Downregulation SPARC išraiška mažėja skrandžio vėžio ląstelių invazija ir survival

downregulation SPARC išraiška mažėja skrandžio vėžio ląstelių invaziją ir išlikimą
tezės
Background pervežimas baltymas rūgštus ir turtingas cisteinu (SPARC) vaidina svarbų vaidmenį kuriant iš daugelio audinių ir organų rūšys. Netipinė SPARC išraiška buvo rasta įvairių žmogaus vėžio, prisideda prie auglių vystymuisi. Kadangi buvo nustatyta SPARC būti ekspresija žmogaus skrandžio vėžio audinio, todėl mes ištirti SPARC išraišką skrandžio vėžio linijų ir kancerogeninių mechanizmus.
Metodai
SPARC išraiška buvo įvertintas žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų skydelyje , MGC803 ir HGC 27 skrandžio vėžio ląstelių linijas, išreiškiantys aukšto lygio SPARC buvo laikinai perkeltų su SPARC konkrečių mažų trukdančių RNR, o vėliau įvertintas už poveikį invazija ir platinimu.
Rezultatai
sirnr tarpininkaujant triuškinantis iš SPARC į MGC803 ir HGC 27 skrandžio vėžio ląstelės dramatiškai sumažino savo invaziją. Nokdaunas iš SPARC taip pat buvo pastebėta, kad ženkliai padidinti MGC803 ir HGC 27 skrandžio vėžio ląstelių, lyginant su kontrolinės grupės transfekuota apoptozę.
Išvados
mūsų duomenų matyti, kad downregulating iš SPARC slopina invazija ir augimą žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Taigi, tikslingumas SPARC gali būti veiksminga gydomoji požiūris prieš skrandžio vėžio.
Įžanga
Skrandžio vėžys yra antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirčių visame pasaulyje ir yra vienas iš agresyviausių piktybinių navikų yra dažnai susijęs su limfmazgiuose metastazės, pilvaplėvės platinimas ir hematogenous metastazės [1]. Apskritai, 65-70% naujų atvejų ir mirčių nuo skrandžio vėžio įvyksta mažiau išsivysčiusiose šalyse [2]. 2005 Sergamumas skrandžio vėžiu (0,3 milijonai žmonių ir 0,4 mln naujų atvejų) užėmė trečią vietą tarp labiausiai paplitusių vėžio Kinijoje [3]. Dabartiniai terapija įpusėjęs arba skrandžio vėžiui turi mažai įtakos, chirurginis pašalinimas rezekcijos gretimų limfmazgių siūlo vienintelė galimybė išgydyti, kuri yra mažesnė nei 33% pacientų, sergančių skrandžio vėžiu. 5 metų išgyvenamumas yra tik 30-40%, su prastesne prognozės pažengusiems navikų. Supratimas molekulinius mechanizmus, sukeliančius skrandžio vėžio gali teikti įžvalgas naujų terapinių tikslų progresavimą
baltymas rūgštus ir daug cisteino (SPARC; taip pat žinomas kaip osteonectin ar BM-40). Priklauso matricellular šeimos išskiriami baltymai [4 ]. SPARC yra nestruktūrinių komponentas ekstraląsteliniuose matricų, kad moduliuoja ląstelių matrica sąveiką, ypač per audinių vystymosi, rekonstruoti ir remontas [5]. Daugelis rūšių vėžio pasižymi aktyvinama išraiška SPARC [6]. Raiškos iš SPARC buvo užfiksuota keliais tipų solidinių navikų, tokių kaip krūties [7], prostatos [8], melanomos [9] ir glioblastomos [10]. Priešingai, žemesnio lygio SPARC išraiškos buvo rasta kitų rūšių vėžio, pavyzdžiui, kiaušidžių [11], storosios žarnos [12], kasos [13, 14] ir ūminės mieloidinės leukemijos [15]. Šios pastabos rodo, kad tumorogeniškas poveikis SPARC yra ląstelių tipo konkrečių ir gali būti priklausomas nuo naviko ląstelės supančiai aplinkai.
Žinias apie SPARC funkcijų skrandžio vėžio ląstelių vis dar nedaug. Padidėjusi SPARC geno buvo pastebėtas žmogaus skrandžio vėžio per penkerius kitų pranešimų [16-20]. Tačiau, visų aukščiau minėti tyrimai neturėjo detalę skrandžio vėžio ląstelių linijų ir kancerogeninio mechanizmo. SPARC buvo susijęs su agresyviais etapuose skrandžio vėžio ir koreliuoja su prastos prognozės [16], kuriame teigiama, kad "SPARC raiškos sumažinimas gali turėti terapinę naudą. Iš tiesų, išraiška antiprasmiai prieš SPARC melanomos ląstelių užblokuotas auglio susidarymą [21]. Tikslios biologiniai ir molekuliniai mechanizmai, per kurią į SPARC raiškos sumažinimas gali prisidėti prie geresnės naviko gydymo dar reikia ištirti. Todėl šio tyrimo tikslas buvo apibūdinti SPARC funkcijas skrandžio vėžio ląsteles ir ištirti jos galbūt kancerogeninė mechanizmą.
Medžiagos ir metodai
ląstelių kultūros
žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijos NVI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 buvo gauti iš vėžio instituto Kinijos mokslų akademijos medicinos mokslų. Visos ląstelės buvo auginamos rmpi 1640 (GIBCO ™) terpę papildyta su 10% vaisiaus galvijų serumo, penicilino G (100 vienetų /ml), ir streptomicino (100 mikrogramų /ml), vadinamą užbaigtą laikmena. Ląstelės buvo prižiūrimi vienasluoksnę kultūros 37 ° C drėkinamame ore su 5% CO 2.
Cheminių medžiagų ir reagentų
EDTA 2 natrio, akridino oranžinė, etidžio bromidas (EB) ir 3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenilo tetrazoliumbromide (MTT) buvo nupirkta iš Sigma (St Louis, MO, JAV). Pelės monokloniniai antikūnai, specifiški, kad beta-aktino buvo iš Sigma. Triušis polikloniniai antikūnai specifiniai BCL-2 (SC-492), kaspazės-3 (SC-7148) ir PARP (SC-7150) buvo nupirkta iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, JAV). Pelės specifinės SPARC (SC-74295) ir Bax (SC-7480) monokloniniai antikūnai buvo gauti iš Santa Cruz Biotechnology. Ožkos kovos su triušiena (w3960) ir anti-pelės (w3950) antriniai antikūnai buvo įsigytas iš PROMEGA (Madison, WI, JAV).
RNAi ir transfekcijq
žmogaus SPARC siRNA ir kontrolės siRNA buvo iš Dharmacon biologijos mokslų Corp (Čikaga , IL, JAV). Ekvimoliarinis kiekiai siRNAs buvo naudojami pagal gamintojo instrukcijas su valdymo ne orientacija siRNA (CTRL). 150 000 ląstelės buvo padengtas per šešių gerai DMEM su 10% FBS ir buvo leista pritvirtinti per vieną naktį. Ekvimoliarinis kiekiai siRNAs buvo inkubuojami su tranzitu-TKO transfekcijq reagentą iš Mirus (Madison, WI, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Ląstelės buvo išlaikytos 48 h iki eksperimentų, jeigu kitaip nenurodyta
Western Blot analizės
Dvidešimt mikrogramų bendrųjų baltymų buvo atskirtos SDS-PAGE ir patenka ant spausdinamo PVDF membrana. tada to membraną su specifinį SPARC antikūnų (Santa Cruz; 1: 500), arba anti-beta-aktino (sigma; 1: 1000) per naktį 4 ° C temperatūroje. Rasta antikūnai buvo ryškinamos naudojant sustiprintą chemiliuminescenci. Patvirtinti vienodą krovimo, Membranos buvo atidengti nuo 30 minučių 50 ° C temperatūroje buferis, kurioje yra 2% SDS, 62,5 mmol Tris (PH 6,7), ir 100 mm 2-merkaptoetanolio ir reprobed su anti-beta-aktino antikūno į įrodyti vienodą pakrovimo , Iš juostų tankis buvo įvertintas densitometric analizę, naudojant ImageTool (versija 3.0) sistemos.
AT-PGR
viso RNR (1-2 mikrogramų) buvo atvirkštinis transponuoti naudojant viršuje anksto stiprinimo komplektas (INVITROGEN, Carlsbad , CA). Gruntai buvo grindžiami sekų pranešta apie augalų genų banke (NM 003.118). SPARC jausmas seka buvo 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 "ir" SPARC prieš jausmas seka 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3 ". Numatoma produkto dydis SPARC kDNR buvo 512bp. SS-aktino jausmas seka buvo 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 "ir SS-aktino prieš jausmas seka 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3". Numatoma produkto dydis SS-aktino kDNR buvo 514bp. PGR amplifikacija buvo atlikta 25 mikrol, reakcijos tūrių, kurių sudėtyje yra 0,2 mkm dNTP, 20 pmol kiekvieno oligonukleotidų gruntas, ir 0.2U Tag polimerazės PGR buferio. kDNR buvo amplifikuotas ant PGR šilumos reguliatoriumi pagal pradinio denatūruojant 95 ° C temperatūroje 5 min, o po to ciklų 95 ° C temperatūroje 1 min, 65 ° C temperatūroje 1 min, ir 72 ° C temperatūroje 1 min, 27 ciklų, ir galutinis išplėtimas žingsnis 72 ° C temperatūroje 10 min. Pradinių kDNR suma buvo patikslinta naudojant beta-aktino intensyvumą.
Mobilusis migracijos tyrimas
ląstelių gebėjimą migruoja per filtrus buvo matuojamas naudojant BioCoat Matrigel invazija kamerą (BD biomokslų, San Chosė, CA). Ląstelių kultūros įterpia su 8 mkm porų dydis PET membrana buvo naudojami pagal gamintojo protokolą. Apatinė kamera įtraukti terpę (0,75 ml) yra 10% FCS, kadangi SPARC siRNR perkeltų ar kontrolės perkeltų ląstelių (1,0 × 10 5 suspenduotos 0,5 ml terpėje, turinčioje 1% FCS) buvo pasėjamos į aukštutinį kambarį ir inkubuojami per naktį 37 ° C drėgnoje atmosferoje sudėtyje yra 5% CO 2. Remaning ląstelės ant viršutinio paviršiaus buvo mechaniškai pašalinti. tada Membranos nuplauti, fiksuotas, o susitepę Diff-Quik (Medion diagnostika). Ląstelių, kad perkeltų į apatinio paviršiaus ir augalų filtrų buvo nustatytas skaičiuojant dažytų ląsteles pagal šviesos mikroskopu, į trijų nepriklausomų laukų skaičius (0,25 mm 2 /duobutėje).
Ląstelių augimas ir gyvybingumo tyrimą,
poveikis SPARC siRNR dėl ląstelių gyvybingumo buvo nustatomas pagal MTT. Trumpai tariant, MGC803 ir HGC 27 ląstelių buvo padengtas ne 1 × 10 4 ląstelės per gerai devyniasdešimt šešios duobučių mikrotitro lėkšteles. Po to, kai inkubacijos 72 h, esant ląstelių gyvybingumas buvo nustatomas. Tada 20 mikrol MTT (10 mg /ml PBS sandėlyje, praskiestas iki darbo koncentracijos 1 mg /ml su žiniasklaida) buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį ir inkubuojami 4 h. Po to, kai pašalinti atsargiai terpę, 200 mikrol, dimetilsulfoksidas buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį ir atsargiai purtomas. Absorbcija buvo įrašyta mikroplokštelės skaitytojui (ELX 800; Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, JAV) vienu 570 nm bangos ilgiui. Iš SPARC siRNA poveikis ląstelių augimo slopinimo buvo įvertintas kaip ląstelių gyvybingumo procentinės kur vehicle elgiamasi ląstelės buvo imtasi kaip 100% perspektyvus.
Ląstelės ciklo analizės ir aneksinu dažymo
Dėl tekmės citometrijos ląstelių ciklo analizės, ląstelės gydomi siRNR buvo surinkti, plaunamas PBS, nustatyta iš šalto 70% etanolio, ir laikomi -20 ° C temperatūroje, kol dažymo. Po to, kai fiksavimo, ląstelės buvo išplauti su PBS ir inkubuojami su 50 mikrogramų /mL RNaseA (Sigma), 30 min 37 ° C temperatūroje, prieš dažant 50 mikrogramų /mL propidiumo jodido (Sigma),. Apoptozinės ląstelės pradžioje ir pabaigoje etapais buvo aptikta naudojant aneksinu-FITC apoptozę nustatymo rinkinys nuo BioVision (Mountain View, CA, JAV). Trumpai tariant, ląstelės buvo transfekuota su siRNA. 96 h po transfekciją, kultūros terpės ir ląstelės buvo renkami ir centrifuguojama. Po plovimo, ląstelės buvo resuspenduotos 490 pL ir prie aneksino V privalomą buferio, o po to 5 pL aneksino V-FITC ir 5 pL propidiumo jodido Be to. Mėginiai buvo inkubuojamos tamsoje 5 min kambario temperatūroje ir analizuojami naudojant tėkmės citometrijos.
Statistics
rezultatai buvo išreikštas reiškia ekspresijos lygį (± SD). Stjudento t
-test ar rangas suma testas buvo naudojamas statistinės analizės. P-vertė < 0,05 buvo laikomas lygio reikšmės (dvipusis).
Rezultatai
išraiška SPARC kultūroje skrandžio vėžio ląstelių
Mes pirmą kartą įvertino endogeninio išraišką SPARC keliose žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas. Mes nustatėme, kad "SPARC baltymų ir iRNR buvo paplitę MGC803 ir HGC27 ląsteles, buvo pagaminta žemesniuose lygmenyse pagal SGC7901 ląstelių linijos buvo undectable į NVI-N87 ir BGC823 ląstelių linijų (1 paveikslas). 1 pav išraiška SPARC skrandžio vėžio ląstelių linijas. A, Imunoblotingas naudojant triušio polikloninio SPARC antikūną (1: 500). B Konkretus atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininė reakcija (PGR) analizė SPARC. beta-aktino buvo naudojamas kaip krovimo valdymu. C, santykinis SPARC iRNR raiška lygiai. Autoradiographs buvo nuskaitomi ir analizuojami densitometrija po kiekybinio palyginti su beta-aktino. Rezultatai rodomi kaip išraiškos (į%), palyginti su beta-aktino ir priemonės (± SN) 3 eksperimentus.
Slopinimas endogeninio SPARC išraiškos
Po pirmosios atrankos, MGC803 ląstelės ir HGC27 ląstelės išreiškia gana aukštą endogeninių SPARC buvo įkurta triuškinantis išreikšti SPARC į trumpalaikį būdu nustatyti endogeninio SPARC išraiškos svarbą. Kaip parodyta 2A pav, SPARC išraiška buvo slopinamas su SPARC siRNA transfectants baltymų lygius. Šie rezultatai rodo, kad šie "SPARC siRNAs sėkmingai daro triukšmo slopinimo poveikį SPARC išraiška. 2 pav poveikis SPARC triuškinantis ant ląstelių migraciją skrandžio vėžio ląstelių linijų MSV 803 ir HGC 27 ląstelių. A. SPARC išraiška MGC 803 ir HGC 27, kontrolės ir SPARC siRNA perkeltų ląstelių buvo aptikta Imunoblotingas naudojant triušis polikloninį SPARC antikūnas (1: 500). beta-aktino buvo naudojamas kaip krovimo valdymu. B. Poveikis SPARC triuškinantis apie ląstelių migraciją skrandžio vėžio ląstelių linijų. SPARC išraiška buvo nuversta į MGC 803 ir HGC 27 ląstelių naudojant SPARC siRNA ir pateikti migracijos tyrimą, naudojant dviejų kamerų invazija aparatą, kaip aprašyta medžiagas ir metodus, histograma rodo proc slopina MGC 803 ir HGC 27 ląstelių invazija. Eksperimentas buvo atliekamas tris kartus ir gavo iš plakta siRNA perkeltų ląstelių vertė buvo nustatyta kaip 100%.
Downregulation SPARC išraiškos slopina skrandžio vėžio ląstelių invaziją in vitro
Norėdami nustatyti, ar "SPARC siRNR gali sumažinti protumorigenic ląstelių elgesį, susijusius su SPARC išraiška, mes pirmiausia lėmė sumažėjęs SPARC raiškos poveikį naviko ląstelių invaziją. Mobilusis invazija tyrimas buvo tada atliekamas naudojant Transwell kameras. Mes matuojamas skrandžio vėžio ląstelių gebėjimą įsiveržti per Matrigel, dirbtinio tarpląsteliniame po transfekciją su ne orientacijos valdymo siRNA ar SPARC siRNA. Sumažėjęs SPARC išraišką atvedė prie invazijos slopinami 69% ir 79% į MGC803 ir HGC27, atitinkamai (2b pav, C). Kartu paėmus, šie rezultatai aiškiai rodo, kad iš SPARC slopinimas stabdo migracijos ir invazija gebėjimas MGC803 ląstelių ir HGC27 ląsteles.
Downregulation SPARC išraiškos slopina augimą skrandžio vėžio ląsteles in vitro
Mes ištirti, ar "SPARC siRNR gali sumažinti išlikimo skrandžio vėžio ląsteles. MGC 803 ir HGC 27 skrandžio vėžio ląstelės transfektuotose SPARC siRNA išgyveno ne sumažėjusiu santykiniu į suderintų ląstelių transfektuotose ne orientacija kontrolės siRNA (3A pav) normas. Downregulation SPARC išraiškos nesukėlė ląstelės ciklo arešto skrandžio vėžio ląsteles. Mes išnagrinėjo SPARC siRNA poveikį ląstelių ciklo progresavimo. Triukšmo slopinimo SPARC į MGC803 ir HGC27 ląstelių nepakeitė G1 arba S fazių populiacijas 72 h posttransfection su SPARC siRNA lyginant su neigiamos kontrolinės grupės (3b pav.) 3 pav effects SPARC triuškinantis ląstelių augimui skrandžio vėžio ląstelių linijas. yra kairėje pusėje duomenys yra duomenys, gauti iš MGC 803 ląsteles ir tiks atstovauti duomenis, gautus iš HGC 27 ląstelių. A. Bazinis augimą lėmė po 48 h visiškai priemonėje MTT. Rezultatai rodomi kaip vidutinis augimas (%) atitinkamo MSV 803 ir HGC 27 ląstelių linijos ir yra priemonės (± SE) egzemplioriais nustatymų iš šešių atskirų eksperimentų. Ląstelės iš siRNA ir kontrolinėje grupėse buvo renkami citometrijos ląstelių ciklo analizę. B. Triukšmo slopinimo ir SPARC iki siRNA transfekciją nepakeitė ląstelės ciklo pasiskirstymą MGC 803 ir HGC 27 skrandžio vėžio ląsteles. MGC 803 ir HGC 27 ląstelių buvo pernešta su SPARC siRNA ar neigiamos kontrolės siRNA. 72 h po transfekcijq DNR kiekis buvo matuojamas naudojant propidiumo jodido (PI) dėmių ant tėkmės citometrijos.
Slopinimas SPARC išraiškos gerina apoptozę skrandžio vėžio ląstelių
Mes tyrėme, ar SPARC siRNR gali sukelti ląstelių žūtį skrandžio vėžio Mobilaus ryšio linijos. Iš MGC803 ir HGC27 ląstelių gydymas SPARC siRNA padidėjo anksti apoptozinių ląsteles, taip pat pavėluotus apoptozinių ląsteles, palyginti su neigiamos kontrolės siRNR gydymo (4a pav), kaip matuojamas aneksinu tyrimu. Kaip ir tikėtasi, sumažėjo išlikimo ląstelių transfektuotose SPARC siRNA buvo susijęs su padidėjusiu normos apoptozės 91% į MGC803 ir 92% į HGC27 ląstelių (4b pav.) Šie rezultatai rodo, kad "SPARC dalyvauja apoptozės išlaikyti ląstelių išgyvenimą kai skrandžio vėžio ląsteles. 4 pav SPARC triuškinantis rezultatus sukeliama apoptozė skrandžio vėžio ląstelių linijas. Dėl tekmės citometrijos analize, ląstelės buvo nuimta 96 h po transfekciją su SPARC siRNA ar neigiamos kontrolės siRNA, tada tamsintas su aneksinu-FITC ir propidiumo jodido (PI). yra kairėje pusėje duomenys yra duomenys, gauti iš MGC 803 ląsteles ir tiks atstovauti duomenis, gautus iš HGC 27 ląstelių. Į aneksino V /PI (anksti apoptozės) ir aneksino V /PI (vėlai apoptozės) ląstelių procentinės rodomas kiekvieno skydelio. Vertybės drąsiai rodo mažėja SPARC išraiška padidėjo apoptozę 65% MGC803 ir 92% į HGC27 lyginant su neigiamos kontrolės siRNA.
Apoptozės poveikį SPARC siRNA transfekuota gydymo MGC 803 ir HGC27 ląstelės
Siekdama išaiškinti buvo vertinami mechanizmas SPARC siRNA sukeltos apoptozės MSV 803 ląstelių ir HGC27 ląstelių ekspresijos lygio aprotoninis reglamentavimo baltymų, pavyzdžiui, BCL-2, Bax ir kaspazė-3 ir PARP. MSV 803 ląstelių ir HGC27 ląstelės buvo pernešta su SPARC siRNA. Kaip parodyta 5 paveiksle, buvo reikšmingi skirtumai Bax ir BCL-2 raiškos MSV 803 ląstelių ir HGC27 ląstelių, lyginant su neigiamos kontrolinės grupės (p < 0,05 ir P < 0,01). Reaguojant į apoptozinių dirgiklių, procaspase-3 yra suskaldyti į 20 kDa fragmento, ir vėlesnis Autokataliczny reakcija veda į veikliosios 17 kDa fragmento formavimas. Kai kaspazės-3 yra įjungtas, PARP yra suskaldyti. Tokiu būdu skaldymas PARP yra naudojamas kaip apoptozės rodiklis. Norint gauti tiesioginių įrodymų, rodantį kaspazės įjungimo ir apoptozės santykius, procaspase-3 skaldymas ir PARP buvo nagrinėjamas MSV 803 ląstelių ir HGC27 ląstelių po SPARC siRNR perkeltų. Kaip parodyta 5 paveiksle, SPARC siRNA paskatino 32 kDa procaspase-3 skilimo į savo aktyvus 17 kDa formą ir skaldymas PARP pasirodė MGC 803 ląsteles ir HGC27 ląsteles. 5 pav apoptozės baltymų MGC 803 ir HGC27 ląstelių išraiška po transfekciją su kuriuo kontrolės ar SPARC siRNA. Ląstelių Lizatai atskirti 10% SDS-PAGE metodu, perkelti į nitroceliuliozės membranos ir tyrinėjo su anti-PARP, anti-kaspazės-3, anti-Bcl-2, ir anti-Bax. Baltymų kiekis buvo normalizavosi zondavimo tą patį membrana su anti-beta-aktino. . Yra kairėje pusėje duomenys yra duomenys, gauti iš MGC 803 ląsteles ir tiks atstovauti duomenis, gautus iš HGC 27 ląstelių
Diskusijos
baltymas ir daug cisteino, SPARC (taip pat žinomas kaip osteonectin arba rūsyje-membrana-40 BM-40), yra iš matricellular baltymų šeimos, kurių funkcija yra moduliuoti ląstelių matrica sąveiką ir ląstelių funkciją nedalyvaudamas struktūrinio pastolių iš tarpląsteliniame narys. Raiškos iš SPARC buvo užfiksuota keliais tipų solidinių navikų, tokių kaip krūties [7], prostatos [8], melanomos [9] ir glioblastomos [10]. Priešingai, žemesnio lygio SPARC išraiškos buvo rasta kitų rūšių vėžio, pavyzdžiui, kiaušidžių [11], storosios žarnos [12], kasos [13, 14] ir ūminės mieloidinės leukemijos [15]. Šios pastabos rodo, kad tumorogeniškas poveikis SPARC yra ląstelių tipo konkrečių ir gali būti priklausomas nuo naviko ląstelės supančiai aplinkai.
Žinias apie SPARC funkcijų skrandžio vėžio ląstelių vis dar nedaug. Kai Imunohistocheminiais tyrimais [16-20, 22] kartu pranešė UP-reguliavimą SPARC skrandžio vėžiu, palyginti su nonneoplastic gleivinę. Wewer ir kt. [17] aprašė diferencialo išraišką SPARC į epitelio ir stromos skyrių šešių skrandžio vėžio egzempliorių. Maeng [18] nustatė, kad SPARC yra labai išreikštas reaktyvinę stromos, susijusios su invazinių diferencijuotų adenokarcinomų ir, kad ji gali būti naudinga klinikinės diagnostikos markeris skrandžio vėžio. Wang ir kt. [16] Taip pat rado skirtingai išreiškiama SPARC skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, kaip vertinama genų masyvo analizė, kiekybinio RT-PGR ir imunodažymu, didesnis SPARC išraiška buvo reikšmingai susijęs su naviko progresavimo ir stadijose skrandžio vėžio. Frankas ir kt. [20] parodė, platesniu pacientų serijos, kad "SPARC yra skirtingai išreikštas skrandžio vėžio ir kad jos išraiška koreliuoja su naviko progresavimo ir mazgų plitimą naudojant audinių mikrogardelių (TMA), saviraiškos ir SPARC lygio, nustatyto imunohistocheminiu, skaitomos žarnyno tipo skrandžio vėžio su vietos naviko augimą, mazgų plitimą ir naviko stadijos pagal Tarptautinius Sąjunga nuo vėžio. [19] zhao ZS ir kt., Nustatyta, kad SPARC buvo aptikta 334 436 žmogaus skrandžio vėžio atvejų ir buvo labai išreikštas 239 navikų. Etapais I, II ir III, 5-metų išgyvenamumas pacientams, sergantiems aukšto išraiška SPARC buvo žymiai mažesnis nei pacientams, sergantiems mažo išraiška. Daugiau daugiamatis analizė parodė, kad ląstelę SPARC, MMP-2 ir integrinų beta-1, buvo nepriklausomi prognostiniai rodikliai ligos.
Mes surinkome 49 skrandžio vėžiu audinius ir atitinkamas normalius audinius per chirurgines procedūras (Jie Yin, Guowei Chen, SĮ liu, Jianxun Zhao, Yucun liu: išraiška SPARC žmogaus skrandžio vėžio yra susijęs su klinikiniais-patologinių funkcijų, pateikta). Pasiskirstymas ir išraiška SPARC nepastebėta imunohistocheminiu, Imunoblotingo ir RT-PCR, atitinkamai. SPARC baltymų ir iRNR išreiškė gerokai didesnis skrandžio vėžio audiniuose, palyginti su sveikų audinių. Iš jo išraiškos laipsniai buvo susijęs su diferenciacijos navikas, TNM skyrius, pilvaplėvės sėja ir kraujagyslių invazija nepaprastai. Pacientai, sergantys didelio išraiška SPARC turėti blogesnį prognozę nei tie, su mažu išraiška SPARC.
Kartu paėmus, didesnis SPARC išraiška buvo reikšmingai susijęs su naviko progresavimo ir stadijose skrandžio vėžio. Naujausi tyrimai Inoue M et al [23] net identifed SPARC kaip kandidatas tikslinės antigeno imunoterapija įvairių vėžio, įskaitant skrandžio vėžio genomo kDNR microarray. Tai jaudinantis, kad terapija nukreipta į SPARC subvieneto gali būti naudinga požiūris slopinti skrandžio vėžio augimą. Tačiau molekulinius mechanizmus atsakingi už SPARC onkogenezėje skrandžio vėžio nėra visiškai suprantama. Per ekspresijos duomenų analizę skrandžio vėžio ląstelių linijų skydelyje, mes parodė, kad SPARC yra taip pat aktyvuojami sevel žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų. Todėl mes išbandėme savo hipotezes, kad "SPARC gali būti raktas molekulė skrandžio vėžio invazijos, ir kad orientacija SPARC gali pateikti naujovišką gydymo strategiją anti-invazijos skrandžio vėžio.
Sklaida vėžinių ląstelių, arba lokaliai arba tolimoje metastazavusiu svetainės reikalauja, kad piktybinės ląstelės įgyja galimybę įsiveržti į pamatinės membranos ir laikytis kitų matricų. Buvo pasiūlyta, kad "SPARC gali vaidinti svarbų vaidmenį per pirmuosius žingsnius į naviko invazija ir metastazių [24] procese. Be to, "SPARC gali sukelti metaloproteinazes ar fermentų ekspresiją, kuri vėliau vaidinti svarbų vaidmenį bazinių membranų ir tarpląsteliniame komponentų [25] degradacija. SPARC buvo susijęs su Meningitas [26, 27] ir gliomose [28] invazijos. Be to, slopinimas SPARC išraiškos naudojant RNR slopinamas judrumą bei invazija į žmogaus krūties vėžio ląstelių in vitro [21].
Norėdami nustatyti, ar "SPARC siRNR gali sumažinti protumorigenic ląstelių elgesį, susijusius su SPARC išraiška, mes pirmiausia lėmė sumažėjęs SPARC poveikį išraiška naviko ląstelių invaziją. Mes matuojamas skrandžio vėžio ląstelių gebėjimą įsiveržti per Matrigel, dirbtinio tarpląsteliniame po transfekciją su SPARC siRNA ar ne nukreipimo kontrolės siRNA. Sumažėjęs SPARC išraiška lėmė invazijos slopinimas 69% ir 79% visų MGC803 ir HGC27, atitinkamai. Taigi, SPARC siRNR gali sumažinti skrandžio vėžio invazijos in vitro.
Neseniai atliktas tyrimas nustatė, kad "SPARC apsaugo ląsteles nuo streso sukeltos apoptozės in vitro per sąveiką su integrinu β1 heterodimerus kad padidinti Pieno aktyvinimą ir prosurvival veiklą [28]. Pirminiai tyrimai, naudojant RNR strategijas visiškai panaikinta žmonių melanomos augimą nuogas pelių [21]. Horie ir kt. [29] parodė, kad "SPARC išraiškos downregulation sukeltas augimo slopinimą su G 1 arešto žmogaus melanomos ląsteles. Buvo pranešta, kad "SPARC skatina glioma ląstelių išgyvenimą per Akt aktyvavimo per integrinų signalizacijos sąlygomis be serumo [30]. Šios ataskaitos teigti, kad "SPARC vaidina svarbų vaidmenį kaip Antistresinis faktorius.
Kita vertus, kai kurie straipsniai nustatė, kad" SPARC gali skatinti apoptozę vėžinių ląstelių. Yiu ir kolegos [11] parodė, kad egzogeninė gydymo įvairių kiaušidžių vėžio ląstelių linijų su SPARC sukeltos apoptozės. Sakė ir Motamed [31] nustatė, SPARC ekspozicija padidėjo suskaldyti kaspazę 3 žmogaus kiaušidžių vėžio ląstelių, kurios palaikė buvusį stebėjimą. Kasos [13], ir kiaušidžių vėžio [30] eksponuojami didesnį augimą ir sumažinti apoptozę kai implantuojami SPARC - /-. Gaubtinės ir tiesiosios žarnų vėžio ląstelių linijas, padidėjusią SPARC sumažinti ląstelių gyvybingumą ir tvirčiau apoptozę ląstelių, veikiamų įvairių chemoterapiniais preparatais [32].
Šių iš pažiūros paradoksalius pastabas per kiekvieno vėžiu ir įvairiose vėžio tipą galima paaiškinti TAI supratimu SPARC biologijos [33]: mažesnių peptidų fragmentai SPARC atstovaujančios skirtingus domenus SPARC suteikti biologiniai veiklą, kuri kartais, prieštarauti kitų fragmentų ar gimtosios SPARC baltymų. Nuo proteazės profilį naviko mikroaplinkoje gali skirtis įvairių tipų vėžio, ir kaip SPARC yra žinoma, kad atlikti proteolizę pagal matrikso metaloproteinazių [34], šių skirtumų, kartu su pokyčių vietos sudėtį matricos molekulių ir citokinais, gali visi būti prisidedama prie sudėtingo elgesio SPARC įvairių tipų vėžiu.
aiškinsis SPARC siRNA poveikį skrandžio vėžio ląstelių augimą, MTT, platinimu tyrimas buvo atliktas palyginti tarp SPARC siRNR perkeltų ir kontrolės perkeltų MGC803 ir HGC 27 platinimu ląstelės. MGC803 ir HGC27 skrandžio vėžio ląstelės transfektuotose SPARC siRNA išgyveno ne sumažėjusiu santykiniu į suderintų ląstelių transfektuotose ne orientacija kontrolės siRNA (3 paveikslas) normas. Sumažėjęs išlikimo ląstelių, transfekuotų su SPARC siRNA buvo susijęs su padidėjusia normos apoptozės kaip matuojama pagal ir prie aneksino V tyrimu. Mažėjančios "SPARC išraiška padidėjo apoptozę 91% į MGC803 ir 92% į HGC27 (4b paveikslas).
Aktyvios kaspazių vaidina svarbų vaidmenį apoptozės indukcija. Kai kaspazės-3 buvo aktyvuota, PARP skyla vėlu. Paprastai PARP skaldymas buvo naudojamas kaip apoptozės rodiklis. Šioje studijoje, mes nustatėme, SPARC siRNR aktyvuota kaspazės-3 pagaminti suskaldyti kaspazės-3 (P17) fragmentai MGC 803 ląsteles ir HGC 27 48 val. Tuo pačiu metu, PARP skaldymas taip pat buvo aptikta. Rezultatai rodo, kad "SPARC sukeltas susiskaldymo PARP taip pat padidinti kaspazės-3 aktyvumą MSV 803 ląstelių.
BCL-2 šeimos buvo pranešta baltymai reguliuoti apoptozę kontroliuojant mitochondrijų membranos pralaidumą. SPARC iki sureguliavo Bax išraišką ir žemyn sureguliavo BCL-2 išraišką MGC 803 ląsteles ir HGC 27 ląstelių. Mes nustatėme, kad "SPARC siRNR gali sukelti skrandžio vėžio ląstelių apoptozę ir tuo pačiu metu sumažinti BCL-2 santykis Bax. Todėl BCL-2 ir Bax raiškos reguliavimas gali būti pagrindinis mechanizmo, lemiančio SPARC sukeliama apoptozė skrandžio vėžio ląsteles.
Taigi, mūsų duomenimis, downregulation iš SPARC slopina ląstelių proliferaciją skrandžio vėžio ląstelių apoptozė inicijavimo, kuris sąžinės su melanomos ir gliomos, bet priešingai kiaušidžių ir kasos vėžio. Apoptozės indukcija buvo iš dalies reguliuoti, kad būtų mitochondrijų keliu, pavyzdžiui, aktyvacijos kaspazė keliu, taip pat skilimo PARP. Ateities studijų poreikius sutelkti dėmesį į tikslus mechanizmas.
Taigi, mūsų dabartinis duomenys rodo, kad "SPARC suvaidino svarbų vaidmenį apoptozės ir metastazių skrandžio vėžio. Šiuo metu nėra veiksmingų metodų gydant vėlai skrandžio vėžiu. Kaip padidėjusi SPARC išraiška yra susijęs su sumažėjusiu skrandžio vėžiu išgyvenamumą [16], mes tikime, kad mūsų rezultatai, kurie parodo sumažėjo invazija ir padidėjęs ląstelių žūtį su siRNA nukreipta prieš SPARC, rodo, kad mažėja SPARC išraiška gali turėti gydomasis skrandžio vėžiu sergantiems pacientams.
dEKLARACIJOS
Padėka
šis darbas parėmė Nacionalinės mokslo Technologic Parama projektų fondo [30901417]. Dėkojame profesoriui Yang Ke ir Xiaojuan Du iš Pekino universiteto Sveikatos mokslų centro, Pekinas, Kinija, techninės priežiūros tarnybai.
Autoriai pradinis pateiktų failų vaizdų
Žemiau išvardintos nuorodos į autorių originalus pateiktų failų vaizdų. 13046_2010_306_MOESM1_ESM.jpeg Autorių originalus failas 1 pav 13046_2010_306_MOESM2_ESM.jpeg Autorių originalaus failo 2 pav 13046_2010_306_MOESM3_ESM.jpeg Autorių originalios 3 pav 13046_2010_306_MOESM4_ESM.jpeg Autorių originalaus failo 4 pav 13046_2010_306_MOESM5_ESM.jpeg Autorių originalaus failo 5 paveiksle konkuruojančių interesų Viesbutis The autoriai deklaruoja, kad jie neturi jokių konkuruojančių interesų.

• Metalotioneiną 2A slopina NF-κB keliu aktyvavimo ir prognozuoja klinikinių rezultatų atskirti su TNM etape skrandžio vėžiu sergantiems pacientams po radikalaus rezekcijos
• Giliai sekos skrandžio karcinoma atskleidžia somatinės mutacijos svarbios asmeninį medicinoje