v pufer, ki vsebuje 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,7) in 100 mM 2-merkaptoetanol in reprobed s protitelesom anti-P-aktina, da dokazati enako nalagajo . Gostota trakov smo kvantificirali z densitometrične analizo s ImageTool (verzija 3.0) sistema.
RT-PCR
Celotna RNA (1-2 ug) je bila reverzno prepisana uporabo nadpisano kit vnaprej ojačevanja (Invitrogen, Carlsbad , CA). Temeljni premazi so temeljile na sekvencah poročali o genske banke (NM 003118). SPARC smiselno zaporedje je 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'in SPARC anti-sense zaporedje 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3 ". Pričakovana velikost SPARC cDNA produkt je bil 512bp. SS-aktina občutek sekvenca je 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'in SS-aktina anti-sense sekvenco 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. Pričakovana velikost ß-aktin cDNA izdelek je bil 514bp. PCR pomnoževanje smo izvedli v 25 p.l količine reakcijskih vsebujejo 0,2 uM dNTP, 20 pmol vsakega oligonukleotidnega začetnika, in 0.2U Tag polimerazo v PCR pufru. cDNA smo pomnožili na termični krmilnik PCR z začetnim denaturacija pri 95 ° C za 5 minut, čemur sledi ciklov 95 ° C za 1 min, 65 ° C za 1 min in 72 ° C, 1 minuto, 27 ciklov, in končni korak razširitev 72 ° C za 10 minut. Znesek se začne cDNA je bila prilagojena z uporabo beta-aktina intenzivnosti.
Cell migracije test
sposobnost celic za selitev skozi filtre izmerili s pomočjo BioCoat vdora v Matrigel komoro (BD bioznanosti, San Jose, CA). Celična kultura vložki so bili z 8 mikrometrov velikost por PET membrana uporablja v skladu s protokolom proizvajalca. Spodnja komora vključena medij (0.75 ml), ki vsebuje 10% FCS, ker SPARC siRNA transfektirana ali kontrolnih transficirane celice (1,0 x 10 5 suspendirane v 0,5 ml medija, ki vsebuje 1% FCS) smo zasejali v zgornjo komoro in inkubiramo preko noči pri 37 ° C v navlaženi atmosferi, ki vsebuje 5% CO 2. Remaning celic na zgornji površini smo mehansko odstranili. Membrane smo nato sprali, fiksni in obarvajo s Diff-Quik (Medion Diagnostics). Število celic, ki se preselili v spodnje površine filtrov bila določena s štetjem obarvane celice pod svetlobnim mikroskopom pri treh neodvisnih polj (0,25 mm 2 /jamico).
Rast celic in sposobnost preživetja test
učinek SPARC siRNA na sposobnost preživetja celic je bila določena z MTT testom. Na kratko smo MGC803 in HGC 27 celicami prekrita na 1 x 10 4 celic na jamico v šestindevetdeset-luknjičaste mikrotitrske ploščice. Po inkubaciji 72 ur, je bila viabilnost celic določimo. Nato 20 ul MTT (10 mg /ml v PBS zalogi, razredčimo z delom koncentracijo 1 mg /ml z mediji) dodamo v vsako vdolbino in inkubiramo 4 ure. Po skrbnem odstranitvi gojišča smo 200 ul dimetilsulfoksid dodamo v vsako jamico in skrbno pretresti. Absorbanco je bil posnet na mikroploščnem čitalniku (ELX 800; Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, ZDA) pri 570 nm valovne dolžine. Učinek SPARC siRNA na zaviranje rasti celic je bila ocenjena kot viabilnosti celic, kjer je bilo vozilo obravnavajo celice se upošteva kot 100% uspešna. Analize
Celični ciklus in aneksin V barvanja
Za analizo s pretočno citometrijo celičnega cikla, celice zdravijo z siRNA zberemo, speremo s PBS, določen v mrzlem 70% etanola in shranili pri -20 ° C do obarvanja. Po posnetka, celice speremo s PBS in inkubiramo pri 50 ug /mL RNaseA (Sigma) 30 minut pri 37 ° C, pred barvanjem z 50 mikrogramov /mL propidijevim jodidom (Sigma). Apoptotske celice v zgodnjih in poznih fazah so bili odkriti tudi z V-FITC apoptoze Detection Kit za aneksin iz BioVision (Mountain View, CA, ZDA). Na kratko smo celice transfektirali z siRNA. Ob 96 h post-transfekciji smo gojišča in celice zbrali in centrifugirali. Po spiranju smo celice resuspendirali v 490! Li aneksin V vezave pufru, čemur sledi dodatek 5! Li aneksina V-FITC in 5! Li propidijevim jodidom. Vzorce inkubiramo v temi za 5 min pri sobni temperaturi in analiziramo s pomočjo pretočna citometrija.
Statistika
Rezultati so izraženi kot pomenijo nivoje izražanja (± SD). Študentska t
-test ali rang zneska testu smo uporabili za statistično analizo. A p-vrednost < 0.05 je bila sprejeta kot stopnjo pomembnosti (obojestransko).
Rezultati
Izražanje SPARC v kultiviranih želodčne rakavih celic
Najprej smo ocenjevali endogenega izražanje SPARC v številnih človeških želodčnih raka celičnih linijah. Ugotovili smo, da so bili SPARC beljakovine in mRNA prevladuje v MGC803 in HGC27 celice, so bili proizvedeni na nižjih nivojih celične linije SGC7901 so nezaznavno v NCI-N87 in celičnih linij BGC823 (slika 1). Slika 1 Podajanje SPARC v želodčnih raka celičnih linij. A, Imunoblot analiza, ki uporablja zajec poliklonsko SPARC protitelo (1: 500). B, Posebna reverzne transkriptaze verižna reakcija s polimerazo (RT-PCR) analize za SPARC. beta-aktin uporabimo kot kontrolo obremenitve. C, relativne stopnje izraženosti SPARC mRNA. Autoradiographs so skenirani in analizirali z denzitometrijo sledi kvantifikacije glede na beta-aktin. Rezultati so prikazani kot izraz (v%) glede na P-aktina in so sredstva (± SD) 3 poskusov.
Inhibicija endogenega SPARC izražanja
Po tej začetni pregled, MGC803 celice in HGC27 celice, ki izražajo relativno visoko endogene SPARC so bile določene rasklapanje izrazil SPARC v prehodnem način, da se določi pomen endogenega SPARC izražanja. Kot je prikazano na sliki 2A, je SPARC izraz inhibiran s SPARC siRNA transfektanti na ravni beljakovin. Ti rezultati kažejo, da ti SPARC siRNAs uspešno izvajala za dušenje zvoka učinek za SPARC izražanja. Slika 2 Vpliv SPARC rasklapanje na celični migraciji v želodcu raka celičnih linijah MGC 803 in HGC 27 celic. A. SPARC izraz v MGC 803 in HGC 27, nadzora in SPARC siRNA transfekciji celic je bila odkrita z analizo imunoblot uporabo zajec poliklonsko SPARC protitelo (1: 500). beta-aktin uporabimo kot kontrolo obremenitve. B. Vpliv SPARC rasklapanje na celični migraciji v želodcu raka celičnih linijah. SPARC izraz je bil porušen v MGC 803 in HGC 27 celic z uporabo SPARC siRNA in opraviti migracije testu uporabo dveh prekatov invazijo aparat je, kot je opisano v Materiali in metode, histogram, ki prikazuje odstotno inhibicijo MGC 803 in HGC 27 celic invazijo. Poskus smo izvedli v treh izvodih in pridobljen iz umešana transfekciji celic siRNA vrednost je bila določena kot 100%.
Downregulation za SPARC izražanja zaviral želodčni rak celic invazijo in vitro
Da bi ugotovili, če bi SPARC siRNA zmanjšali protumorigenic mobilnih vedenj, povezanih z SPARC izraz, moramo najprej določiti učinek zmanjšal SPARC izražanja na invazije tumorskih celic. Cell invazija test smo nato izvedli z uporabo Transwell komore. Smo izmerili zmogljivost želodca rakavih celic, da napadejo skozi Matrigel, umetno zunajceličnega matriksa, po transfekciji z ne-ciljni nadzorni siRNA ali SPARC siRNA a. Zmanjšana SPARC izraz privedla do zaviranja vdoru 69% in 79% v MGC803 in HGC27 oz (slika 2B, C). Če povzamemo, ti rezultati jasno kažejo, da odprava SPARC zavira migracije in invazijo sposobnost MGC803 celic in HGC27 celic.
Downregulation za SPARC izražanja zavira rast želodčnih rakavih celic in vitro
Ugotavljali smo, ali bi SPARC siRNA zmanjša preživetje želodčnih rakavih celic. MGC 803 in HGC 27 želodca rakave celice transfektirane s SPARC siRNA preživela na znižal tečaje glede ujema celic transfekciji z ne-ciljnih nadzora siRNA (slika 3A). Downregulation za SPARC izražanja ni povzročil aretacijo celičnega ciklusa v želodcu rakavih celic. Smo preučevali učinke SPARC siRNA o napredovanju celičnega ciklusa. Utišanje SPARC v MGC803 in HGC27 celic niso spremenile G1 ali S fazo populacij 72 h posttransfection s SPARC siRNA v primerjavi z negativno kontrolno skupino (slika 3b). Slika 3 Učinki SPARC rasklapanje na rast celic v želodcu raka celičnih linijah. levo podatki pol predstavljajo podatke, pridobljene iz MGC 803 celic in prave predstavljajo podatke, pridobljene iz HGC 27 celic. Rast A. Basal je bila določena po 48 urah v kompletnem mediju z MTT testom. Rezultati so podani kot povprečne rasti (v%) vsakokratnega MGC 803 in HGC 27 celične linije in sta sredstvo (± SE) četverk določitev šestih ločenih eksperimentih. Celice iz skupin siRNA in nadzora, so bili zbrani za analizo citometrijo celičnega cikla. B. utišanje SPARC s siRNA transfekciji ni spremenila razporeditev celičnega ciklusa v MGC 803 in HGC 27 želodca rakavih celic. MGC 803 in HGC 27 celic so transfekciji s SPARC siRNA ali negativni kontrolni siRNA. Po 72 urah po transfekciji smo vsebnost DNA merili z uporabo propidijevim jodidom (PI) barvanje za pretočno citometrijo.
Zaviranje SPARC izražanja povečuje apoptozo v rakavih celicah želodčne
preiskovanih Mi, ali se lahko SPARC siRNA inducira celično smrt pri raka želodca celične linije. Zdravljenje MGC803 in HGC27 celic z SPARC siRNA povečano zgodaj apoptotične celice kot tudi poznih apoptotične celice, v primerjavi z negativno kontrolo zdravljenja siRNA (slika 4A), merjeno z aneksinom V testom. Kot je bilo pričakovati, se je zmanjšala preživetje celic, transfektiranih s SPARC siRNA povezano s povečano stopnjo apoptoze za 91% v MGC803 in 92% v HGC27 celic (slika 4b). Te ugotovitve kažejo, da je SPARC vpleten v apoptozo vzdrževati celično preživetje v nekaterih želodčnih rakavih celic. Slika 4 SPARC razgradljiv rezultate indukcijo apoptoze v želodcu raka celičnih linijah. Za analizo pretočno citometrijo, celice požanjemo 96 ur po transfekciji s SPARC siRNA ali negativni kontrolni siRNA, nato obarvano z aneksin V-FITC in propidijevim jodidom (PI). levo podatki pol predstavljajo podatke, pridobljene iz MGC 803 celic in prave predstavljajo podatke, pridobljene iz HGC 27 celic. Odstotki aneksina V /PI (zgodnji apoptotske) in aneksina V /PI (pozno apoptotske) celic je prikazana na vsaki plošči. Vrednosti v krepko kažejo zmanjšuje SPARC izraz v primerjavi z negativno kontrolo siRNA povečala apoptozo za 65% v MGC803 in 92% v HGC27.
Apoptotsko učinek SPARC siRNA transfektirane zdravljenje v MGC 803 in HGC27 celice
V prizadevanju za pojasnitev so bili ocenjeni mehanizem SPARC siRNA inducirane apoptoze v MGC 803 celic in HGC27 celic, izražanjem apoptotske-regulacijskih proteinov, kot so Bcl-2, Bax in kaspaze-3 in PARP. MGC 803 celic in HGC27 celice so transfekciji s SPARC siRNA. Kot je prikazano na sliki 5, ni bilo pomembne razlike v izrazov Bax in Bcl-2 v MGC 803 celic in HGC27 celic v primerjavi z negativno kontrolno skupino (P < 0,05 in P < 0,01). V odgovor na apoptotskih dražljaje, ki se procaspase-3 cepimo v 20 kDa fragmenta, in kasnejša avtokatalitična reakcija vodi do tvorbe aktivnega 17 kDa fragmenta. Ko je aktivirana kaspaza-3, ki je PARP odcepimo. Tako je cepitev PARP uporablja kot kazalnik apoptoze. Da bi pridobili neposredne dokaze odnos aktivacije kaspaze in apoptozo, so bili pregledani procaspase-3 cepitev in PARP v MGC 803 celic in HGC27 celic po SPARC siRNA transfektirana. Kot je prikazano na sliki 5, SPARC SiRNA povzroča cepitev 32 kDa procaspase-3 v svoji aktivni 17 kDa obliki in dekolteja PARP pojavil v MGC 803 celic in HGC27 celice. Slika 5 Izraz apoptoze proteinov v MGC 803 in HGC27 celic po transfekciji bodisi z nadzorom ali SPARC siRNA. V lizati celic smo ločili na 10% SDS-PAGE gelu, prenesli na nitrocelulozno membrano in skeniran z anti-PARP, anti-kaspaze-3, anti-Bcl-2, in anti-BAX. Vsebino proteinske smo normalizirali s sondiranje isto membrano z anti-P-aktina. . Podatki levi polovici predstavljajo podatke, pridobljene iz MGC 803 celic in prave predstavljajo podatke, pridobljene iz HGC 27 celic
Razprava
izločajo beljakovin in bogata z cistein, SPARC (znan tudi kot osteonectin ali kleti-membrane-40 , BM-40), je član družine matricellular proteinov, katerih funkcija je, da modulirajo celično matrične interakcije in delovanje celic ne sodelujejo v strukturnem oder ekstracelularnega matriksa. Čezmernim SPARC je bila dokumentirana v več vrstah trdnih tumorjev, kot dojk [7], prostate [8], melanom [9] in glioblastoma [10]. V nasprotju s tem pa so bile nižje ravni SPARC izražanja v drugih vrst raka, kot jajčnikov [11], debelega črevesa [12], trebušne slinavke [13, 14] in akutne mieloične levkemije [15]. Te ugotovitve kažejo, da je tumorogen učinek SPARC celični tip specifično in je lahko odvisna od tumorske celice, ki obdaja okolje.
Znanje o funkcijah SPARC v želodčnih rakavih celic je še vedno malo. Nekatere Imunohistokemične študije [16-20, 22] skupaj poročali up-ureditev SPARC na raka želodca v primerjavi z nonneoplastic sluznice. Wewer et al., [17] opisal diferencialno izražanje SPARC v predelku epitelnih in stromalnih šestih želodcu osebkov rakom. Maeng [18] je pokazala, da je SPARC zelo izražena v reaktivno strome, povezanih z invazivnimi diferenciranimi adenokarcinoma in da lahko služi kot koristen klinični diagnostični označevalec raka na želodcu. Wang et al. [16] prav tako našla različno izražena SPARC pri bolnikih z rakom želodca kot je bilo ocenjeno z analizo genov diod, kvantitativno RT-PCR, in imunskim barvanjem, višja SPARC izražanje je bistveno povezana z napredovanja tumorja in poznejših fazah raka želodca. Franke et al. [20] je pokazala na večje serije bolnikov, ki se SPARC različno izražena v želodcu raka in da je njen izraz korelira z napredovanja tumorja in bezgavk širjenje z uporabo tkiv mikromrež (TMAs), Raven izražanja SPARC, ki ga imunohistokemijo določi, povezana z rakom intestinalnega tipa želodca z lokalno rast tumorja, vozlišča širjenja in stopnjo tumorja po Mednarodne zveze proti raku. Zhao ZS et al. [19] je pokazala, da je bila SPARC odkrita v 334 od 436 želodca primerov človeškega raka in je bil močno izražen v 239 tumorjev. V fazi I, je bila II in III, 5-letno preživetje bolnikov z visokim izraz SPARC bistveno nižje od tistih, pri bolnikih z nizko izražanja. Dodatne multivariatna analiza pokazala, da je bilo Povecanje za SPARC, MMP-2 in integrin beta1, neodvisni napovedni kazalci za bolezen.
Smo zbrali 49 želodca raka tkiva in ustreza normalnih tkiv s kirurškimi posegi (Jie Yin, Guowei Chen, Si Liu, Jianxun Zhao, Yucun Liu: Izražanje SPARC v človeškega raka želodca je povezana s kliničnimi patoloških lastnosti, predložene). Porazdelitev in izražanje SPARC so opazili s imunohistokemijo, Western blot in RT-PCR, oz. SPARC beljakovine in mRNA izražena bistveno višja v želodčnih tkivih raka v primerjavi z običajnimi tkiva. Stopnje svojem izrazu je bilo povezano z diferenciacijo tumorja, delitve TNM, peritonealna setev in vaskularna invazija neverjetno. Bolniki z visokim izražanja SPARC imajo slabšo prognozo kot tisti z nizko izražanje SPARC.
Skupaj višja SPARC izražanje je bistveno povezana z napredovanja tumorja in naprednih fazah raka želodca. Nedavne raziskave Inoue M et al [23] celo identifed SPARC kot ciljni kandidat antigena za imunoterapijo različnimi vrstami raka, vključno z rakom želodca, ki ga genoma vsej cDNA mikromrež. To je zanimivo, da je lahko zdravljenje z osredotočanjem na SPARC podenoto uporaben pristop za zaviranje rasti raka želodca. Vendar pa molekularni mehanizmi, ki so odgovorni za onkogenezo za SPARC na raka želodca ni povsem razumel. Z analizo ekspresije panela želodčnega raka celičnih linij, smo pokazali, da je SPARC prekomerno tudi Sevel človeške želodčne raka celičnih linij. Zato smo testirali naše hipoteze, da so lahko SPARC ključna molekula v želodcu invazije raka, in da je ciljanje SPARC lahko predstavlja novo terapevtsko strategijo za boj proti invaziji na raka želodca.
Širjenje rakavih celic, bodisi lokalno ali na oddaljenem metastatskim strani zahteva, da maligne celice pridobijo sposobnost za vdor v kleti membrano in držijo druge matrice. Predlagano je bilo, da lahko SPARC igrajo ključno vlogo v začetnih korakov v procesu tumorske invazije in metastaz [24]. Poleg tega lahko SPARC inducira ekspresijo metaloproteinaz ali encimov, ki nato igrajo pomembno vlogo pri razgradnji bazalnih membran in izvencelicnega matriksa [25]. SPARC je bil povezan z invazivnosti za meningiomas [26, 27] in gliomov [28]. Poleg tega zatiranje SPARC izražanja uporabe antisense RNA inhibirana gibljivost in vdor človeških celic raka dojke in vitro [21].
Želite ugotoviti, če bi SPARC siRNA zmanjšali protumorigenic mobilnih vedenj, povezanih s SPARC izražanja, smo najprej določili učinek zmanjšala SPARC izraz na invazije tumorskih celic. Smo izmerili zmogljivost želodca rakavih celic, da napadejo skozi Matrigel, umetno zunajceličnega matriksa, po transfekciji s SPARC siRNA ali ne-ciljni nadzor siRNA. Zmanjšano SPARC izraz v MGC803 in HGC27 pripeljala do inhibicije invazije za 69% in 79%, v tem zaporedju. Tako lahko SPARC siRNA zmanjšanje želodca invazijo raka in vitro.
Nedavna študija je pokazala, da SPARC ščiti celice pred stresom povzročeno apoptozo in vitro skozi interakcijo z integrinskih β1 heterodimerov ki povečujejo aktivacijo Sorta in prosurvival dejavnost [28]. Prve študije z uporabo nezaznavnih strategije RNA popolnoma odpravljeno rast človeškega melanoma v golih miših [21]. Horie et al. [29] je pokazala, da downregulation za SPARC izražanja inducirane inhibicije rasti z G 1 prijetje v melanoma celic. Ugotovljeno je bilo, da SPARC spodbuja preživetje gliom celic z Akt aktivacijo preko integrina signalizacijo ob pogojih brez seruma [30]. Ta poročila jasno kažejo, da ima SPARC vlogo kot dejavnik stresna.
Po drugi strani pa so nekateri členi ugotovili, da lahko SPARC spodbuja apoptozo v rakavih celicah. Yiu in sodelavci [11] je pokazala, da eksogena zdravljenje različnih jajčnikov linij rakavih celic z SPARC inducirane apoptoze. Said in Motamed [31] je pokazala, SPARC izpostavljenost povečala razcepi kaspaze 3 v človeških ovarijskih celic karcinoma, ki podpirajo nekdanjega opazovanje. Trebušne slinavke [13] in raka jajčnikov [30] razstavili večjo rast in nižjo apoptozo kadar so vsajeni v SPARC - /-. V debelega črevesa in raka celičnih linijah, čezmernim SPARC zmanjšana sposobnost preživetja celic in povečano apoptozo v celicah, ki so izpostavljeni različnim kemoterapevtiki [32].
Te navidezno paradoksalne stališč znotraj posamezne vrste raka in med različnimi vrstami raka je mogoče razložiti z razumevanjem Tai dne SPARC biologija [33]: manjše peptidne fragmente SPARC zastopajo različne domene SPARC daje biološke aktivnosti, ki v času, nasprotujejo tistih drugih fragmentov ali rodni SPARC beljakovin. Ker profilu proteaze v mikrookolja tumorja lahko razlikujejo v različnih vrst raka, in kot SPARC znano, da opravijo proteolizo s matriksnih metaloproteinaz [34], te razlike, v kombinaciji s spremembami v lokalnem sestavo matrične molekul in citokinov, lahko vse lahko prispevajo k kompleksnega obnašanja SPARC v različnih vrst raka.
za pojasnitev učinkov SPARC siRNA na rast želodčni rak celic, je bil test MTT širjenje izvedena za primerjavo širjenja med SPARC siRNA transfektirali in nadzor transfektirali MGC803 in HGC 27 celice. MGC803 in HGC27 želodca rakave celice transfektirane s SPARC siRNA preživela na znižal tečaje glede ujema celic transfekciji z ne-ciljnih nadzora siRNA (slika 3). Zmanjšana preživetja celic, transfektiranih s SPARC siRNA je bilo povezano s povečano stopnjo apoptoze kot se meri z aneksinom V testom. Zmanjševanje SPARC izraz povečala apoptozo za 91% v MGC803 in 92% v HGC27 (slika 4B).
Aktivne kaspaze igrajo pomembno vlogo pri indukcijo apoptoze. Ko je bil aktiviran kaspaze-3, ki je PARP razcepi prepozno. Običajno je cepitev PARP uporablja kot kazalnik apoptoze. V tej študiji smo ugotovili, SPARC siRNA aktivira kaspaze-3 za izdelavo razcepi kaspaze-3 (P17) delci v MGC 803 celic in HGC 27 na 48 ur. Hkrati smo zaznali tudi cepitev PARP. Rezultati kažejo, da SPARC povzroča razdrobljenost živalskega telesa, kot tudi povečano kaspaze-3 aktivnosti v MGC 803 celic.
Družine Bcl-2 proteini so poročali, da uravnavajo apoptozo z nadzorovanjem prepustnost mitohondrijske membrane. SPARC up urejen izraz Bax in navzdol regulirano ekspresijo Bcl-2 v MGC 803 celic in HGC 27 celic. Ugotovili smo, da lahko SPARC siRNA povzročijo želodčne rakavih celic apoptoze in hkrati zmanjša razmerje Bcl-2, Bax. Zato se lahko ureditev Bcl-2 in Bax izražanja biti ključni mehanizem, ki je podlaga SPARC indukcijo apoptoze pri želodčnih rakavih celic.
Torej, naši podatki kažejo, da downregulation za SPARC inhibira proliferacijo želodčnih rakavih celic z apoptozo začetku, kar vesti z melanomom in gliomom, vendar v nasprotju s jajčnikov in pankreasni rak. Indukcijo apoptoze je delno regulira mitohondrijev poti kot aktivacijskega kaspaze poti, kakor tudi cepitve PARP. Prihodnost študija se mora osredotočiti na točno mehanizma.
Skratka, naš sedanji podatki kažejo, da SPARC igral pomembno vlogo v apoptozi in metastaz raka želodca. Trenutno ne obstajajo učinkoviti pristopi za zdravljenja raka želodca pozno. Kot je povišano SPARC izraz povezano z zmanjšano želodcu raka preživetje bolnikov [16], smo prepričani, da naši rezultati, ki dokazujejo, zmanjšala vdor in povečano celično smrt z siRNA, usmerjenem proti SPARC, kažejo, da ima lahko zmanjšuje SPARC izraz terapevtsko korist za bolnike z rakom želodca.
IZJAVE
Zahvala
to delo je podprl Nacionalni Znanstveno tehnološkega podpornega projekta sklada [30901417]. Zahvaljujemo Profesor Yang Ke in Xiaojuan DU Peking University Health Science Centre, Peking, Kitajska, za tehnično podporo.
Avtorjev prvotni prenosov datotek za slike
Spodaj so povezave do avtorjev prvotna predloženih spisov za slike. "Izvirno datoteko na sliki 1 13046_2010_306_MOESM2_ESM.jpeg avtorjev 13046_2010_306_MOESM1_ESM.jpeg avtorjev prvotni datoteki Slika 2 13046_2010_306_MOESM3_ESM.jpeg avtorjev prvotni datoteki Slika 3 13046_2010_306_MOESM4_ESM.jpeg avtorjev prvotne datoteke za izvirno datoteko Slika 4 13046_2010_306_MOESM5_ESM.jpeg avtorjev za sliki 5 konkurenčni interesi
avtorji izjavljajo, da nimajo konkurenčnih interesov.

• Metalotionein 2A zavira NF-κB pot aktivacije in napoveduje klinični izid ločene s stopnjo TNM pri bolnikih z rakom želodca po radikalni resection
• Deep zaporedja raka želodca razkriva somatskih mutacij, ki so pomembni za osebno medicine