Downregulációját SPARC kifejezés csökkenti a gyomorrák sejt invázió és a túlélés

Downregulációját SPARC kifejezés csökkenti a gyomorrák sejt invázió és a túlélés katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa kiválasztott fehérje savas és gazdag cisztein (SPARC) kulcsszerepet játszik a fejlesztés számos szövetben és szervben típusok. Aberráns SPARC expressziót találtunk a legkülönbözőbb emberi rákos megbetegedések, hozzájárul a daganat fejlődését. Mivel a SPARC találták, hogy túl expresszálódik humán gyomorrák szövet, ezért azt, hogy vizsgálja meg a kifejezés a SPARC a gyomorrák vonalak és a rákkeltő mechanizmusokat.
Módszerek
SPARC expressziót értékeltük egy panel a humán gyomor rákos sejtvonalak . MGC803 és HGC 27 gyomorrák sejtvonalak magas szintű SPARC tranziens transzfektált SPARC-specifikus kis interferáló RNS-ek, és ezt követően értékelni hatások invázióját és proliferációját. Katalógusa Eredmények katalógusa kis interferáló RNS által közvetített akciós SPARC a MGC803 és HGC 27 gyomorrák sejtek drasztikusan csökkent invázió. Kiütése SPARC is megfigyelhető volt, hogy jelentősen növelje a apoptózist MGC803 és HGC 27 gyomorrák sejtek, mint a kontroll csoportban transzfektált. Katalógusa Következtetések katalógusa Adataink szerint mTOR gátlása miatt csökken a SPARC gátolja terjedését és növekedését az emberi gyomor rákos sejteket. Így megcélzása SPARC lehet egy hatékony terápiás megközelítés, szemben a gyomorrák.
Bevezetés
gyomorrák a második vezető oka a rák összefüggő halálesetek világszerte, és az egyik leginkább agresszív tumorok és gyakran társul nyirokcsomó metasztázis, peritoneális terjesztés és hematogén metasztázis [1]. Összességében 65-70% az új esetek és a halálesetek gyomorrák előfordulnak kevésbé fejlett országokban [2]. 2005-ben az előfordulási aránya gyomorrák (0,3 millió haláleset és 0,4 millió új eset) a harmadik helyen az egyik leggyakoribb daganatos megbetegedés a China [3]. Jelenlegi terápiák előrehaladott állapotban vagy áttétes gyomorrák csekély hatása, sebészi eltávolítás reszekció szomszédos nyirokcsomók kínálja az egyetlen esélye a gyógyulásra, ami kevesebb, mint 33% -ánál a gyomorrák. Az 5 éves túlélés 30-40%, de rosszabb prognózisával előrehaladott daganatok. Megértése molekuláris mechanizmusok mögöttes progressziójának gyomorrák nyújthat betekintést új terápiás célpontokat.
Kiválasztott fehérje savas és gazdag cisztein (SPARC; más néven oszteonektin vagy BM-40) tartozik, a matricellular család szekretált fehérjék [4 ]. SPARC egy nem szerkezeti komponense extracelluláris mátrixok, amely modulálja a sejt-mátrix kölcsönhatásokat, különösen a szövet kialakítása, átalakítása és javítási [5]. Számos típusú rákos megbetegedések jellemzi serkentett expresszióját SPARC [6]. Overexpressziója SPARC leírták többféle szilárd tumorok, mint például a mell [7], a prosztatában [8], a melanoma [9] és glioblasztómák [10]. Ezzel szemben, az alacsonyabb szinteken a SPARC kifejezés találtak más típusú rákok, mint például a petefészek [11], a kolorektális [12], a hasnyálmirigy [13, 14], és akut mielogén leukémia [15]. Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy tumorkeltő hatása SPARC sejttípus-specifikus, és lehet függő a tumorsejt környezetével.
Ismeretek SPARC funkciók gyomorrák-sejtek még mindig ritka. Túltermelése SPARC gén észleltek humán gyomorrák öt másik jelentés [16-20]. Azonban az összes fent említett tanulmányok nem voltak részletesen gyomorrák sejtvonalakon és rákkeltő mechanizmus. SPARC kapcsolatba hozták agresszív szakaszában gyomorrák és korrelál a gyenge prognózissal [16], ami azt sugallja, hogy a csökkentés SPARC expresszió terápiás előny. Valóban, expressziója elleni antiszensz oligonukleotidok, SPARC melanoma sejtekben blokkolja a tumorképződést [21]. A pontos biológiai és molekuláris mechanizmusok, amelyeken keresztül a csökkentése SPARC kifejezés talán hozzájárulhat a jobb tumor terápia még meg kell vizsgálni. Ezért a cél a jelen tanulmány volt, hogy jellemezzük a SPARC funkciókat gyomor rákos sejteket, és fedezze annak esetleges rákkeltő mechanizmus.
Anyagok és módszerek
Sejttenyésztés
humán gyomorrák sejtvonalakon NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 kaptuk a Cancer Institute of kínai Tudományos Akadémia Orvostudományi. Minden sejteket RPMI 1640-ben (GIBCO ™) táptalajban, amely 10% magzati borjú szérumot, penicillin G-t (100 egység /ml) és sztreptomicint (100 ng /ml) nevezik komplett tápközegben. Sejteket tartottunk fenn egyrétegű tenyészetben 37 ° C hőmérsékleten nedvesített levegő, 5% CO 2.
Vegyszerek és reagensek
EDTA-2-nátrium, akridin narancs, etidium-bromid (EB) és 3- [4, 5-dimetil-tiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazoliumbromide (MTT) a Sigma cégtől (St. Louis, MO, USA). Egér monoklonális antitest specifikus p-aktin volt a Sigma. Nyúl poliklonális antitestek specifikus Bcl-2 (sc-492), a kaszpáz-3 (SC-7148) és a PARP (SC-7150) adunk a vásárolt a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Egér monoklonális antitestek specifikus SPARC (SC-74295), és Bax (SC-7480) kaptuk a Santa Cruz Biotechnology. Kecske anti-nyúl (w3960) és anti-egér (w3950) másodlagos antitesteket vásárolt Promega (Madison, WI, USA).
RNSi és transzfekciós
Emberi SPARC siRNS és kontroll siRNS voltak Dharmacon Bioscience Corp (Chicago , IL, USA). Ekvimoláris mennyiségű siRNS használtunk, mint egy a gyártó utasításai kontroll nem-célzott siRNS (CTRL). A 150 000 sejtet szélesztünk Hat jól DMEM, 10% FBS-sel és hagytuk megtapadni egy éjszakán át. Ekvimoláris mennyiségű siRNS inkubáltuk tranzit TKO transzfekciós reagens Mirus (Madison, WI, USA), mint egy a gyártó utasításainak megfelelően. A sejteket 48 órán előtt kísérletek, kivéve, ha másként ismertetjük
Western-blot-analízis
húsz mikrogramm teljes fehérjéket elválasztottuk SDS-PAGE és vittük át PVDF membránra. A membránt ezután inkubáltuk specifikus antitestekkel SPARC (Santa Cruz; 1: 500), vagy anti-β-aktin (Sigma, 1: 1000) egy éjszakán át 4 ° C-on. A kötött antitesteket láthatóvá alkalmazásával fokozott kemilumineszcencia. Annak igazolására, egyenlő Betöltés a membránokat lehúztuk 30 percen át 50 ° C-pufferben, amely 2% SDS-t, 62,5 mM Tris (pH = 6,7) és 100 mM 2-merkapto-etanol, és újrapróbáztuk anti-β-aktin-antitest bizonyítani egyenlő loading . A sűrűsége a sávok mennyiségileg denzitometriás analízissel ImageTool (version 3.0) rendszer.
RT-PCR
Az összes RNS-t (1-2 ng) reverz transzkripció révén Superscript preamplifikációs kit (Invitrogen, Carlsbad , CA). Láncindítókat alapuló sorozatok beszámolt génbank (NM 003118). SPARC értelemben szekvencia 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'és SPARC antiszensz szekvencia 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3'. A várt terméket mérete SPARC cDNS 512bp. SS-aktin értelemben szekvencia 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'és az SS-aktin antiszensz szekvencia 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. A várt terméket mérete ß-aktin cDNS 514bp. PCR amplifikálást végeztünk 25

• Metallotionein 2A gátolja az NF-kB útvonal aktiválása és megjósolja a klinikai eredmény szegregált a TNM a gyomorrákos betegek következő radikális resection
• Mély szekvenálása gyomorrák kiderül szomatikus mutációk fontos a személyre szabott orvoslás