Nedregulering av SPARC uttrykk reduserer magekreft celleinvasjon og overlevelse

Nedregulering av SPARC uttrykk reduserer magekreft celleinvasjon og overlevelse
Abstract
Bakgrunn
utskilt protein syrlig og rik på cystein (SPARC) spiller en nøkkelrolle i utviklingen av en rekke vev og organtyper. Aberrant SPARC- ekspresjon ble funnet i et bredt spekter av humane kreftformer, bidrar til tumorutvikling. Fordi SPARC ble funnet å være overuttrykt i human magekreft vev, vi derfor å utforske uttrykk for SPARC i magekreft linjer og kreftfremkallende mekanismer.
Metoder
SPARC uttrykk ble evaluert i et panel av humane mage kreft cellelinjer . MGC803 og HGC 27 mage kreft cellelinjer som uttrykker høy grad av SPARC ble transient transfektert med SPARC-spesifikke små interfererende RNA og senere undersøkt for effekter på invasjon og spredning
. Resultater
Small interfering RNA-mediert knockdown av SPARC i MGC803 og HGC 27 mage kreftceller dramatisk redusert sin invasjon. Knockdown av SPARC ble også observert en kraftig økning av apoptose av MGC803 og HGC 27 mage kreftceller sammenlignet med kontroll transfektert gruppe.
Konklusjoner
Våre data viste at downregulating av SPARC hemmer invasjon og vekst av menneskelige mage kreftceller.
Dermed målretting av SPARC kunne være en effektiv terapeutisk tilnærming mot magekreft.
Innledning Magekreft er den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis og er en av de mest aggressive svulster og er ofte forbundet med lymfeknute metastase, peritoneal formidling, og hematogenous metastase [1]. I det hele tatt, 65-70% av nye tilfeller og dødsfall fra magekreft forekommer i mindre utviklede land [2]. I 2005, forekomst av magekreft (0,3 millioner dødsfall og 0,4 millioner nye tilfeller) rangert som nummer tre blant de vanligste kreftformene i Kina [3]. Eksisterende behandling for avansert stadium eller magekreft med spredning har liten effekt, kirurgisk fjerning med reseksjon av tilstøtende lymfeknuter tilbyr den eneste sjansen for helbredelse, som er mindre enn 33% av pasienter med magekreft. Den 5-års overlevelse er bare 30-40%, med en dårligere prognose for avanserte svulster. Forstå de molekylære mekanismene bak utviklingen av magekreft kan gi innsikt i nye terapeutiske mål
utskilt protein syrlig og rik på cystein (SPARC, også kjent som osteonectin eller BM-40). Tilhører matricellular familie av utskilte proteiner [4 ]. SPARC er en nonstructural del av ekstracellulære matriser som modulerer celle-matriks interaksjoner, spesielt i vev utvikling, ombygging og reparere [5]. Mange typer av kreft er karakterisert ved oppregulert ekspresjon av SPARC- [6]. Overekspresjon av SPARC- er dokumentert i en rekke typer av faste tumorer, for eksempel bryst [7], prostata [8], melanom [9] og glioblastomer [10]. I motsetning til dette har lavere nivåer av SPARC- ekspresjon ble funnet i andre typer av kreftformer, slik som ovarie [11], kolorektal [12], bukspyttkjertel [13, 14] og akutt myelogen leukemi [15]. Disse observasjonene tyder på at tumorigent effekten av SPARC er celletype spesifikke og kan være avhengig av tumorcellen omgivelsene.
Kunnskap om SPARC funksjoner i mage kreftceller er fortsatt sparsom. Overekspresjon av SPARC- genet ble observert i humane magekreft i fem andre rapporter [16-20]. Men alle ovennevnte studiene hadde ingen detaljer i mage kreft cellelinjer og kreftfremkallende mekanisme. SPARC- har vært forbundet med aggressive stadier av magekreft og er korrelert med dårlig prognose [16], noe som antyder at reduksjonen av SPARC- ekspresjon kan ha terapeutisk nytte. Faktisk ekspresjon av antisens oligonukleotider mot SPARC- i melanomceller blokkerte tumordannelse [21]. De nøyaktige biologiske og molekylære mekanismer gjennom som en reduksjon i SPARC uttrykk kan bidra til forbedret tumorterapi gjenstår å bli undersøkt. Derfor er målet med denne studien var å karakter SPARC funksjoner i mage kreftceller og utforske sin muligens kreftfremkallende mekanisme.
Materiale og metode
Cell kultur
menneskemagekreft cellelinjer NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 ble hentet fra Cancer Institute of Chinese Academy of Medical Science. Alle celler ble dyrket i RMPI 1640 (GIBCO ™) medium supplementert med 10% føtalt bovint serum, penicillin G (100 enheter /ml) og streptomycin (100 ug /ml) betegnet komplett medium. Celler ble opprettholdt i monolagskultur ved 37 ° C i fuktet luft med 5% CO 2.
Kjemikalier og reagenser
EDTA-2-natrium, akridinorange, etidiumbromid (EB) og 3- [4, 5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl tetrazoliumbromide (MTT) ble kjøpt fra Sigma (St Louis, MO, USA). Mus monoklonalt antistoff spesifikt for p-actin var fra Sigma. Kanin polyklonale antistoffer spesifikke for BCL-2 (sc-492), ble caspase-3 (sc-7148) og PARP (sc-7150) kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Mus-monoklonale antistoffer som er spesifikke for SPARC- (sc-74295) og Bax (sc-7480) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology. Geit anti-kanin (w3960) og anti-mus (w3950) sekundære antistoffer ble kjøpt fra Promega (Madison, WI, USA).
RNAi og transfeksjon
Menneskelig SPARC siRNA og kontroll siRNA var fra Dharmacon Biovitenskap Corp (Chicago , IL, USA). Ekvimolare mengder sirnas ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner med kontroll ikke-måls siRNA (CTRL). 150 000 celler ble utplatet per seks-brønn i DMEM med 10% FBS og fikk feste seg over natten. Ekvimolare mengder sirnas ble inkubert med transitt-TKO Transfeksjon Reagens fra Mirus (Madison, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Celler ble opprettholdt i 48 timer før eksperimentene, med mindre annet er beskrevet
Western blot-analyse
Tyve mikrogram av totalt protein ble separert ved SDS-PAGE og overført på en PVDF-membran. Membranen ble deretter inkubert med antistoffer som er spesifikke for SPARC- (Santa Cruz, 1: 500), eller anti-β-aktin (Sigma, 1: 1000) over natt ved 4 ° C. Bundet antistoff ble visualisert ved hjelp av forsterket kjemiluminescens. For å bekrefte lik belastning, ble membraner strippet i 30 minutter ved 50 ° C i buffer inneholdende 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,7) og 100 mM 2-merkaptoetanol og reprobed med et anti-β-actin-antistoff for å demonstrere lik belastning . Tettheten av båndene ble kvantifisert ved densitometrisk analyse ved anvendelse av ImageTool (versjon 3.0) system.
RT-PCR
Totalt RNA (1-2 ug) ble reverstranskribert ved hjelp av et Superscript pre-amplifikasjon sett (Invitrogen, Carlsbad , CA). Primere ble basert på sekvenser som er rapportert på Genebank (NM 003118). SPARC- forstand sekvens var 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'og SPARC- anti-sense sekvensen 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3'. Det forventede produkt størrelsen av SPARC- cDNA ble 512bp. ß-aktin forstand sekvens var 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'og ß-aktin anti-sense sekvensen 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. Den forventede produktet størrelsen på ß-aktin cDNA var 514bp. PCR-amplifikasjon ble utført i 25 pl reaksjonsvolumer inneholdende 0,2 pM dNTPs, 20 pmol av hvert oligonukleotid-primer, og 0.2U Tag-polymerase i PCR-buffer. cDNA ble amplifisert i en PCR termiske kontroller med en innledende denaturering ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av sykluser med 95 ° C i 1 min, 65 ° C i 1 min, og 72 ° C i 1 minutt, 27 sykluser, og en avsluttende forlengelsestrinn på 72 ° C i 10 min.
Cellemigrering assay ble mengden av utgangs cDNA justeres ved hjelp β-aktin intensitet.
evne av celler til å migrere gjennom filtrene ble målt ved anvendelse av en BioCoat Matrigel invasjon kammer (BD Biosciences, San Jose, CA). Cellekultur setter inn med en 8 um porestørrelse PET-membran ble anvendt i henhold til protokollen fra produsenten. I bunnkammeret inkludert medium (0,75 ml) inneholdende 10% FCS, mens SPARC- siRNA transfektert eller kontroll transfekterte celler (1,0 x 10 5 suspendert i 0,5 ml medium inneholdende 1% FCS) ble podet inn i det øvre kammer og inkubert over natten ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO 2. Remaning celler på den øvre overflate ble mekanisk fjernet. Membraner ble deretter vasket, fikset og farget med Diff-Quik (Medion Diagnostics). Antallet celler som migrerte til den undre overflate av filterne ble bestemt ved å telle fargede celler under et lysmikroskop i tre uavhengige felter (0,25 mm 2 /brønn).
Cellevekst og levedyktighet assay
effekten av SPARC- siRNA på levedyktigheten av cellene ble bestemt ved MTT-analyse. Kort fortalt ble MGC803 og HGC 27 celler belagt på 1 × 10 4 celler per brønn i nittiseks-brønners mikrotiterplater. Etter inkubering i 72 timer ble cellelevedyktigheten bestemt. Deretter 20 ul MTT (10 mg /ml i PBS lager, fortynnet til arbeidskonsentrasjon på 1 mg /ml med medium) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer. Etter nøye fjerning av mediet, ble 200 ul dimetylsulfoksid tilsatt til hver brønn og ristes nøye. Absorbansen ble innspilt på mikroplateleser (ELX 800, Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, USA) ved en bølgelengde 570 nm. Effekten av SPARC- siRNA på hemming av cellevekst ble vurdert som prosent cellelevedyktighet hvor bærerbehandlede celler ble tatt som 100% levedyktighet.
Cellesyklusanalyse og annexin V-farging
For flowcytometrisk cellesyklusanalyse ble cellene behandlet med siRNA ble oppsamlet, vasket med PBS, fiksert i kald 70% etanol og lagret ved -20 ° C til farging. Etter fiksering ble cellene vasket med PBS og inkubert med 50 ug /mL RNaseA (Sigma) i 30 minutter ved 37 ° C, før farging med 50 ug /mL propidiumjodid (Sigma). Apoptotiske celler i tidlige og sene stadier ble oppdaget ved hjelp av en annexin V-FITC apoptose Detection Kit fra BioVision (Mountain View, CA, USA). I korte trekk ble cellene transfektert med siRNA. Ved 96 timer etter transfeksjon, ble kulturmedier og cellene oppsamlet og sentrifugert. Etter vasking ble cellene resuspendert i 490 pl annexin V bindingsbuffer, etterfulgt av tilsetning av 5 ul annexin V-FITC og 5 mL propidium jodid. Prøvene ble inkubert i mørke i 5 minutter ved romtemperatur og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Statistisk
Resultatene ble uttrykt som midlere ekspresjonsnivåer (± SD). Student t
-test eller rang sum test ble brukt for statistisk analyse. En p-verdi < 0,05 ble tatt som signifikansnivå (tosidig).
Resultater
Uttrykk av SPARC i dyrkede magekreftceller
Vi først evaluert den endogene uttrykk for SPARC i flere menneskelige mage kreft cellelinjer. Vi fant at SPARC- protein og mRNA ble utbredt i MGC803 og HGC27 celler, ble fremstilt ved lavere nivåer ved SGC7901 cellelinje var undectable i NCI-N87 og BGC823 cellelinjer (figur 1). Figur 1 Uttrykk av SPARC i mage kreft cellelinjer. A, Immunoblot-analyse ved anvendelse av en kanin polyklonalt SPARC--antistoff (1: 500). B, spesifikk revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) -analyse for SPARC-. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. C, Relative SPARC mRNA uttrykk nivåer. Autoradiografer ble scannet og analysert ved densitometri, etterfulgt av mengdebestemmelse i forhold til p-aktin. Resultatene er vist som uttrykket (i%) i forhold til p-aktin, og er en anordning (± SD) av 3 forsøk.
Inhibering av endogen SPARC- uttrykk
Etter dette innledende screening, MGC803 celler og HGC27 celler som uttrykker relativt høye endogene SPARC- ble etablert knockdown uttrykker SPARC- på en forbigående måte for å fastslå betydningen av endogent SPARC- uttrykk. Som vist i figur 2A, ble SPARC- ekspresjon inhibert med SPARC- siRNA transfektanter i proteinnivåer. Disse resultatene antyder at disse SPARC- sirnas hell utøve en lyddemping effekt for SPARC- ekspresjon. Figur 2 Effekt av SPARC knockdown på celle migrasjon i mage kreft cellelinjer MGC 803 og HGC 27 celler. A. SPARC- ekspresjon i MGC 803 og HGC 27, kontroll og SPARC- siRNA transfekterte celler ble påvist ved immunblotanalyse ved anvendelse av et polyklonalt kanin SPARC--antistoff (1: 500). p-aktin ble brukt som lasting kontroll. B. Effekter av SPARC knockdown på celle migrasjon i mage kreft cellelinjer. SPARC uttrykk ble slått ned i MGC 803 og HGC 27 celler ved hjelp SPARC siRNA og utsatt for en migrasjon analyse ved hjelp av en to-kamret invasjon apparat som beskrevet i Materialer og metoder, histogram som viser prosent hemming av MGC 803 og HGC 27 celle invasjon. Forsøket ble gjort i tre eksemplarer og hentet fra egge siRNA transfekterte celler verdien ble satt til 100%
. Nedregulering av SPARC uttrykk hemmet magekreftceller invasjon in vitro
å finne ut om SPARC siRNA kan redusere protumorigenic cellulære atferd knyttet til SPARC uttrykk vi først bestemt effekten av redusert SPARC- ekspresjon på tumorcelle invasjon. Cell invasjon analysen ble så utført ved hjelp av Transwell kamre. Vi målte kapasiteten av mage-cancerceller å invadere gjennom Matrigel, en kunstig ekstracellulær matriks, etter transfeksjon med en ikke-målsøkende kontroll siRNA eller SPARC- siRNA. Redusert SPARC- uttrykk førte til inhibering av invasjon av 69% og 79% i MGC803 og HGC27, henholdsvis (figur 2B, C). Samlet utgjør disse resultatene viser tydelig at undertrykkelse av SPARC hemmer migrasjon og invasjon evne MGC803 celler og HGC27 celler.
Nedregulering av SPARC uttrykk hemmer veksten av magekreftceller in vitro
Vi undersøkte om SPARC siRNA kan redusere overlevelse av magekreftceller. MGC 803 og HGC 27 magekreftceller transfektert med SPARC- siRNA levde ved redusert relativt til passet celler transfektert med et ikke-målsøkende kontroll siRNA (figur 3A). Nedregulering av SPARC uttrykk fremkalte ikke cellesyklus arrest i magekreftceller. Vi undersøkte effekten av SPARC- siRNA på cellesyklusprogresjon. Stanse av SPARC- i MGC803 og HGC27 cellene endret seg ikke G1 eller S fase populasjoner ved 72 h posttransfection med SPARC- siRNA sammenlignet med den negative kontrollgruppen (figur 3B). Figur 3 Effekter av SPARC knockdown på cellevekst i mage kreft cellelinjer. Den venstre halvdelen data representerer data fra MGC 803 celler og de rette representerer data fra HGC 27 celler. A. Basal vekst ble bestemt etter 48 timer i komplett medium ved MTT-analyse. Resultatene er vist som midlere vekst (i%) av den respektive MGC 803 og HGC 27 cellelinje og er en anordning (± SE) av kvadruplikate bestemmelser fra seks separate forsøk. Celler fra de siRNA og kontrollgruppene ble oppsamlet for cytometri cellesyklusanalyse. B. stanse av SPARC av siRNA transfeksjon ikke endre cellesyklus distribusjon i MGC 803 og HGC 27 mage kreftceller. MGC 803 og HGC 27 celler ble transfektert med SPARC siRNA eller negativ kontroll siRNA. På 72 timer etter transfeksjon, ble DNA-innhold målt ved hjelp av propidiumjodid (PI) flekker på flowcytometri
. Hemming av SPARC uttrykk øker apoptose i magekreftceller
Vi undersøkte om SPARC siRNA kan indusere celledød i magekreft cellelinjer. Behandlingen av MGC803 og HGC27 celler med SPARC- siRNA øket tidlig apoptotiske celler samt sene apoptotiske celler, sammenlignet med negativ kontroll siRNA behandlingen (figur 4A) som målt ved hjelp av Annexin V-analysen. Som forventet, ble redusert overlevelse av cellene transfektert med SPARC- siRNA forbundet med økt forekomst av apoptose med 91% i MGC803 og 92% i HGC27 celler (figur 4B). Disse funnene antyder at SPARC- er involvert i apoptose for å opprettholde cellulær overlevelse i noen magekreftceller. Figur 4 SPARC knockdown resultater i induksjon av apoptose i mage kreft cellelinjer. For flowcytometrisk analyse ble cellene høstet 96 timer etter transfeksjon med SPARC siRNA eller negativ kontroll siRNA, deretter farget med annexin V-FITC og propidiumjodid (PI). Den venstre halvdelen data representerer data fra MGC 803 celler og de rette representerer data fra HGC 27 celler. Prosentandelene av annexin V /PI (tidlig apoptotiske) og annexin V /PI (sen apoptotiske) celler er vist i hvert panel. Verdier i fet skrift indikerer avtagende SPARC uttrykk økt apoptose med 65% i MGC803 og 92% i HGC27 sammenlignet med negativ kontroll siRNA.
Apoptotisk effekt av SPARC siRNA transfekterte behandling i MGC 803 og HGC27 celler
I et forsøk på å belyse mekanismen for SPARC- siRNA indusert apoptose i MGC 803 celler og HGC27 celler, ekspresjonsnivåene av apoptotisk-regulering proteiner som Bcl-2, Bax og caspase-3 og PARP ble evaluert. MGC 803 celler og HGC27 celler ble transfektert med SPARC siRNA. Som vist i figur 5, var det signifikante forskjeller i uttrykk for Bax og Bcl-2 i MGC 803 celler og HGC27 celler i sammenligning med den negative kontrollgruppen (P < 0,05 og P < 0,01). Som svar på apoptotiske stimuli, er procaspase-3 spaltet i et 20 kDa-fragment, og den etterfølgende autokatalytiske reaksjon fører til dannelse av den aktive 17 kDa-fragmentet. Når caspase-3 er aktivert, PARP spaltes. Således spaltning av PARP er brukt som en indikator på apoptose. For å oppnå direkte bevis som viser forholdet av kaspase-aktivering og apoptose, ble procaspase-3-spalting og PARP undersøkt i MGC 803 celler og HGC27 celler etter SPARC- siRNA transfektert. Som vist i figur 5, SPARC- siRNA indusert spaltning av 32 kDa procaspase-3 inn i dens aktive 17 kDa formen og spaltning av PARP vist i MGC 803 celler og HGC27 celler. Figur 5 Uttrykket av apoptose proteiner i MGC 803 og HGC27 celler etter transfeksjon med enten kontroll eller SPARC siRNA. Cellelysatene ble separert på 10% SDS-PAGE-gel, overført til nitrocellulosemembran og probet med anti-PARP, anti-caspase-3, anti-Bcl-2 og anti-Bax. Proteininnholdet ble normalisert ved undersøkelser av samme membran med anti-β-aktin. . Den venstre halvdelen data representerer data fra MGC 803 celler og de rette representerer data fra HGC 27 celler
Diskusjon
utskilt protein og rik på cystein, SPARC (også kjent som osteonectin, eller kjeller-membran-40 , BM-40), er et medlem av en familie av proteiner matricellular, hvis funksjon er å modulere celle-matriks-interaksjoner og cellefunksjon uten å delta i den strukturelle stillas av den ekstracellulære matriks. Overekspresjon av SPARC- er dokumentert i en rekke typer av faste tumorer, for eksempel bryst [7], prostata [8], melanom [9] og glioblastomer [10]. I motsetning til dette har lavere nivåer av SPARC- ekspresjon ble funnet i andre typer av kreftformer, slik som ovarie [11], kolorektal [12], bukspyttkjertel [13, 14] og akutt myelogen leukemi [15]. Disse observasjonene tyder på at tumorigent effekten av SPARC er celletype spesifikke og kan være avhengig av tumorcellen omgivelsene.
Kunnskap om SPARC funksjoner i mage kreftceller er fortsatt sparsom. Noen immunhistokjemiske studier [16-20, 22] kollektivt rapporterte en oppregulering av SPARC- i magekreft, sammenlignet med nonneoplastic mucosa. Wewer et al. [17] beskrev en differensial uttrykk for SPARC i epiteliale og stromal avdelinger av seks magekreft prøver. Maeng [18] fant at SPARC er sterkt uttrykt i reaktiv stroma assosiert med invasiv differensierte adenokarsinomer og at det kan tjene som et nyttig diagnostisk markør for magekreft. Wang et al. [16] fant også en forskjellig uttrykt SPARC i magekreftpasienter som vurderes av genet rekke analyse, kvantitativ RT-PCR, og farging, høyere SPARC uttrykk var signifikant assosiert med tumorprogresjon og de avanserte stadier av magekreft. Franke et al. [20] demonstrert på en større pasient serie som SPARC- blir uttrykt forskjellig i mage-kreftformer, og at dets ekspresjon korrelerer med tumorprogresjon og nodal spredning ved hjelp av microarray (TMA), nivået av ekspresjon av SPARC-, bestemt ved immunohistokjemi korrelert i intestinal-type magekreft med den lokale tumorvekst, nodal spredning, og tumorstadium ifølge International Union Against Cancer. Zhao ZS et al. [19] fant at SPARC ble oppdaget i 334 av 436 menneskelige mage krefttilfeller og ble sterkt uttrykt i 239 svulster. I trinn I, II og III, den 5-års overlevelse for pasienter med høy uttrykk for SPARC var betydelig lavere enn de i pasienter med lav uttrykk. Videre multivariat analyse antydet at oppregulering av SPARC, MMP-2, og inte beta1, var uavhengige prognostiske indikatorer for sykdommen.
Vi har samlet 49 mage kreft vev og tilsvarende normale vev gjennom kirurgiske prosedyrer (Jie Yin, Guowei Chen, Si Liu, Jianxun Zhao, Yucun Liu: uttrykk for SPARC i human magekreft er assosiert med kliniske-patologiske funksjoner, innsendt). Fordelingen og ekspresjon av SPARC- ble observert ved immunhistokjemi, Western blotting og RT-PCR, respektivt. SPARC- protein og mRNA uttrykt vesentlig høyere i magekreft vev sammenlignet med normale vev. Graden av dets ekspresjon var assosiert med differensiering av tumor, TNM divisjon, peritoneal såing og vaskulær invasjon bemerkelsesverdig. Pasienter med høyt uttrykk for SPARC har dårligere prognose enn de med lav uttrykk for SPARC.
Til sammen høyere SPARC uttrykk var signifikant assosiert med tumorprogresjon og avanserte stadier av magekreft. Nyere forskning av Inoue M et al [23] selv identifisert SPARC som kandidat mål antigen for immunterapi av ulike kreftformer blant annet magekreft ved genom-wide cDNA microarray. Det er spennende at terapi rettet mot SPARC subenheten kan være en nyttig måte å undertrykke magekreft vekst. Imidlertid er de molekylære mekanismene som er ansvarlig for onkogenese av SPARC i magekreft ikke helt forstått. Gjennom uttrykk analyse av et panel av magekreft cellelinjer, viste vi at SPARC er også overuttrykt i Sevel menneskelige mage kreft cellelinjer. Derfor testet vi våre hypoteser som SPARC kan være en nøkkelmolekyl i magekreft invasjon, og at målretting SPARC kan presentere en ny terapeutisk strategi for anti-invasjon av magekreft.
Formidling av kreftceller, enten lokalt eller på fjernt metastatisk nettsteder, krever at ondartede celler tilegne seg evnen til å invadere basalmembran og å følge andre matriser. Det har blitt foreslått at SPARC- kan spille en nøkkelrolle i de innledende trinn i prosessen av tumorinvasjon og metastase [24]. I tillegg kan SPARC- indusere ekspresjon av metalloproteinase eller enzymer som deretter spiller en viktig rolle i nedbrytningen av basalmembraner og ekstracellulære matrikskomponenter [25]. SPARC ble assosiert med invasivitet av meningeomer [26, 27] og hjernesvulst [28]. Videre undertrykkelse av SPARC uttrykk ved hjelp av antisense RNA hemmet bevegelighet og invasjon av menneskelige brystkreft celler in vitro [21].
Å finne ut om SPARC siRNA kan redusere protumorigenic cellulære atferd knyttet til SPARC uttrykk, må vi først bestemmes effekten av redusert SPARC uttrykk på tumorcelle invasjon. Vi målte kapasiteten av mage-cancerceller å invadere gjennom Matrigel, en kunstig ekstracellulær matriks, etter transfeksjon med SPARC- siRNA eller et ikke-målsøkende kontroll siRNA. Redusert SPARC- uttrykk førte til inhibering av invasjon av 69% og 79% i MGC803 og HGC27, respektivt. Dermed kan SPARC siRNA redusere magekreft invasjon in vitro., En fersk studie fant at SPARC beskytter celler fra stress indusert apoptose in vitro gjennom et samspill med inte ß1 heterodimerer som forbedrer ILK aktivering og prosurvival aktivitet [28]. Innledende studier med antisense RNA strategier helt avskaffet menneskelig melanom vekst i hårløse mus [21]. Horie et al. [29] viste at nedregulering av SPARC uttrykk indusert veksthemming med G 1 arrest i humane melanomceller. Det har blitt rapportert at SPARC- fremmer celleoverlevelse gliom gjennom Akt aktivering via integrin signalisering under serumfrie betingelser [30]. Disse rapportene sterkt at SPARC spiller en rolle som en antistress faktor.
På den annen side, noen artikler funnet at SPARC kan fremme apoptose i kreftceller. Yiu og kolleger [11] viste at eksogene behandling av ulike eggstokkreft cellelinjer med SPARC indusert apoptose. Said og Motamed [31] fant SPARC eksponering økt kløyvet caspase 3 i menneske ovarialcancer celler som støttet den tidligere observasjon. Bukspyttkjertelen [13] og eggstokkreft [30] viste større vekst og redusert apoptose når implantert i SPARC - /-. I kolorektal kreft-cellelinjer, overekspresjon av SPARC- redusert cellelevedyktighet og økt apoptose i celler eksponert for forskjellige kjemoterapeutiske midler [32].
Disse tilsynelatende paradoksale observasjonene innenfor hver type kreft, og på tvers av forskjellige kreftformer kan forklares ved Tai forståelse av SPARC- biologi [33]: mindre peptidfragmenter av SPARC representerer forskjellige domener av SPARC konferere biologiske aktiviteter som til tider er imot de andre fragmenter eller mors SPARC protein. Siden protease profilen av svulsten mikromiljøet kan være forskjellig i forskjellige typer av kreft, og som SPARC- er kjent for å gjennomgå proteolyse av matriksmetalloproteinaser [34], disse forskjellene, i kombinasjon med endringer i den lokale sammensetningen av matriks-molekyler og cytokiner, kan alle være å bidra til den komplekse atferden til SPARC i ulike typer kreft.
å belyse virkningene av SPARC siRNA på magekreft cellevekst, ble MTT spredning analyse utført for å sammenligne spredning mellom SPARC siRNA transfekterte og kontroll transfektert MGC803 og HGC 27 celler. MGC803 og HGC27 mage kreft celler transfektert med SPARC siRNA levde ved redusert priser i forhold til matchede celler transfektert med et ikke-måls kontroll siRNA (figur 3). Den reduserte overlevelse av cellene transfektert med SPARC- siRNA var assosiert med økt forekomst av apoptose målt ved Annexin V-analysen. Avtagende SPARC- ekspresjon økt apoptose med 91% i MGC803 og 92% i HGC27 (figur 4B).
Aktive caspaser spiller en viktig rolle i induksjon av apoptose. Når caspase-3 ble aktivert, PARP spaltet sent. Vanligvis spaltingen av PARP ble anvendt som en indikator for apoptose. I denne studien fant vi SPARC siRNA aktivert caspase-3 for å produsere spaltede caspase-3 (p17) fragmenter i MGC 803 celler og HGC 27 på 48 timer. På samme tid, ble spaltingen av PARP også detektert. Resultatene indikerer at SPARC- indusert fragmentering av PARP, så vel som økt caspase-3 aktivitet i MGC 803 celler.
Bcl-2-familieproteiner har blitt rapportert å regulere apoptose ved styring av mitokondriemembranen permeabilitet. SPARC- opp regulert ekspresjon av Bax og ned regulert ekspresjon av Bcl-2 i MGC 803 celler og HGC 27 celler. Vi fant at SPARC- siRNA kan indusere gastrisk kreft celle apoptose og samtidig redusere forholdet av Bcl-2 til Bax. Derfor kan regulering av Bcl-2 og Bax uttrykk være en nøkkelmekanisme underliggende SPARC- induksjon av apoptose i magekreftceller.
Så våre data indikerte at nedregulering av SPARC- hemmet celleproliferasjon av magecancerceller ved apoptose initiering, som samvittighets med melanom og glioma, men i motsetning til eggstokkreft og kreft i bukspyttkjertelen. Induksjonen av apoptose ble delvis regulert til mitokondriell reaksjonsvei for eksempel aktiverings caspase veien, så vel som spalting av PARP. Fremtidige studier må fokusere på den eksakte mekanismen.
Konklusjonen vår nåværende data antydet at SPARC spilt viktige roller i apoptose og metastasering av magekreft. I dag finnes det ingen effektive metoder for herding sent stadium magekreft. Som forhøyet SPARC uttrykk er forbundet med redusert magekreft pasient overlevelse [16], tror vi at våre resultater, demonstrere redusert invasjon og økt celledød med siRNA rettet mot SPARC, tyder på at mink SPARC uttrykk kan ha terapeutisk effekt for mage kreftpasienter.
Erklæringer
Takk
Dette arbeidet ble støttet av National Scientific Technologic støtte prosjektet Fund [30901417]. Vi takker professor Yang Ke og Xiaojuan Du Peking University Health Science Centre, Beijing, Kina, for teknisk support.
Forfatter opprinnelige legges filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes opprinnelige innsendte filer for bilder. 13046_2010_306_MOESM1_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 1 13046_2010_306_MOESM2_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 2 13046_2010_306_MOESM3_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 3 13046_2010_306_MOESM4_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 4 13046_2010_306_MOESM5_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 5 konkurrerende interesser
forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser.

• Metallothionein 2A hemmer NF-kB sti aktivering og spår klinisk utfall segregert med TNM stadium i mage kreftpasienter etter radikal reseksjon
• Deep sekvensering av magekreft avslører somatiske mutasjoner som er relevante for personlig medicine