Downregulaci SPARC výrazu znižuje rakoviny žalúdka bunkovú inváziu a prežitie

Downregulaci SPARC výrazu znižuje rakoviny žalúdka bunkovú inváziu a prežitie
abstraktné
pozadia
vylučovaný proteín kyslé a bohatý na cysteín (SPARC) hrá kľúčovú úlohu v rozvoji mnohých typy tkanív a orgánov. Aberantne SPARC expresie bola nájdená v celej rade ľudských nádorov, prispieva k rozvoju nádoru. Vzhľadom k tomu, SPARC sa zistilo, že je nadmerne exprimovaný v ľudskom tkanive karcinómu žalúdka, preto preskúmať expresiu SPARC v karcinómu žalúdka línií a karcinogénnych mechanizmov.
Metódy
SPARC expresie bola hodnotená v paneli ľudských nádorových bunkových línií žalúdočných , MGC803 a HGC 27 žalúdočné rakovina bunkové línie vyjadrujúce vysokú úroveň SPARC boli prechodne transfekovány SPARC špecifické malé interferujúce RNA a následne vyhodnotená pre účinky na invázie a proliferácie.
Výsledky
Sirna sprostredkované vyraďujúce SPARC v MGC803 a HGC 27 rakovinové bunky žalúdočné dramaticky znížil ich inváziu. Bola tiež pozorovaná Vyradenie SPARC výrazne zvýšiť apoptózu MGC803 a HGC 27 žalúdočných rakovinových buniek v porovnaní s kontrolnou skupinou transfekované.
Závery
Naše dáta ukázali, že downregulating SPARC inhibuje invázie a rast ľudských buniek karcinómu žalúdka. Tak, zacielenie SPARC by mohol byť účinný terapeutický prístup proti rakovine žalúdka.
Zavedenie
rakovina žalúdka je druhou najčastejšou príčinou úmrtí súvisiacich s rakovinou po celom svete a je jedným z najviac agresívnych nádorov a je často spojená s lymfatických uzlín metastázy, peritoneálnej šírenie a hematogénne metastázy [1]. V celku, sa vyskytujú v menej rozvinutých krajinách, 65 až 70% nových prípadov a úmrtí na rakovinu žalúdka [2]. V roku 2005, ich miera výskytu rakoviny žalúdka (0,3 milióna úmrtí a 0,4 milióna nových prípadov) umiestnila na treťom mieste medzi najčastejšie nádory v Číne [3]. Súčasné terapie pokročilom štádiu alebo karcinómom žalúdka má malý vplyv, chirurgické odstránenie s resekciou priľahlých lymfatických uzlín ponúka jedinú šancu na vyliečenie, čo je menej ako 33% pacientov s rakovinou žalúdka. Miera prežitia 5 rokov je len 30 až 40%, s horšou prognózou pre pokročilých nádory. Pochopenie molekulárne mechanizmy, na ktorých je progresie rakoviny žalúdka môže poskytnúť pohľad na nových terapeutických cieľov
sekrečnú proteín, kyslé a bohatý na cysteín (SPARC, tiež známy ako osteonektin alebo BM-40). Patrí do rodiny matricellular vylučovaných proteínov [4 ]. SPARC je nestrukturní zložkou extracelulárnej matrice, ktorá moduluje interakcie bunka-matrice, a to najmä pri vývoji tkaniva, prestavby a opravy [5]. Mnoho typov rakoviny sú charakterizované stimulovaná expresie SPARC [6]. Nadmerná expresia SPARC bola dokumentovaná v niekoľkých typov solídnych nádorov, ako je rakovina prsníka [7], prostaty [8], melanóm [9] a glioblastómu [10]. Na rozdiel od toho nižšej úrovne SPARC expresie boli nájdené v iných typov rakoviny, ako je napríklad vaječníkov [11], [12] kolorektálny, pankreasu [13, 14] a akútna myeloidná leukémia [15]. Tieto pozorovania naznačujú, že karcinogénny účinok SPARC je bunkový typ špecifické a môžu byť závislé na nádorové bunky okolitého prostredia.
Znalosti o SPARC funkciách v rakovinových bunkách žalúdka je ešte riedky. Nadmerná expresia génu SPARC bol pozorovaný v ľudskom karcinómu žalúdka v piatich ďalších správ [16-20]. Avšak, všetky vyššie uvedené štúdie nemal detail v žalúdočných nádorových bunkových línií a karcinogénne mechanizmu. SPARC bol spájaný s agresívnymi fázou karcinómu žalúdka a je v korelácii so zlou prognózou [16], čo naznačuje, že zníženie expresie SPARC môžu mať terapeutický prínos. V skutočnosti, expresia antisencie oligonukleotidov proti SPARC v melanómu bunkách blokované tvorbu nádorov [21]. Presné biologické a molekulárne mechanizmy, pomocou ktorých by mohol zníženie expresie SPARC prispievajú k zlepšenej liečbe nádorov stále treba preskúmať. Preto je cieľom tejto štúdie bolo charakterizovať SPARC funkcie buniek karcinómu žalúdka a preskúmať jeho potenciálne karcinogénny mechanizmus.
Materiály a metódy
bunková kultúra
rakovina žalúdka u bunkové línie NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 boli získané z Cancer Institute čínskej akadémie lekárskych vied. Všetky bunky boli pestované v RMPI 1640 (GIBCO ™) média doplneného 10% fetálnom hovädzom sérom, penicilínom G (100 jednotiek /ml) a streptomycínom (100 ug /ml), nazývané kompletným médiom. Bunky boli udržiavané v jednovrstvovej kultúre pri teplote 37 ° C vo zvlhčenom vzduchu s 5% CO 2.
Chemikálie a činidlá
EDTA-2 sodný, akridínové Orange, Ethidium bromid (EB) a 3- [4, 5-dimetyl-thiazol-2-yl] -2,5-difenyl tetrazoliumbromide (MTT) boli zakúpené od firmy Sigma (St. Louis, MO, USA). Myšou monoklonálne protilátky špecifické pre p-aktínu bol od firmy Sigma. Králičie polyklonálne protilátky špecifické k Bcl-2 (sc-492), kaspázy-3 (sc-7148), a PARP (sc-7150) boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Myšou monoklonálne protilátky špecifické pre SPARC (SC-74295) a Bax (sc-7480) bola získaná od Santa Cruz Biotechnology. Kozí anti-králičie (w3960) a anti-myšou (w3950) sekundárne protilátky boli zakúpené od firmy Promega (Madison, WI, USA).
RNAi a transfekcia
Human SPARC siRNA a kontrolné siRNA boli od Dharmacon Bioscience Corp (Chicago , IL, USA). Ekvimolárne množstvo siRNA boli použité podľa inštrukcií výrobcu s riadiacou non-zacielenie siRNA (CTRL). 150 000 bunky boli umiestnené na šiestich jamka v DMEM s 10% FBS a boli ponechané prichytiť sa cez noc. Ekvimolárne množstvo siRNA boli inkubované s tranzitom-TKO transfekčního činidla z MIRUS (Madison, WI, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Bunky boli udržiavané po dobu 48 hodín pred pokusmi, pokiaľ nie je
analýzou Western blot uvedené inak
Dvadsať mikrogramov celkového proteínu boli oddelené pomocou SDS-PAGE a prenesené na membránu PVDF. Membrána bola potom inkubovaná s protilátkami špecifickými pre SPARC (Santa Cruz; 1: 500), alebo anti-beta-aktínu (Sigma, 1: 1000) cez noc pri 4 ° C. Naviazané protilátky boli vizualizované s použitím vylepšeného chemiluminiscencie. Pre potvrdenie rovnakého nakladanie, membrány boli odstránené počas 30 minút pri teplote 50 ° C v pufri obsahujúcom 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,7) a 100 mM 2-mercaptoetanolu a znova skúšaný s anti-beta-aktínu protilátky na preukázanie rovné nakladanie , Hustota pásom bola kvantifikovaná denzitometrické analýzou za použitia ImageTool (verzia 3.0) systému.
RT-PCR
Celková RNA (1-2 ug) bola reverzne transkribovaných s použitím horného indexu pre-amplifikačnej súpravy (Invitrogen, Carlsbad , CA). Primery boli založené na sekvenciách pozorovaných Genebank (NM 003118). SPARC sense sekvencie bola 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'a SPARC anti-sense sekvenciu 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3'. Očakávaná veľkosť produkt SPARC cDNA bol 512bp. SS-aktínu sense sekvencie bola 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'a SS-aktínu anti-sense sekvenciu 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. Očakávaná veľkosť produktu beta-aktínu cDNA bol 514bp. PCR amplifikácie bola vykonávaná v 25 ul objemoch reakcii obsahujúci 0,2 uM dNTP, 20 pmol každého oligonukleotidového primeru, a 0.2U Tag polymerázy v PCR pufri. cDNA bola amplifikovaná v tepelnom regulátora PCR s počiatočnou denaturácia pri 95 ° C po dobu 5 minút, nasleduje cyklov 95 ° C po dobu 1 minúty, 65 ° C po dobu 1 minúty a 72 ° C po dobu 1 minúty, 27 cyklov, a záverečná extenzia 72 ° C počas 10 min. Množstvo východiskových cDNA bola upravená s použitím beta-aktínu intenzitu.
Cell migračné test
schopnosti buniek migrovať cez filtre sa meria za použitia BioCote matrigelu invázne komory (BD Biosciences, San Jose, CA). Bunková kultúra vložky s 8 um veľkosťou pórov PET membrány boli použité podľa protokolu výrobcu. Spodná komora zahrnuté médium (0,75 ml), obsahujúcim 10% FCS, vzhľadom k tomu, SPARC siRNA transfekovány alebo kontrolné transfekované bunky (1,0 x 10 5 suspendované v 0,5 ml média obsahujúceho 1% FCS) boli Zaočkované do hornej komory a inkubuje sa cez noc pri teplote 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére obsahujúcej 5% CO 2. Remaning bunky na hornom povrchu boli mechanicky odstránené. Membrány boli potom premyté, fixované a farbené Diff-Quik (Medion Diagnostics). Počet buniek, ktoré migrovali k spodnému povrchu filtra bola stanovená počítaním zafarbených buniek pod svetelným mikroskopom v troch samostatných oblastiach (0,25 mm 2 /jamka).
Bunkový rast a životaschopnosť test
účinok SPARC siRNA na životaschopnosť buniek bola stanovená pomocou testu MTT. Stručne povedané, MGC803 a HGC 27 bunky boli nanesené na 1 x 10 4 buniek na jamku v deväťdesiat-šesť-jamkové mikrotitračné doštičky. Po inkubácii po dobu 72 hodín, životaschopnosť buniek bola určená. Potom 20 ul MTT (10 mg /ml v PBS sklade, sa zriedi na pracovnú koncentráciu 1 mg /s médiami ml) bol pridaný do každej jamky a inkubovať po dobu 4 hodín. Po starostlivom odstránení média, 200 ul dimetylsulfoxidu bolo pridané do každej jamky a opatrne pretrepte. Absorbancia bola zaznamenaná na čítačke mikrotitračných doštičiek (ELX 800, Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, USA) pri vlnovej dĺžke 570 nm. Účinok SPARC siRNA na inhibíciu rastu buniek bola hodnotená ako percento životaschopnosti buniek, kde boli bunky ošetrené vozidlo je brané ako 100% životaschopné. Analýza
bunkového cyklu a annexin V farbenie
Na účely analýzy bunkového cyklu prietokovou cytometriou, boli bunky ošetrené siRNA boli zhromaždené, premyté PBS, fixované v chladnom 70% etanolu, a skladované pri -20 ° C až do doby farbenia. Po fixácii boli bunky premyté PBS a inkubované s 50 ug /mL RNaseA (Sigma) počas 30 minút pri 37 ° C, pred farbením s 50 ug /ml propidium jodidu (Sigma). Apoptotické bunky v skorých a neskorých štádiách boli detekované s použitím annexinu V-FITC apoptózy Detection Kit od Biovision (Mountain View, CA, USA). V stručnosti, bunky boli transfekovány siRNA. 96 hodín po transfekciu, kultivačné médiá a bunky boli zbierané a centrifugovány. Po premytí boli bunky resuspendované v 490 ul annexin V väzbového pufra, s následným pridaním 5 ul annexin V-FITC a 5 ul propidium jodidom. Vzorky boli inkubované v tme po dobu 5 minút pri teplote miestnosti a analyzované pomocou prietokovej cytometrie. Štatistiky
Výsledky boli vyjadrené ako priemerné hladiny expresie (± SD). Studentov-test
alebo rank sum testu boli použité pre štatistickú analýzu. Hodnota p < 0,05 bola braná ako hladine významnosti (obojstranný).
Výsledky
Vyjadrenie SPARC v kultivovaných žalúdočných rakovinových bunkách
sme prvú hodnotili endogénnej expresiu SPARC v niekoľkých ľudských nádorových bunkových línií žalúdka. Zistili sme, že SPARC proteín a mRNA boli prevládajúce v MGC803 a HGC27 buniek, bolo vyrobené na nižších úrovniach od bunkové línie boli SGC7901 undectable v NCI-N87 a BGC823 bunkových líniách (obrázok 1). Obrázok 1 Vyjadrenie SPARC pri žalúdočných nádorových bunkových línií. A, Imunoblotová analýza za použitia králičej polyklonálnej protilátky SPARC (1: 500). B, špecifické reverznej transkriptázy PCR (RT-PCR), analýza pre SPARC. beta-aktínu bol použitý ako kontrola nanášania. C, relatívna SPARC mRNA expresné hladiny. Autorádiogramami boli skenované a analyzované denzitometria s následným kvantitatívnym vzhľadom k beta-aktínu. Výsledky sú uvedené ako výraz (v%) v porovnaní s beta-aktínu a sú priemery (± SD) z 3 pokusov.
Inhibícia endogénnej expresie SPARC
Po tejto počiatočnej skríning, MGC803 bunky a HGC27 bunky exprimujúce endogénne relatívne vysokou SPARC boli stanovené vyraďujúce vyjadrujúce SPARC prechodným spôsobom pre stanovenie významu endogénne SPARC výrazu. Ako je ukázané na obrázku 2A, SPARC expresia bola inhibovaná s SPARC siRNA transfektantů v úrovni proteínov. Tieto výsledky naznačujú, že tieto SPARC siRNA úspešne vyvíjať tlmiaci efekt pre SPARC výrazu. Obrázok 2 Vplyv SPARC Knockdown o migrácii buniek v žalúdku rakovinových bunkových línií MGC 803 a HGC 27 buniek. A. SPARC expresie v MGC 803 a HGC 27, riadenie a SPARC siRNA transfekciou buniek bol detekovaný imunoblotovou analýzou za použitia králičej polyklonálnej protilátky SPARC (1: 500). beta-aktínu bol použitý ako kontrola nanášania. B. Vplyv SPARC Knockdown o migrácii buniek v žalúdku nádorových bunkových línií. SPARC expresie bola zbúraná v MGC 803 a HGC 27 buniek pomocou siRNA SPARC a podrobia testu migrácie pomocou dvoch-chambered invázie prístroj, ako je popísané v materiáloch a metódach, histogram ukazujúci percento inhibícia MGC 803 a HGC 27 invázie buniek. Experiment bol vykonaný v triplikátech a hodnota získaná miešaná siRNA transfekciou buniek stanovený ako 100%.
Downregulace SPARC expresie inhibuje žalúdočné rakovinové bunky invázie in vitro
Pre stanovenie, či SPARC siRNA môže znížiť protumorigenic bunkovej správania spojené s SPARC výraz, sme najprv presne určiť vplyv zníženej SPARC prejave na inváziu nádorových buniek. Test invázie buniek sa potom vykonáva pomocou Transwellovy komory. Merali sme schopnosť buniek karcinómu žalúdka k invázii do Matrigelu, umelý extracelulárnej matrix, po transfekciu s non-cielenie kontrolnej siRNA alebo siRNA SPARC. Znížila SPARC expresie viedla na inhibíciu invázie 69% a 79% v MGC803 a HGC27, v danom poradí (obrázok 2B, C). Dohromady tieto výsledky jasne ukazujú, že potlačenie SPARC inhibuje migrácie a invázie schopnosť MGC803 buniek a HGC27 buniek.
Znižujúca množstvo SPARC prejavu inhibuje rast rakovinových buniek žalúdka in vitro
Skúmali sme, či SPARC siRNA by mohli spomaliť prežitie buniek karcinómu žalúdka. MGC 803 a HGC 27 rakovinové bunky žalúdočné transfekované siRNA SPARC prežil na zníženie sadzieb vo vzťahu k uzavreté buniek transfektovaných s non-zacielenie ovládanie siRNA (obrázok 3A). Downregulaci SPARC expresia nevyvolal zástavu bunkového cyklu v rakovinových bunkách žalúdka. Skúmali sme účinky SPARC siRNA na progresiu bunkového cyklu. Umlčanie SPARC v MGC803 a HGC27 buniek nezmenila G1 alebo S fázy populácie pri 72 h po transfekciu s SPARC siRNA v porovnaní s negatívnou kontrolnou skupinou (obrázok 3B). Obrázok 3 Účinky SPARC Knockdown na rast buniek v žalúdočnej nádorových bunkových línií. polovičný dátový vľavo reprezentujú údaje získané z MGC 803 buniek a tie pravé reprezentujú dáta získané z buniek HGC 27. Rast A. Bazálna bol stanovený po 48 hodinách v kompletnom médiu testom MTT. Výsledky sú uvedené ako priemer rastu (v%) príslušného bunkové línie MGC 803 a HGC 27 a sú prostriedky (± SE) stanovenie štyroch zo šiestich samostatných experimentov. Bunky z siRNA a kontrolnej skupiny boli zbierané pre analýzu bunkového cyklu cytometrie. B. Umlčanie SPARC podľa siRNA transfekcia nezmenil distribúciu bunkového cyklu v MGC 803 a HGC 27 buniek karcinómu žalúdka. MGC 803 a HGC 27 bunky boli transfekovány SPARC siRNA alebo siRNA negatívna kontrola. 72 hodín po transfekciu, obsah DNA bol meraný za použitia farbenia propidium jodidom (PI) v prietokovej cytometrie.
Inhibícia expresie SPARC zvyšuje apoptózu v rakovinových bunkách žalúdočných
Skúmali sme, či siRNA SPARC by mohlo vyvolať bunkovú smrť v karcinómu žalúdka bunkové línie. Liečba MGC803 a HGC27 buniek SPARC siRNA zvyšuje čoskoro apoptotických buniek, ako aj neskoré apoptotických buniek, v porovnaní s negatívnou kontrolnou siRNA ošetrenie (obrázok 4A), ako je merané testom annexinu V. Ako sa dalo očakávať, znížená prežitie buniek transfekciou siRNA SPARC bola spojená so zvýšeným výskytom apoptózy o 91% v MGC803 a 92% v HGC27 bunkách (Obrázok 4B). Tieto zistenia naznačujú, že SPARC sa podieľa na apoptóze pre udržanie bunkovej prežitie v niektorých žalúdočných nádorových buniek. Obrázok 4 SPARC porazený výsledky v indukcii apoptózy v žalúdku nádorových bunkových línií. Pre analýzu prietokovou cytometriou, boli bunky zozbierané 96 hodín po transfekciu s SPARC siRNA alebo siRNA negatívna kontrola, zafarbia annexin V-FITC a propidium jodidu (PI). polovičný dátový vľavo reprezentujú údaje získané z MGC 803 buniek a tie pravé reprezentujú dáta získané z buniek HGC 27. Percentá annexinu V /PI (zavčas proapoptotický) a annexinu V /PI (neskoré apoptotické bunky) je zobrazený na každom paneli. Hodnoty uvedené tučným písmom označujú zníženie SPARC expresie v porovnaní s negatívnou kontrolou siRNA zvýšila o 65% apoptózu v MGC803 a 92% v HGC27.
Proapoptotický účinok SPARC siRNA transfekciou zaobchádzanie v MGC 803 a HGC27 bunky
V snahe objasniť mechanizmus SPARC siRNA indukovanej apoptózy v bunkách 803 MGC a HGC27 buniek, hladín expresie apoptotických-regulačných proteínov, ako je Bcl-2, Bax a kaspázy-3 a PARP boli hodnotené. MGC 803 bunky a HGC27 bunky boli transfekovány SPARC siRNA. Ako je znázornené na obrázku 5, neboli významné rozdiely vo vyjadrení Bax a Bcl-2 v MGC 803 buniek a HGC27 buniek v porovnaní s negatívnou kontrolnou skupinou (P menšia ako 0,05 a P 0,01). V reakcii na apoptotické stimuly, procaspase-3 sa štiepi do kDa fragmentu 20, a následná autokatalyticky reakcia vedie k tvorbe aktívneho 17 kDa fragmentu. Ak je aktivovaná kaspázy-3, PARP sa odštiepi. Takto štiepenie PARP sa používa ako indikátor apoptózy. Za účelom získania priame dôkazy o tom, vzťah kaspázy aktivácia a apoptózy, procaspase-3 štiepenie PARP a boli skúmané v MGC 803 buniek a buniek po HGC27 SPARC siRNA transfekovány. Ako je znázornené na obrázku 5, SPARC siRNA vyvolané štiepenie 32 kDa procaspase-3 na jej aktívnej 17 kDa forma a štiepenie PARP sa objavil v MGC 803 bunky a HGC27 bunky. Obrázok 5 Expresia proteínov v apoptózy MGC 803 a HGC27 buniek po transfekciu buď s kontrolou alebo SPARC siRNA. Fragmenty buniek boli separované na 10% SDS-PAGE gélu, prenesené na nitrocelulózové membránu a testované s anti-PARP, anti-kaspázy-3, anti-Bcl-2, a anti-Bax. Obsah bielkovín boli normalizované sondovaním rovnakej membrány s anti-beta-aktínu. . Polovičná zostávajúce dáta reprezentujú dáta získané z MGC 803 buniek a tie správne predstavujú údaje získané z buniek HGC 27
Diskusia
sekrečnú proteín, a bohaté na cysteín, SPARC (tiež známy ako osteonektin, alebo bazálny membránou-40 , BM-40), je členom rodiny proteínov matricellular, ktorého funkciou je modulovať interakcie bunka-matrice a bunkové funkcie, bez toho aby sa zúčastňuje štrukturálne lešenia extracelulárnej matrix. Nadmerná expresia SPARC bola dokumentovaná v niekoľkých typov solídnych nádorov, ako je rakovina prsníka [7], prostaty [8], melanóm [9] a glioblastómu [10]. Na rozdiel od toho nižšej úrovne SPARC expresie boli nájdené v iných typov rakoviny, ako je napríklad vaječníkov [11], [12] kolorektálny, pankreasu [13, 14] a akútna myeloidná leukémia [15]. Tieto pozorovania naznačujú, že karcinogénny účinok SPARC je bunkový typ špecifické a môžu byť závislé na nádorové bunky okolitého prostredia.
Znalosti o SPARC funkciách v rakovinových bunkách žalúdka je ešte riedky. Niektoré Imunohistochemické štúdie [16-20, 22] spoločne oznámili up-regulácia SPARC u karcinómu žalúdka v porovnaní s nonneoplastic sliznice. Wewer a spol. [17] opisuje diferenciálnej expresiu SPARC v epiteliálnych a stromálnych oddeleniami šiestich vzoriek s karcinómom žalúdka. Maeng [18] zistili, že SPARC je vysoko exprimovaný v reaktívnym stromálnych spojené s invazívnymi diferencovaných adenokarcinómov a že môže slúžiť ako užitočný klinický diagnostický marker pre rakovinu žalúdka. Wang a spol. [16] tiež zistené, že rozdielne exprimované SPARC u pacientov s rakovinou žalúdka ako bolo zistené analýzou génov poľa, kvantitatívnej RT-PCR, a imunobarvení, vyššia SPARC expresia bola významne spojená s progresiou nádoru a pokročilých štádií rakoviny žalúdka. Franke et al. [20] preukázali na väčšie série pacientov, ktorá SPARC sú rozdielne exprimované v karcinómov žalúdka a že jeho expresie koreluje s progresiou nádoru a uzlový rozotrie tkanivových mikročipov (TMA), úroveň expresie SPARC, stanovené pomocou imunohistochémia, korelované v črevnej typu rakoviny žalúdka u miestneho rastu nádoru, uzlového šírenie a štádiom nádoru podľa Medzinárodnej únie proti rakovine. Zhao ZS a spol. [19] zistili, že SPARC bola detekovaná u 334 z 436 prípadov u ľudí s rakovinou žalúdka a bol vysoko exprimovaný vo 239 nádorov. V štádiu I, II, a III, 5-ročné prežitie u pacientov s vysokou expresiou SPARC bola významne nižšia ako u pacientov s nízkou expresiou. Ďalej multivariačný analýza ukázala, že upregulace SPARC, MMP-2 a integrínu beta1, boli nezávislé prognostické ukazovatele za chorobu.
Sme zhromaždili 49 rakovinou žalúdka tkaniva a zodpovedajúce normálne tkanivá pomocou chirurgických zákrokov (Jie Yin, Guowei Chen, Si Liu, Jianxun Zhao, Yucun Liu: Expresia SPARC do ľudského karcinómu žalúdka je spojený s klinicko-patologické rysy, boli predložené). Distribúcia a expresia SPARC boli pozorované pomocou imunohistochémia, Western blot a RT-PCR, resp. SPARC proteín a mRNA vyjadrená významne vyššia v žalúdočných rakovinové tkanive v porovnaní s normálnou tkanív. Stupne jeho expresie boli spojené s diferenciáciou nádoru, divízia TNM, peritoneálnej siatie a vaskulárnej invázie pozoruhodne. Pacienti s vysokou expresiou SPARC majú horšiu prognózu ako tí s nízkou expresiou SPARC.
Dohromady vyššia SPARC expresie bola významne spojená s progresiou nádoru a pokročilých štádiách rakoviny žalúdka. Nedávny výskum Inoue M et al [23], aj identifed SPARC ako kandidát cieľový antigén pre imunoterapiu rôznych druhov rakoviny, vrátane rakoviny žalúdka u genómu-široký cDNA mikročipu. Je zaujímavé, že liečba zameraná na SPARC podjednotku môže byť užitočným prístupom k potlačeniu žalúdočnej rast rakoviny. Avšak molekulárne mechanizmy zodpovedné za onkogenézy SPARC s karcinómom žalúdka nie je úplne objasnený. Prostredníctvom expresie analýzou panelu žalúdočných nádorových bunkových línií sme ukázali, že SPARC je nadmerne exprimovaný u Sevel ľudských nádorových bunkových línií žalúdka. Preto sme testovali naše hypotézy, že SPARC môže byť kľúčovou molekulou v žalúdočnej rakoviny invázii, a že zacielenie SPARC môže predstavovať novú liečebnú stratégiu na boj proti invázii rakoviny žalúdka.
Šírenie rakovinových buniek, a to buď lokálne alebo na vzdialenom metastázujúci lokalít, vyžaduje, aby malígne bunky získavajú schopnosť napádať bazálnej membránou a priľnúť k iným matíc. Bolo navrhnuté, že SPARC môže hrať kľúčovú úlohu v počiatočných krokov v procese nádorovej invázie a metastáz [24]. Okrem toho, SPARC môže indukovať expresiu metaloproteinázy alebo enzýmov, ktoré následne hrajú dôležitú úlohu pri degradácii bazálnej membrány a zložiek extracelulárnej matrice [25]. SPARC bol spájaný s invazivitě meningeómy [26, 27] a [28] gliómov. Okrem toho, potlačenie SPARC expresie pomocou antisencie RNA inhibujú motilitu a inváziu buniek rakoviny prsníka in vitro [21].
Pre stanovenie, či SPARC siRNA môže znížiť protumorigenic bunkovej správanie spojené s expresiou SPARC, najprv určí účinok zníženej SPARC výraz na inváziu nádorových buniek. Merali sme schopnosť buniek karcinómu žalúdka k invázii do Matrigelu, umelý extracelulárnej matrix po transfekciu siRNA SPARC alebo non-cielené riadenie siRNA. Znížila SPARC expresie viedla k inhibícii invázie o 69% a 79% v MGC803 a HGC27, resp. Tak SPARC siRNA môže znížiť žalúdočnej inváziu rakovinových buniek in vitro.
Nedávna štúdia zistila, že SPARC chráni bunky pred apoptózou stresom indukované in vitro cez interakciu s integrín D1 heterodiméry, ktoré zvyšujú aktiváciu ILK a kontrolujúcich prežitie činnosť [28]. Počiatočné štúdie využívajúce antisencie stratégie, RNA úplne zrušila ľudský rast melanómu u nahých myší [21]. Horie a spol. [29] ukázali, že zníženie expresie SPARC expresie indukované inhibíciu rastu s G 1 zatknutie v ľudských bunkách melanómu. Bolo oznámené, že SPARC podporuje prežívanie buniek gliómu cez Akt aktiváciu prostredníctvom integrinové signalizáciu v podmienkach bez séra [30]. Tieto správy silne naznačujú, že SPARC hrá úlohu ako antistresový faktor.
Na druhej strane, niektoré články zistené, že SPARC môže podporovať apoptózu v rakovinových bunkách. Yiu et al [11] ukázal, že exogénny ošetrenie rôznych ovariálnych nádorových bunkových línií s SPARC indukovanú apoptózu. Said a Motamed [31] zistili expozície SPARC zvýšil štiepi kaspázy 3 v ľudských bunkách karcinómu vaječníkov, ktorý podporuje skoršie pozorovania. Pankreasu [13] a vaječníkov rakoviny [30] vykazovala väčší rast a znižuje apoptózu po implantovaní do SPARC - /-. V kolorektálnych rakovinových bunkových línií, zvýšená expresia SPARC znižuje životaschopnosť buniek a zvýšenú apoptózu v bunkách vystavených pôsobeniu rôznych chemoterapeutických činidiel [32].
Týchto zdanlivo paradoxné pozorovanie v rámci každého typu rakoviny a v rôznych druhov rakoviny sa dá vysvetliť tým, Tai chápanie SPARC biology [33]: menšie peptidové fragmenty SPARC zastupujúce rôzne oblasti SPARC priznať biologickej aktivity, ktoré v čase, bránil iných fragmentov alebo natívne SPARC proteínu. Vzhľadom k tomu, profilu proteázy v mikroprostredie nádoru sa môžu líšiť v rôznych typoch rakoviny, a ako SPARC je známe podrobiť proteolýze matrixových metaloproteinázy [34], tieto rozdiely, v kombinácii so zmenami v miestnom zložení molekuly matrice a cytokínov, môže byť celý prispievať k komplexné správanie SPARC v rôznych typov rakoviny.
na objasnenie účinkov SPARC siRNA na žalúdočné rastu rakovinových buniek, proliferácia MTT test bol vykonaný pre porovnanie proliferácie medzi SPARC siRNA transfekovány a kontrolné transfekované MGC803 a HGC 27 buniek. MGC803 a HGC27 buniek karcinómu žalúdka transfekované siRNA SPARC prežil znížila ceny vzhľadom k uzavreté buniek transfektovaných s non-zacielenie riadenie siRNA (obrázok 3). Znížená prežitie buniek transfekciou siRNA SPARC bola spojená so zvýšeným výskytom apoptózy, ako merané testom annexinu V. SPARC zníženie expresie zvýšená o 91% apoptózu v MGC803 a 92% v HGC27 (obrázok 4B).
Aktívne kaspázy hrajú významnú úlohu v indukcii apoptózy. Keď bol aktivovaný kaspázy-3, PARP sa odštiepi neskoro. Zvyčajne sa štiepenie PARP bola použitá ako indikátor apoptózy. V tejto štúdii sme zistili, SPARC siRNA aktivovanej kaspázy-3 na výrobu štiepi kaspázy-3 (P17) fragmenty v MGC 803 buniek a HGC 27 za 48 hodín. V rovnakej dobe bola tiež zistená štiepenie PARP. Výsledky ukazujú, že SPARC indukované fragmentácii PARP, rovnako ako zvýšenú kaspázy-3 aktivitu v MGC 803 buniek.
Rodiny Bcl-2 proteíny boli hlásené pre reguláciu apoptózy kontrolovaním mitochondriálnej priepustnosti membrány. SPARC sa reguloval expresiu Bax a dole regulovať expresiu Bcl-2 v MGC 803 bunky a bunky HGC 27. Zistili sme, že SPARC siRNA by mohlo vyvolať žalúdočné rakovinových buniek apoptózu a zároveň znížiť pomer Bcl-2 Bax. Preto regulácia Bcl-2 a Bax expresie môže byť kľúčový mechanizmus stojaci SPARC indukciu apoptózy v nádorových bunkách žalúdka.
Takže naše dáta ukazujú, že zníženie expresie SPARC inhibuje bunkovú proliferáciu buniek karcinómu žalúdka od začatia apoptózy, ktorý svedomie s melanómu a gliómu, ale v rozpore s vaječníkov a pankreasu rakoviny. Indukcia apoptózy bol čiastočne regulovaný na mitochondriálnej cestou, ako je aktivácia kaspázy dráhy, ako aj štiepenie PARP. Budúce štúdie sa musí zamerať na presný mechanizmus.
Na záver, naša súčasná údaje naznačovali, že SPARC hral dôležitú úlohu v apoptóze a metastázy rakoviny žalúdka. V súčasnosti neexistujú žiadne účinné postupy na liečenie neskorom štádiu rakoviny žalúdka. Ako zvýšená expresia SPARC je spojené so znížením žalúdočnej prežitie pacienta s rakovinou [16], veríme, že naše výsledky, ktoré preukazujú znížila invázii a zvýšenie bunkovej smrti s siRNA namierenou proti SPARC, naznačujú, že klesajúci SPARC výraz môže mať terapeutický prínos pre pacientov s rakovinou žalúdka.
deklarácia
Poďakovanie
Táto práca bola podporovaná Národným Scientific Technologický sprievodný projekt fondu [30901417]. Ďakujeme profesora Yang KE a Xiaojuan Du z Peking University Health Science Centre, Peking, Čína, pre technickú podporu.
Autori ďalej len "pôvodné predložený súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na autorov pôvodnej predložených súborov pre obrázky. "Pôvodný súbor pre Obrázok 1 13046_2010_306_MOESM2_ESM.jpeg autorského 13046_2010_306_MOESM1_ESM.jpeg autorov pôvodného súboru na obrázku 2 13046_2010_306_MOESM3_ESM.jpeg autorského pôvodného súboru pre Obrázok 3 13046_2010_306_MOESM4_ESM.jpeg autorského pôvodného súboru originálneho súboru Obrázok 4 13046_2010_306_MOESM5_ESM.jpeg autorského na obrázku 5 konkurenčné záujmy
autori vyhlasujú, že nemajú žiadne protichodné záujmy.

• Metalothioneín 2A inhibuje aktiváciu NF-kB dráhu a predpovedá klinický výsledok po radikálnej resection
• Hlboká sekvenovania karcinómu žalúdka odhaľuje somatické mutácie sú relevantné pre personalizované medicine