Neerwaartse regulatie van de SPARC-expressie afneemt maagkanker cellulaire invasie en overleving

Neerwaartse regulatie van de SPARC-expressie afneemt maagkanker cellulaire invasie en overleving
Abstracte achtergrond
uitgescheiden eiwit zuur en rijk aan cysteine ​​(SPARC) speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van vele weefsels en types orgel. Afwijkende SPARC expressie werd gevonden in een groot aantal menselijke kankers, bij aan tumorontwikkeling. Omdat SPARC werd gevonden dat overexpressie in menselijke maagkanker weefsel, dus we de expressie van SPARC verkennen in maagkanker lijnen en carcinogene mechanismen.
Methods
SPARC expressie werd geëvalueerd in een panel van menselijke maagkanker cellijnen . MGC803 en HGC 27 maagkanker cellijnen die hoge niveau van de SPARC werden tijdelijk met SPARC-specifieke kleine interfererende RNA's en vervolgens geëvalueerd voor effecten op de invasie en proliferatie.
Resultaten
kleine interfererende RNA-gemedieerde knockdown van SPARC in MGC803 HGC en 27 maagkanker cellen sterk afgenomen hun invasie. Knockdown van SPARC werd ook waargenomen om aanzienlijke verhoging van de apoptose van MGC803 en HGC 27 maagkanker cellen vergeleken met controle-getransfecteerde groep.
Conclusies
Onze gegevens toonden aan dat het neerwaarts reguleren van SPARC remt invasie en groei van menselijke maagkanker cellen. Aldus targeting van SPARC kan een effectieve therapeutische benadering tegen maagkanker is.
Inleiding
Maagkanker is de tweede leidende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd en is een van de meest agressieve tumoren en wordt vaak geassocieerd met lymfeknoop metastase, peritoneale verspreiding en hematogene metastase [1]. Over het geheel genomen, 65-70% van de nieuwe gevallen en sterfgevallen als gevolg van maagkanker voorkomen in minder ontwikkelde landen [2]. In 2005 is de incidentie van maagkanker (0,3 miljoen doden en 0,4 miljoen nieuwe gevallen) op de derde plaats van de meest voorkomende vormen van kanker in China [3]. Huidige therapieën voor gevorderde of gemetastaseerde maagkanker weinig effect, chirurgische verwijdering met resectie van aangrenzende lymfeklieren biedt de enige mogelijkheid voor genezing, die minder dan 33% van de patiënten met maagkanker. De 5-jaarsoverleving is slechts 30-40%, met een slechtere prognose voor gevorderde tumoren. Het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de progressie van maagkanker kunnen inzichten in nieuwe therapeutische doelen aan te geven
uitgescheiden eiwit zuur en rijk aan cysteine ​​(SPARC, ook wel bekend als osteonectine of BM-40). Behoort tot de matricellulaire familie van uitgescheiden eiwitten [4 ]. SPARC is een niet-structureel bestanddeel van de extracellulaire matrix die cel-matrix interacties moduleert, vooral tijdens weefselontwikkeling, remodelleren en herstellen [5]. Veel soorten kankers worden gekenmerkt door opgereguleerd expressie van SPARC [6]. Overexpressie van SPARC is beschreven in diverse types van solide tumoren, zoals borstkanker [7], prostate [8], melanoma [9] en glioblastomen [10]. Daarentegen hebben lagere SPARC expressie gevonden in andere soorten kanker, zoals eierstokkanker [11], colorectale [12], alvleesklier [13, 14] en acute myeloïde leukemie [15]. Deze waarnemingen suggereren dat tumorigene effect van de SPARC is celtype specifiek en kan afhankelijk van de tumorcel omringende milieu. Ondernemingen De kennis over SPARC functies bij maagkanker cellen is nog steeds schaars. Overexpressie van de SPARC-gen werd waargenomen in menselijke maagkanker in vijf andere verslagen [16-20]. Echter, alle bovengenoemde studies had geen detail bij maagkanker cellijnen en carcinogeen mechanisme. SPARC is geassocieerd met agressieve stadia van maagkanker en is gecorreleerd met een slechte prognose [16], hetgeen suggereert dat de vermindering van SPARC expressie therapeutisch nut kunnen hebben. Inderdaad, expressie van antisense oligonucleotiden tegen SPARC in melanoomcellen geblokkeerd tumorvorming [21]. De precieze biologische en moleculaire mechanismen die een verlaging van SPARC expressie kunnen bijdragen aan verbeterde tumortherapie nog worden onderzocht. Daarom was het doel van de huidige studie aan SPARC functies te karakteriseren bij maagkanker cellen en ontdek de mogelijk kankerverwekkend mechanisme.
Materialen en werkwijzen
celkweek
menselijke maagkanker cellijnen NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 werden verkregen van het Cancer Institute van de Chinese Academie van Medische Wetenschappen. Alle cellen werden gekweekt in RMPI 1640 (GIBCO ™) medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline G (100 eenheden /ml) en streptomycine (100 ug /ml), en werd volledig medium. De cellen werden gehandhaafd in monolaagkweek bij 37 ° C in bevochtigde lucht met 5% CO 2.
Chemicaliën en reagentia
EDTA-2 natrium, acridine oranje, ethidiumbromide (EB) en 3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-difenyl tetrazoliumbromide (MTT) werden gekocht bij Sigma (St. Louis, MO, USA). Muis monoklonaal antilichaam dat specifiek aan P-actine was van Sigma. Konijn polyklonale antilichamen die specifiek zijn voor Bcl-2 (sc-492), caspase-3 (sc-7148) en PARP (sc-7150) werden gekocht van Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Muis monoklonale antilichamen die specifiek SPARC (SC-74295) en Bax (sc-7480) werden verkregen van Santa Cruz Biotechnology. Geit anti-konijn (w3960) en anti-muis (w3950) secundaire antilichamen werden gekocht bij Promega (Madison, WI, USA).
RNAi en transfectie
menselijke SPARC siRNA en controle siRNA was van Dharmacon Bioscience Corp (Chicago , IL, USA). Equimolaire hoeveelheden van siRNA's werden gebruikt volgens instructies van de fabrikant met de controle niet-gericht siRNA (CTRL). 150 000 cellen uitgeplaat per zes putjes in DMEM met 10% FBS en werden overnacht hechten. Equimolaire hoeveelheden van siRNA's werden geïncubeerd met doorvoer TKO-transfectiereagens van Mirus (Madison, WI, USA) volgens instructies van de fabrikant. De cellen werden gedurende 48 uur voorafgaande experimenten, tenzij anders beschreven
Western blotanalyse
Twintig microgram totale eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht op een PVDF-membraan. Het membraan werd vervolgens geïncubeerd met antilichamen specifiek voor SPARC (Santa Cruz; 1: 500), of anti-β-actine (Sigma; 1: 1000) gedurende de nacht bij 4 ° C. Gebonden antilichamen werden zichtbaar gemaakt met versterkte chemiluminescentie. Om gelijke belading te bevestigen, werden membranen gestript gedurende 30 minuten bij 50 ° C in buffer bevattende 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,7) en 100 mM 2-mercaptoethanol en opnieuw gesondeerd met anti-β-actine antilichaam gelijke hoeveelheden te tonen . De dichtheid van de banden werd gekwantificeerd door densitometrische analyse met behulp van ImageTool (versie 3,0) -systeem.
RT-PCR
Totaal RNA (1-2 ug) werd reverse getranscribeerd met SuperScript met een pre-amplificatie kit (Invitrogen, Carlsbad , CA). Primers werden gebaseerd op sequenties gerapporteerd Genenbank (NM 003.118). SPARC sense sequentie was 5'- GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'en SPARC anti-sense sequentie 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3'. Het verwachte product grootte van SPARC cDNA was 512bp. ß-actine sense sequentie was 5'- GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'en ß-actine antisense sequentie 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. Het verwachte product grootte van ß-actine cDNA was 514bp. PCR amplificatie werd uitgevoerd in 25 gl reactievolume bevattende 0,2 uM dNTPs, 20 pmol van elke oligonucleotide primer, en 0.2U Tag polymerase in PCR-buffer. cDNA werd geamplificeerd op een thermische PCR-controller met een initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 5 minuten, vervolgens cycli van 95 ° C gedurende 1 min, 65 ° C gedurende 1 min en 72 ° C gedurende 1 min, 27 cycli, en een laatste verlenging stap van 72 ° C gedurende 10 minuten. De hoeveelheid uitgangsmateriaal cDNA werd ingesteld met β-actine intensiteit.
Celmigratie assay
het vermogen van cellen om te migreren door filters werd gemeten met een BioCoat Matrigel invasie kamer (BD Biosciences, San Jose, CA). Celkweek inserts met een 8 urn poriegrootte PET membraan werden gebruikt volgens het protocol van de fabrikant. De onderste kamer opgenomen medium (0,75 ml) bevattende 10% FCS, terwijl SPARC siRNA getransfecteerde of controle getransfecteerde cellen (1,0 x 10 5 gesuspendeerd in 0,5 ml medium dat 1% FCS) werden gezaaid in de bovenste kamer en overnacht geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO 2. Remaning cellen op het bovenoppervlak werden mechanisch verwijderd. De membranen werden vervolgens gewassen, gefixeerd en gekleurd met Diff-Quik (Medion Diagnostics). Het aantal cellen dat gemigreerd naar het onderste oppervlak van de filters werd bepaald door telling van gekleurde cellen onder een lichtmicroscoop in drie onafhankelijke velden (0,25 mm 2 /putje).
Celgroei en levensvatbaarheid assay
effect van SPARC SiRNA op de levensvatbaarheid van cellen werd bepaald met de MTT assay. In het kort werden MGC803 en HGC 27 cellen uitgeplaat bij 1 x 10 4 cellen per putje in zesennegentig-well microtiterplaten. Na incubatie gedurende 72 uur werd de cellevensvatbaarheid bepaald. Dan 20 ul MTT (10 mg /ml voorraad in PBS verdund tot werkende concentratie van 1 mg /ml met medium) werd aan elk putje toegevoegd en gedurende 4 uur. Na zorgvuldige verwijdering van het medium, werd 200 gl dimethylsulfoxide aan elk putje toegevoegd en voorzichtig geschud. De absorptie werd op de microplaat lezer (ELX 800, Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, USA) bij een golflengte van 570 nm. Het effect van siRNA SPARC op celgroei remming werd vastgesteld als percentage cellevensvatbaarheid wanneer vehikel behandelde cellen werden als 100% levend.
Celcyclus analyse en annexine V-kleuring
Voor flowcytometrische cell cycle analysis, de cellen behandeld met siRNA werden verzameld, gewassen met PBS, in koude 70% ethanol gefixeerd en bewaard bij -20 ° C tot kleuring. Na fixatie werden de cellen gewassen met PBS en geïncubeerd met 50 ug /mL RNaseA (Sigma) gedurende 30 min bij 37 ° C, vóór kleuring met 50 ug /mL propidiumjodide (Sigma). Apoptotische cellen in de vroege en late stadia werden gedetecteerd met behulp van een annexine V-FITC Apoptosis Detection Kit van BioVision (Mountain View, CA, USA). In het kort werden de cellen getransfecteerd met siRNA. 96 h na transfectie cultuurmedia en cellen werden verzameld en gecentrifugeerd. Na wassen werden de cellen geresuspendeerd in 490 ul Annexine V bindingsbuffer, gevolgd door de toevoeging van 5 pi annexine V-FITC en 5 pi propidium iodide. De monsters werden geïncubeerd in het donker gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en geanalyseerd met flow cytometrie. Statistische gegevens
Resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde expressieniveaus (± SD). Student's t-test
of rank sum-test werden gebruikt voor statistische analyse. Een p-waarde < 0.05 werd genomen als het niveau van significantie (tweezijdig).
Resultaten
Expressie van SPARC in gekweekte maagkanker cellen
We hebben eerst in verscheidene menselijke maagkanker cellijnen geëvalueerd de endogene expressie van SPARC. We vonden dat SPARC eiwit en mRNA waren overwegend in MGC803 en HGC27 cellen werden geproduceerd op een lager niveau door SGC7901 cellijn was niet waarneembaar in NCI-N87 en BGC823 cellijnen (figuur 1). Figuur 1 Expressie van SPARC bij maagkanker cellijnen. A, Immunoblotanalyse met een konijn polyklonaal SPARC antilichaam (1: 500). B, specifieke reverse transcriptase polymerasekettingreactie (RT-PCR) analyse voor SPARC. ß-actine werd gebruikt als ladingcontrole. C, Relatieve SPARC mRNA expressie niveaus. Autoradiogrammen werden gescand en geanalyseerd met densitometrie gevolgd door kwantificatie ten opzichte van P-actine. Resultaten worden weergegeven als expressie (in%) ten opzichte van P-actine en zijn gemiddelden (± SD) van 3 experimenten.
Remming van endogene expressie SPARC
Na deze eerste screening MGC803 cellen en HGC27 cellen die relatief hoge endogene SPARC werden vastgesteld knockdown expressie SPARC op voorbijgaande wijze het belang van endogene expressie SPARC bepalen. Zoals getoond in Figuur 2A, werd SPARC expressie geremd SPARC siRNA transfectanten in eiwitniveaus. Deze resultaten suggereren dat deze SPARC siRNA een silencing effect voor SPARC expressie met succes uit te oefenen. Figuur 2 Effect van SPARC knockdown op celmigratie bij maagkanker cellijnen MGC 803 en HGC 27 cellen. A. SPARC expressie in MGC 803 en HGC 27, controle en SPARC siRNA getransfecteerde cellen werd gedetecteerd door immunoblot analyse met behulp van een konijnen polyklonaal SPARC antilichaam (1: 500). ß-actine werd gebruikt als ladingcontrole. B. Effecten van SPARC knockdown op celmigratie bij maagkanker cellijnen. SPARC expressie werd neergeslagen in 803 MGC en HGC 27 cellen onder toepassing SPARC siRNA en onderworpen aan een migratie assay behulp van een twee-chambered invasie inrichting zoals beschreven in Materialen en Werkwijzen, histogram toont het percentage remming van MGC 803 en HGC 27 celinvasie. Het experiment werd uitgevoerd in drievoud en van de verkregen uit scrambled siRNA getransfecteerde cellen waarde werd ingesteld als 100%.
Negatieve regulatie van de SPARC-expressie geremd maagkanker cellen invasie in vitro Belgique Om te bepalen of SPARC siRNA protumorigenic cellulaire gedrag in verband met kunnen verminderen SPARC meningsuiting, we eerst het effect van verminderde SPARC uitdrukking op tumorcel invasie bepaald. Invasie assay vervolgens uitgevoerd middels Transwell kamers. We maten de capaciteit van maagkanker cellen binnen te dringen door middel van Matrigel, een kunstmatige extracellulaire matrix na transfectie met een niet-targeting control siRNA of SPARC siRNA. Verminderde SPARC expressie leidde tot de remming van invasie van 69% en 79% in MGC803 en HGC27 respectievelijk (Figuur 2B, C). Tezamen bieden deze resultaten geven duidelijk aan dat de onderdrukking van SPARC remt de migratie en invasie vermogen van MGC803 cellen en HGC27 cellen.
negatieve regulatie van SPARC expressie remt de groei van maagkanker cellen in vitro
We hebben onderzocht of SPARC siRNA kon verminderen de overleving maagkanker cellen. MGC 803 en HGC 27 maagkanker cellen getransfecteerd met siRNA SPARC overleefd tegen verlaagde tarieven opzichte gepaard cellen die met een niet-targeting control siRNA (figuur 3A). Neerwaartse regulatie van SPARC meningsuiting niet induceert celcyclus bij maagkanker cellen. We hebben gekeken naar de effecten van de SPARC siRNA op de voortgang van de celcyclus. Silencing van SPARC in MGC803 en HGC27 cellen niet G1 of S-fase populaties veranderingen op 72 uur na de transfectie met siRNA SPARC in vergelijking met de negatieve controlegroep (figuur 3B). Figuur 3 Effecten van SPARC knockdown op celgroei bij maagkanker cellijnen. de linker helft data vertegenwoordigen gegevens van MGC 803 cellen en de juiste zijn te vertegenwoordigen gegevens van HGC 27 cellen. A. Basal groei werd bepaald na 48 uur in compleet medium met de MTT assay. Resultaten worden getoond als gemiddelde groei (in%) van de respectievelijke MGC 803 en HGC 27 cellijn en zijn gemiddelden (± SE) van bepalingen in viervoud zes afzonderlijke experimenten. Cellen van de siRNA en controlegroepen werden verzameld cytometrie celcyclusanalyse. B. Silencing van SPARC door siRNA transfectie veranderde niet celcyclus distributie in MGC 803 en HGC 27 maagkanker cellen. MGC 803 en HGC 27 cellen werden getransfecteerd met siRNA SPARC of negatieve controle siRNA. Op 72 uur na transfectie, werd DNA gehalte gemeten met behulp van propidiumjodide (PI) kleuring voor flowcytometrie.
Remming van SPARC expressie verhoogt apoptose bij maagkanker cellen
We onderzochten of SPARC siRNA celdood bij maagkanker kunnen veroorzaken cel lijnen. De behandeling van MGC803 en HGC27 cellen met SPARC siRNA verhoogde vroege apoptotische cellen en laat apoptotische cellen, vergeleken met negatieve controle siRNA behandeling (figuur 4A), gemeten door Annexine V assay. Zoals verwacht, werd de verminderde overleving van de cellen getransfecteerd met siRNA SPARC met toegenomen incidentie van apoptose door 91% in MGC803 en 92% in HGC27 cellen (Figuur 4B). Deze bevindingen suggereren dat SPARC betrokken is bij apoptose cellulaire overleving handhaven sommige maagkanker cellen. Figuur 4 SPARC knockdown resulteert in inductie van apoptose bij maagkanker cellijnen. Voor flowcytometrische analyse werden cellen geoogst 96 uur na transfectie met siRNA SPARC of negatieve controle siRNA, vervolgens gekleurd met annexine V-FITC en propidiumjodide (PI). de linker helft data vertegenwoordigen gegevens van MGC 803 cellen en de juiste zijn te vertegenwoordigen gegevens van HGC 27 cellen. De percentages van annexine V /PI (vroege apoptotische) en annexine V /PI (late apoptotische) cellen wordt getoond in elk paneel. Waarden vetgedrukte afnemende SPARC expressie verhoogde apoptose met 65% in MGC803 en 92% in vergelijking met HGC27 negatieve controle siRNA.
Apoptotische effect van SPARC siRNA getransfecteerd behandeling in MGC 803 en HGC27 cellen
In een poging om het op te helderen mechanisme van SPARC siRNA geïnduceerde apoptose in 803 cellen en MGC HGC27 cellen, expressie van apoptotische regulatie-eiwitten zoals Bcl-2, Bax en caspase-3 en PARP geëvalueerd. MGC 803 cellen en HGC27 cellen werden getransfecteerd met siRNA SPARC. Zoals getoond in Figuur 5, waren er significante verschillen in de uitingen van Bax en Bcl-2 in MGC 803 cellen en HGC27 cellen in vergelijking met de negatieve controlegroep (P < 0,05 en P < 0,01). In reactie op apoptotische stimuli wordt procaspase-3 gesplitst in een 20 kDa fragment en de daaropvolgende autokatalytische reactie leidt tot de vorming van de actieve 17 kDa fragment. Wanneer de caspase-3 wordt geactiveerd, wordt PARP gesplitst. Aldus splitsing van PARP wordt gebruikt als indicator voor apoptose. Om direct bewijs die de relatie van caspase activering en apoptose te verkrijgen, werden procaspase-3 splitsing en PARP in MGC 803 cellen en HGC27 cellen onderzocht na SPARC siRNA getransfecteerd. Zoals getoond in figuur 5, SPARC SiRNA induceerde de splitsing van 32 kDa procaspase-3 in zijn actieve vorm 17 kDa en splitsing van PARP verscheen in MGC 803 cellen en HGC27 cellen. Figuur 5 de expressie van apoptose proteïnen in MGC 803 en HGC27 cellen na transfectie met ofwel controle of SPARC siRNA. De cellysaten werden gescheiden op 10% SDS-PAGE gel, overgebracht naar nitrocellulose membraan en gemerkt met anti-PARP, anti-caspase-3, anti-Bcl-2 en anti-Bax. eiwitgehalten werden genormaliseerd door sonderen hetzelfde membraan met anti-β-actine. . De linkerhelft gegevens tonen de gegevens van MGC 803 cellen en de juiste zijn tonen de gegevens van HGC 27 cellen
Discussie
Uitgescheiden eiwitten en rijk aan cysteine, SPARC (ook bekend als osteonectine, of kelder membraan-40 BM-40), is een lid van een familie van matricellulaire eiwitten, waarvan de functie is cel-matrix interacties en cel moduleren zonder deelname van het structurele skelet van de extracellulaire matrix. Overexpressie van SPARC is beschreven in diverse types van solide tumoren, zoals borstkanker [7], prostate [8], melanoma [9] en glioblastomen [10]. Daarentegen hebben lagere SPARC expressie gevonden in andere soorten kanker, zoals eierstokkanker [11], colorectale [12], alvleesklier [13, 14] en acute myeloïde leukemie [15]. Deze waarnemingen suggereren dat tumorigene effect van de SPARC is celtype specifiek en kan afhankelijk van de tumorcel omringende milieu. Ondernemingen De kennis over SPARC functies bij maagkanker cellen is nog steeds schaars. Sommige immunohistochemische studies [16-20, 22] gezamenlijk meldde een up-regulatie van SPARC bij maagkanker in vergelijking met nonneoplastic slijmvlies. Wewer et al. [17] beschreef een differentiële expressie van SPARC in de epitheliale en stromale compartimenten van zes specimens maagkanker. Maeng [18] vonden dat SPARC hoog tot expressie in reactief stroma geassocieerd met invasieve gedifferentieerde adenocarcinomen en dat kan dienen als een nuttige klinische diagnostische merker voor maagkanker. Wang et al. [16] vonden ook een SPARC differentieel uitgedrukt in maagkankerpatienten zoals bepaald door gen-array analyse, kwantitatieve RT-PCR en immunokleuring hogere SPARC expressie was significant geassocieerd met tumorprogressie en gevorderde stadia van maagkanker. Franke et al. [20] heeft aangetoond op een grotere serie patiënt die SPARC differentieel tot expressie wordt gebracht in maagkanker en dat de expressie correleert met tumorprogressie en knooppunten verspreid via tissue microarrays (TMA), het expressieniveau van SPARC bepaald door immunohistochemie, gecorreleerde in intestinale-type maagkanker met de lokale tumorgroei, knooppunten verspreid, en tumor stadium volgens de International Union Against Cancer. Zhao ZS et al. [19] blijkt dat SPARC werd ontdekt in 334 van de 436 menselijke maagkanker gevallen en was sterk uitgedrukt in 239 tumoren. In fasen I, II en III, de 5-jaars overleving van patiënten met een hoge expressie van SPARC significant lager dan bij patiënten met lage expressie. Verdere multivariate analyse suggereerde dat opregulatie van SPARC, MMP-2 en integrine beta1 waren onafhankelijke prognostische indicatoren voor de ziekte.
Wij hebben 49 maagkanker weefsels Verzameld en overeenkomstige normale weefsels door middel van chirurgische procedures (Jie Yin, Guowei Chen, Si Liu, Jianxun Zhao, Yucun liu: Expressie van SPARC in menselijke maagkanker geassocieerd met klinische pathologische functies, ingediend). De verdeling en expressie van SPARC waargenomen door immunohistochemie, Western blotting en RT-PCR, respectievelijk. SPARC eiwit en mRNA expressie significant hoger bij maagkanker weefsels in vergelijking met normale weefsels. De mate van de expressie werden geassocieerd met differentiatie van de tumor, TNM divisie, peritoneale zaaien en vasculaire invasie opmerkelijk. Patiënten met een hoge expressie van SPARC hebben slechtere prognose dan die met lage expressie van SPARC.
Tezamen hogere SPARC expressie was significant geassocieerd met de progressie van de tumor en de gevorderde stadia van maagkanker. Recent onderzoek van Inoue M et al [23] zelfs identifed SPARC als kandidaat doelantigeen voor immunotherapie van verschillende soorten kanker, waaronder maagkanker door genoom-brede cDNA microarray. Het is spannend dat de therapie gericht op de SPARC subunit een bruikbare aanpak van de maag de groei van kanker onderdrukken kan zijn. Echter, de moleculaire mechanismen die de oncogenese van SPARC bij maagkanker niet volledig begrepen. Door expressie analyse van een panel van maagkanker cellijnen toonden we aan dat SPARC ook overexpressie in Sevel menselijke maagkanker cellijnen. Daarom testten we onze hypothese dat SPARC een belangrijke molecule in maagkanker invasie kan zijn en die gericht SPARC kunnen nieuwe therapeutische strategie presenteren voor anti-invasie van maagkanker.
Verspreiding van kankercellen, lokaal of op afstand gemetastaseerd plaatsen, de bedoelde kwaadaardige cellen verwerven het vermogen om de basale membraan binnendringen en hechten aan andere matrices. Er is gesuggereerd dat SPARC een belangrijke rol spelen tijdens de eerste stappen in het proces van tumorinvasie en metastase [24]. Bovendien kan SPARC de expressie van metalloproteïnasen of enzymen die vervolgens een belangrijke rol spelen bij de afbraak van basale membranen en extracellulaire matrixcomponenten [25] induceren. SPARC werd geassocieerd met de invasiviteit van meningeomen [26, 27] en gliomen [28]. Bovendien, onderdrukking van de SPARC expressie met behulp van antisense-RNA geremd de beweeglijkheid en invasie van menselijke borstkankercellen in vitro [21].
Om te bepalen of SPARC siRNA protumorigenic cellulaire gedrag in verband met SPARC expressie kunnen verminderen, moeten we eerst bepalen het effect van verminderde SPARC uitdrukking op tumorcel invasie. We maten de capaciteit van maagkanker cellen binnen te dringen door middel van Matrigel, een kunstmatige extracellulaire matrix na transfectie met siRNA SPARC of een niet-targeting control siRNA. Verminderde SPARC expressie leidde tot de remming van invasie van 69% en 79% in MGC803 en HGC27 respectievelijk. Zo kan SPARC siRNA maagkanker invasie in vitro te verlagen.
Een recente studie bleek dat SPARC beschermt de cellen tegen stress geïnduceerde apoptose in vitro door middel van een interactie met integrine β1 heterodimeren dat ILK activering en prosurvival activiteit [28] te verbeteren. Initiële studies met antisense RNA strategieën volledig ingetrokken menselijke groei melanoma in naakt muizen [21]. Horie et al. [29] is gebleken dat de neerwaartse regulatie van SPARC meningsuiting geïnduceerde groeiremming met G 1 arrestatie in humane melanoomcellen. Vermeld is dat SPARC bevordert glioma celoverleving met Akt activering door middel van integrine signalering onder serumvrije condities [30]. Deze rapporten suggereren sterk dat SPARC een rol speelt als een antistress factor.
Aan de andere kant, sommige artikelen gevonden die SPARC apoptose kunnen bevorderen in kankercellen. Yiu en collega's [11] blijkt dat exogene behandeling van verschillende eierstokkanker cellijnen SPARC geïnduceerde apoptose. Said en Motamed [31] gevonden blootstelling SPARC toegenomen gesplitst caspase 3 in menselijke ovariumcarcinoom cellen die de vroegere observatie ondersteund. Alvleesklier [13] en eierstokkanker [30] vertoonde meer groei en verminderde apoptose na implantatie in SPARC - /-. In colorectale kanker cellijnen, overexpressie van SPARC verminderde levensvatbaarheid van de cellen en verhoogde apoptose in cellen blootgesteld aan verschillende chemotherapeutische middelen [32].
Deze schijnbaar paradoxale waarnemingen binnen elk type kanker en in verschillende vormen van kanker kan worden verklaard door Tai begrip van SPARC biologie [33]: kleinere peptide fragmenten van SPARC die de verschillende domeinen van SPARC verlenen biologische activiteiten die soms, zich verzetten tegen die van andere fragmenten of de inheemse SPARC-eiwit. Aangezien de protease profiel van de tumor micro-omgeving kunnen in verschillende soorten kanker, en zoals SPARC is bekend dat proteolyse ondergaat van matrix metalloproteïnasen [34], die verschillen in combinatie met veranderingen van de plaatselijke samenstelling van matrix moleculen en cytokines, allen bijdragen aan het complexe gedrag van SPARC op verschillende typen kanker.
om de effecten van SPARC siRNA op gastrische kanker celgroei helderen, werd MTT proliferatie-assay uitgevoerd om de proliferatie tussen SPARC siRNA getransfecteerde en controlegetransfecteerde MGC803 en HGC 27 vergelijk cellen. MGC803 en HGC27 maagkanker cellen getransfecteerd met siRNA SPARC overleefd tegen verlaagde tarieven opzichte gepaard cellen die met een niet-targeting control siRNA (figuur 3). De verminderde overleving van de cellen getransfecteerd met siRNA SPARC was met toegenomen incidentie van apoptose zoals gemeten door Annexine V assay. Afnemende SPARC expressie verhoogde apoptose met 91% in MGC803 en 92% in HGC27 (figuur 4B).
Actieve caspasen een belangrijke rol bij de inductie van apoptose. Wanneer caspase-3 werd geactiveerd, wordt PARP laat gesplitst. Meestal de splitsing van PARP werd gebruikt als indicator voor apoptose. In deze studie hebben we SPARC siRNA geactiveerd caspase-3 tot gesplitst caspase-3 (p17) fragmenten in MGC 803 cellen en HGC 27 op 48 uur. Tegelijkertijd werd de splitsing van PARP gedetecteerd. De resultaten geven aan dat SPARC geïnduceerde fragmentatie van PARP en verhoogde caspase-3-activiteit in MGC 803 cellen. Ondernemingen De Bcl-2 familie eiwitten gerapporteerd dat apoptose te controleren door de mitochondriale membraanpermeabiliteit. SPARC up geregeld de expressie van Bax en neer geregeld de expressie van Bcl-2 in MGC 803 cellen en HGC 27 cellen. We vonden dat SPARC siRNA maagkanker cel apoptose induceren en tegelijkertijd verminderen de verhouding van Bcl-2 tot Bax. Daarom kan de regulatie van Bcl-2 en Bax expressie een belangrijk mechanisme dat ten grondslag SPARC inductie van apoptose bij maagkanker cellen.
Dus onze gegevens blijkt dat downregulatie van SPARC remden celproliferatie maagkanker cellen door apoptosis initiatie, die geweten met melanoom en glioom, maar in tegenstelling tot eierstok- en pancreaskanker. De inductie van apoptose was deels gereguleerd om mitochondriale pathway zoals activering caspase baan alsook door splitsing van PARP. Toekomstig onderzoek moet zich concentreren op het exacte mechanisme.
Kortom, onze huidige gegevens suggereerden dat SPARC speelden een belangrijke rol in apoptose en metastase van maagkanker. Momenteel zijn er geen effectieve aanpak voor het harden late stadium maagkanker. Zoals verhoogde SPARC expressie wordt geassocieerd met een verminderde maagkanker overleving van patiënten [16], zijn wij van mening dat onze resultaten, waaruit blijkt verminderde invasie en verhoogde celdood met siRNA gericht tegen SPARC, suggereren dat het verlagen van SPARC uitdrukking therapeutisch voordeel voor maagkanker patiënten kunnen hebben.
verklaringen
Dankwoord
Dit werk werd ondersteund door de Nationale Wetenschappelijke ondersteuning van Technologic Projectenfonds [30901417]. Wij danken Professor Yang Ke en Xiaojuan Du van Peking University Health Science Centre, Beijing, China, voor de technische ondersteuning.
Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan ​​de links naar de auteurs oorspronkelijke ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 13046_2010_306_MOESM2_ESM.jpeg Authors' 13046_2010_306_MOESM1_ESM.jpeg Auteurs originele bestand voor figuur 2 13046_2010_306_MOESM3_ESM.jpeg Authors 'originele bestand voor figuur 3 13046_2010_306_MOESM4_ESM.jpeg Authors' oorspronkelijke bestand voor originele bestand figuur 4 13046_2010_306_MOESM5_ESM.jpeg Authors 'voor figuur 5 tegenstrijdige belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.

• Metallothioneine 2A remt NF-KB-route activering en voorspelt klinische uitkomst gescheiden met TNM stadium bij maagkanker patiënten na radicale resection
• Deep sequencing van maagcarcinoom onthult somatische mutaties aan gepersonaliseerde geneeskunde relevant