Downregulation SPARC ilmaisun pienenee mahasyövässä solujen invaasiota ja selviytymisen

Downregulation SPARC ilmaisun pienenee mahasyövässä solujen invaasiota ja selviytymisen
tiivistelmä
tausta
erittyvän proteiinin happamien ja runsaasti kysteiiniä (SPARC) on keskeinen rooli kehitettäessä monissa kudoksissa ja elimen tyyppejä. Poikkeava SPARC ekspressio havaittiin monenlaisia ​​ihmisen syövissä, vaikuttaa kasvaimen kehittymisen. Koska SPARC havaittiin yliekspressoituvan ihmisen mahasyövän kudos, siksi tutkia ilmentymistä SPARC mahasyövän linjat ja syöpää aiheuttavia mekanismeja. Tool Menetelmät
SPARC ilmentyminen arvioitiin paneelin ihmisen mahasyövän solulinjoissa . MGC803 ja HGC 27 mahasyövän jotka ilmentävät korkeaa SPARC transfektoitiin ohimenevästi SPARC-erityisiä pieniä häiritseviä RNA: ita ja myöhemmin arvioitiin vaikutuksia hyökkäystä ja leviämistä.
Tulokset
Sirna välittämää knockdovvn SPARC vuonna MGC803 ja HGC 27 mahalaukun syöpäsolut dramaattisesti vähentäneet hyökkäystä. Knockdown SPARC havaittiin myös lisäämään merkittävästi apoptoosiin MGC803 ja HGC 27 mahasyövän soluja verrattuna kontrollitransfektoidut ryhmään.
Johtopäätökset
Tuloksemme osoittivat, että downregulating SPARC estää hyökkäyksen ja kasvua ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Näin ollen, SPARC voisi olla tehokas terapeuttinen lähestymistapa vastaan ​​mahasyövässä.
Johdanto
Mahalaukun syöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti ja on yksi aggressiivinen kasvaimet ja liittyy usein imusolmuke etäpesäke, vatsakalvon levittämistä, ja hematogenous etäpesäkkeitä [1]. Kokonaisuutena 65-70% uusista tapauksista ja kuolemantapauksia mahasyöpä esiintyy vähemmän kehittyneissä maissa [2]. Vuonna 2005 ilmaantuvuus mahasyövän (0,3 miljoonaa kuolemaa ja 0,4 miljoonaa uutta tapausta) sijoittui kolmanneksi yleisimpiä syöpiä Kiinassa [3]. Nykyinen hoitomuotojen pitkälle tai metastasoituneen mahasyövän vähän vaikutusta, kirurginen poisto resektio viereisten imusolmukkeiden tarjoaa ainoa mahdollisuus parannuskeino, joka on alle 33%: lla mahalaukun syöpä. 5 vuoden pysyvyys on vain 30-40%, jossa on huonompi ennuste pitkälle kasvaimia. Ymmärtäminen molekyyli- mekanismit etenemisen mahalaukun syöpä voi tarjota oivalluksia uusia terapeuttisia kohteita.
Eritetty proteiini happamia ja runsaasti kysteiiniä (SPARC; tunnetaan myös osteonektiini tai BM-40) kuuluu Soluvälitilan perheen erittyvien proteiinien [4 ]. SPARC on ei-rakenteellista osa matriiseina joka moduloi soluväliainekonstruktissa vuorovaikutuksia, erityisesti aikana kudosten kehitystä, remodeling ja korjata [5]. Monet syöpätyypit on ominaista ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentyminen SPARC [6]. Yliekspressio SPARC on dokumentoitu useita erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia, kuten rinta- [7], eturauhassyöpä [8], melanooma [9] ja glioblastoomat [10]. Sitä vastoin alhaisemmat SPARC ilmentymisen on havaittu muiden syöpien, kuten munasarjojen [11], peräsuolen [12], haiman [13, 14], ja akuutti myelooinen leukemia [15]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että kasvaimia aiheuttavasta vaikutuksesta SPARC on solutyyppispesifisiä ja se voi olla riippuvainen kasvain solun ympäristöön.
Tietoa SPARC toimintoja mahasyövässä soluissa on edelleen niukkaa. Yli-ilmentyminen SPARC-geenin havaittiin ihmisen mahasyövän viidessä muussa raporteissa [16-20]. Kuitenkin kaikki edellä mainitut tutkimukset ei ollut yksityiskohtaisesti mahasyövässä solulinjoissa ja syöpää aiheuttavia mekanismi. SPARC on liittynyt aggressiivinen vaiheisiin mahasyövän ja korreloi huonon ennusteen [16], mikä viittaa siihen, että vähentäminen SPARC ilmentyminen voi olla terapeuttista hyötyä. Todellakin, ilmentyminen antisense oligonukleotidien vastaan ​​SPARC melanoomasoluissa esti kasvaimen muodostumisen [21]. Tarkka biologinen ja molekyylitason mekanismit, joiden kautta väheneminen SPARC ilmaus voisi edistää parempaa kasvaimen hoito on vielä tutkittava. Siksi käsillä olevan tutkimuksen tarkoituksena oli luonnehtia SPARC toimintoja mahasyövässä soluissa ja tutkia sen mahdollisesti syöpää aiheuttava mekanismi.
Materiaalit ja menetelmät
Soluviljely
Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 saatiin Cancer Institute of Chinese Academy of Medical Science. Kaikki solut kasvatettiin RPMI 1640 (GIBCO ™) väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, penisilliini G (100 yksikköä /ml), ja streptomysiinillä (100 ug /ml), jota kutsutaan täydellistä alustaa. Soluja ylläpidettiin yksikerrosviljelmässä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmassa, jossa oli 5% CO 2.
Kemikaalit ja reagenssit
EDTA-2 natrium-, akridiini oranssi, etidiumbromidia (EB) ja 3- [4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5-difenyyli tetrazoliumbromide (MTT) hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Hiiren monoklonaalinen vasta-aine spesifinen P-aktiini oli Sigmalta. Kanin polyklonaalisia vasta-aineita spesifisiä Bcl-2 (sc-492), kaspaasi-3 (sc-7148) ja PARP (sc-7150) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Hiiren monoklonaalisia vasta-aineita spesifisiä SPARC (sc-74295) ja Bax (sc-7480) saatiin Santa Cruz Biotechnology. Vuohen anti-kani-(w3960) ja anti-hiiri (w3950) sekundääriset vasta-aineet hankittiin valmistajalta Promega (Madison, WI, USA).
RNAi ja transfektio
Human SPARC siRNA ja ohjaus siRNA olivat Dharmacon Bioscience Corp (Chicago , IL, USA). Ekvimolaariset määrät siRNA: ita käytettiin kohti valmistajan ohjeiden kanssa ohjaus ei kohdistaminen siRNA (CTRL). 150 000 solua maljattiin kohti kuuden kuoppa DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää ja annettiin kiinnittyä yön yli. Ekvimolaariset määrät siRNA: ita inkuboitiin TransIT-TKO transfektioreagenssi alkaen Mirus (Madison, WI, USA) kohti valmistajan ohjeiden. Soluja ylläpidettiin 48 tuntia ennen kokeita, ellei toisin ole kuvattu
Western blot-analyysi
Kaksikymmentä mikrogrammaa kokonais-proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Sitten membraania inkuboitiin vasta-aineiden kanssa, jotka ovat spesifisiä SPARC (Santa Cruz, 1: 500) tai anti-β-aktiini (Sigma, 1: 1000) yli yön 4 ° C: ssa. Sitoutuneet vasta-aineet visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi. Vahvista yhtä suuri kuin membraa- neja tislattiin 30 minuutin ajan 50 ° C: ssa puskurissa, joka sisälsi 2% SDS: ää, 62,5 mM Tris (pH 6,7), ja 100 mM 2-merkaptoetanolia ja uudelleenseulottiin anti-β-aktiini-vasta-aine osoittaa yhtä suuri loading . Tiheys nauhojen kvantifioitiin densitometrinen analyysi käyttäen ImageTool (versio 3.0) järjestelmä.
RT-PCR
Kokonais-RNA (1-2 ug), käänteiskopioitiin käyttäen SuperScript pre-monistusta (Invitrogen, Carlsbad , CA). Alukkeet perustuivat sekvensseihin raportoi Genebankin (NM 003118). SPARC sense sekvenssi oli 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'ja SPARC anti-sense-sekvenssin 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3'. Odotettu tuote koko SPARC cDNA oli 512bp. ß-aktiini sense sekvenssi oli 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'ja ß-aktiini anti-sense-sekvenssin 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. Odotettu tuote koko beta-aktiini-cDNA oli 514bp. PCR-monistus suoritettiin 25 ul: ssa reaktioseosta määriä, joka sisälsi 0,2 uM dNTP: itä, 20 pmol kutakin oligonukleotidialuketta, ja 0.2U Tag-polymeraasia PCR-puskurissa. cDNA: ta monistettiin PCR-lämpösäätelijään kanssa alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi sykliä 95 ° C 1 min, 65 ° C 1 min, ja 72 ° C 1 min, 27 sykliä, ja lopullinen jatkamisvaihe 72 ° C: ssa 10 min. Määrä alkaa cDNA säätää β-aktiini-intensiteetti.
Cell migraatiokokeessa
solujen kyky siirtää suodattimien läpi, mitattiin käyttäen BioCoat Matrigel hyökkäyksen kammion (BD Biosciences, San Jose, CA). Soluviljely lisää jossa on 8 mm: n huokoskoon PET-kalvo käytettiin protokollan mukaisesti valmistajan. Alaosaan mukana elatusaineessa (0,75 ml), joka sisälsi 10% FCS: ää, kun taas SPARC siRNA transfektoitu tai ohjaus transfektoidut solut (1,0 x 10 5 suspendoitiin 0,5 ml: aan alustaa, joka sisälsi 1% FCS) ympättiin ylempään kammioon ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO 2. Remaning solujen yläpinnan oli poistetaan mekaanisesti. Sitten membraanit pestiin, kiinnitettiin ja värjättiin Diff-Quik (Medion Diagnostics). Solujen lukumäärä, jotka kulkeutuivat alapintaan suodattimien määritettiin laskemalla värjäytyneiden solujen valomikroskoopilla kolmessa riippumattomassa alalla (0,25 mm 2 /kuoppa).
Solujen kasvun ja elinkyvyn
vaikutus SPARC siRNA on solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. Lyhyesti, MGC803 ja HGC 27-solut maljattiin 1 x 10 4 solua kuoppaa kohti yhdeksänkymmentäkuusi-kuoppaisille mikrotiitterilevyille. Kun oli inkuboitu 72 tuntia, solujen elinkelpoisuus määritettiin. Sitten 20 ui MTT: tä (10 mg /ml PBS: ssä varastossa, laimennettiin työskennellä pitoisuuteen 1 mg /ml, jossa media) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tuntia. Varovaisen poiston jälkeen väliaineen, 200 ui dimetyylisulfoksidia lisättiin kuhunkin kuoppaan ja sekoitettiin huolellisesti. Absorbanssi kirjattiin lukulaitteeseen (ELX 800; Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, USA) 570 nm aallonpituudella. Vaikutus SPARC siRNA solujen kasvun esto arvioitiin Prosentuaalinen solujen elävyyden, jossa ajoneuvon käsitellyt solut otettiin 100% elinkelpoisia.
Solusyklianalyysiä ja anneksiini V-värjäyksen
Virtaussytometristä solusyklin analyysi, soluja käsiteltiin siRNA kerättiin, pestiin PBS: llä, fiksoitiin kylmässä 70% etanolia, ja säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes värjäys. Kiinnityksen jälkeen solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 50 ug /mL RNaasiA (Sigma) 30 min 37 ° C: ssa, ennen kuin värjäämällä 50 ug /mL propidiumjodidia (Sigma). Apoptoottisia soluja alussa ja loppuvaiheissa havaittiin käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit BioVision (Mountain View, CA, USA). Lyhyesti, solut transfektoitiin siRNA: lla. 96 h transfektion jälkeen, elatusaineet ja solut otettiin talteen ja sentrifugoitiin. Pesun jälkeen solut suspendoitiin uudelleen 490 ui anneksiini V: n sitoutumisen puskuria, minkä jälkeen lisättiin 5 ui anneksiini V-FITC: tä ja 5 ui propidiumjodidia. Näytteitä inkuboitiin pimeässä 5 min huoneen lämpötilassa ja analysoitiin virtaussytometriaa käyttämällä.
Tilastot
Tulokset ilmaistiin tarkoittaa ekspressiotasoja (± SD). Studentin t
-testi tai rank sum testiä käytettiin tilastolliseen analyysiin. P-arvo < 0.05 otettiin merkitsevyystaso (kaksipuolinen).
Tulokset
ilmentäminen SPARC viljellyissä mahasyövässä solujen
Ensin arvioitiin endogeenisen ilmentymisen SPARC useissa ihmisen mahasyövän solulinjoissa. Olemme havainneet, että SPARC-proteiinin ja mRNA olivat vallalla MGC803 ja HGC27 soluja, jotka on tuotettu alemmilla tasoilla SGC7901 solulinja ei voitu todeta NCI-N87 ja BGC823 solulinjoissa (kuvio 1). Kuva 1 ilmentäminen SPARC mahasyövän solulinjoissa. A, immunoblottianalyysi käyttäen kaniinin polyklonaalista SPARC-ainetta (1: 500). B, Erityiset RT-PCR (RT-PCR) analyysi SPARC. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. C, suhteellinen SPARC mRNA ekspressiotasot. Autoradiograafit skannattu ja analysoitu densitometrisesti seurasi kvanti- suhteessa P-aktiini. Tulokset on esitetty, kuten ilmentymistä (in%) suhteessa p-aktiini ja ovat keskiarvoja (± SD) 3 kokeen.
Inhibitio endogeenisen SPARC ilmentymisen
Tämän ensimmäisen seulonnan, MGC803 solut ja HGC27 solut, jotka ilmentävät suhteellisen korkeita endogeenisten SPARC perustettiin knockdown ilmentävät SPARC sisään tilapäisellä tavalla määrittää tärkeyttä endogeenisen SPARC ilmaisua. Kuten kuviossa 2A on esitetty, SPARC ilmentyminen inhiboitui SPARC siRNA transfektanttien proteiinin tasoja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että nämä SPARC siRNA onnistuneesti kohdistavat äänenvaimennusvaikutus SPARC ilme. Kuvio 2 vaikutus SPARC Knockdown on soluvaelluksen mahasyövässä solulinjoissa MGC 803 ja HGC 27 solua. A. SPARC ilmentyminen MGC 803 ja HGC 27, ohjaus ja SPARC siRNA transfektoiduissa soluissa havaittiin immunoblottausanalyysillä käyttäen kaniinin polyklonaalista SPARC-ainetta (1: 500). p-aktiini käytettiin latauskontrollina. B. Vaikutukset SPARC Knockdown on soluvaelluksen mahasyövässä solulinjoissa. SPARC ilmentyminen pudotettiin vuonna MGC 803 ja HGC 27 soluihin käyttäen SPARC siRNA ja alistettiin migraatiokokeessa kaksipilarityyppisellä chambered invaasio kuvattua laitteistoa Materiaalit ja menetelmät, histogrammi, jolla esitetään inhibitioprosentti MGC 803 ja HGC 27 soluinvaasiota. Koe tehtiin kolmena kappaleena ja saadun arvon salattu siRNA transfektoiduista soluista asetettiin 100%.
Alassäätely SPARC ilmaisun estyy mahan syöpäsolujen invaasiota in vitro
Sen määrittämiseksi SPARC siRNA voisi vähentää protumorigenic solujen käyttäytymistä liittyy SPARC ilme, ensin määritti laski SPARC ilmaisun kasvainsolun invaasiota. Cell invaasiomääritys suoritettiin tämän jälkeen käyttämällä Transwell kammiot. Mittasimme kapasiteettia mahasyövän solujen hyökätä läpi Matrigel, keinotekoisen soluväliaineen, transfektion jälkeen ei-kohdistuksen ohjaus siRNA tai SPARC siRNA. Vähentynyt SPARC ilmentyminen johti inhibition hyökkäystä 69% ja 79% on MGC803 ja HGC27, vastaavasti (kuvio 2B, C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat selvästi, että tukahduttaminen SPARC estää migraation ja invaasion kyky MGC803 solujen ja HGC27 soluja.
Alassäätely SPARC ilmaisun estää kasvun mahalaukun syöpäsolujen in vitro
Olemme tutkineet, onko SPARC siRNA voisi alentaa selviytyminen mahalaukun syöpäsoluja. MGC 803 ja HGC 27 mahasyövän transfektoitujen solujen SPARC siRNA selvinnyt hengissä laski hinnat suhteessa täsmäsi transfektoitujen solujen ei-kohdistuksen ohjaus siRNA (kuvio 3A). Downregulation SPARC ilmaisua ei aiheuttanut solukierron pysähtymisen mahalaukun syöpäsoluja. Tutkimme vaikutukset SPARC siRNA solusyklin etenemisen. Hiljentäminen SPARC vuonna MGC803 ja HGC27 solut eivät muutu G1 tai S-vaiheessa populaatioiden 72 h transfektion kanssa SPARC siRNA verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään (kuvio 3B). Kuva 3 Vaikutukset SPARC Knockdown solujen kasvuun mahasyövän solulinjoissa. vasen puoli tiedot edustavat saatuja tietoja MGC 803 soluista ja oikeat edustavat saatuja tietoja HGC 27 soluista. A. Basal kasvu määritettiin 48 tunnin kuluttua täydellisessä väliaineessa MTT-määritystä. Tulokset on esitetty keskiarvona kasvua (in%) vastaavien MGC 803 ja HGC 27-solulinjan ja ovat keskiarvoja (± SE) neljän rinnakkaisen määrityksen kuudesta erillisestä kokeesta. Soluja siRNA ja kontrolliryhmien kerättiin cytometry solusyklin analyysi. B. hiljentäminen SPARC siRNA transfektion ei muuttunut solusyklin jakautumista MGC 803 ja HGC 27 mahalaukun syöpäsoluja. MGC 803 ja HGC 27 solut transfektoitiin SPARC siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA. 72 h transfektion jälkeen, DNA-pitoisuus mitattiin käyttäen propidiumjodidia (PI) värjäytymisen virtaussytometrialla.
Inhibitio SPARC ilmentymisen parantaa apoptoosin mahasyövän soluissa
Olemme tutkineet, onko SPARC siRNA voi indusoida solukuoleman mahasyövän solulinjat. Hoitoon MGC803 ja HGC27 solujen SPARC siRNA lisääntynyt varhainen apoptoottisten solujen sekä myöhään apoptoottisia soluja verrattuna negatiiviseen kontrolliin, siRNA hoitoa (kuvio 4A) mitattuna anneksiini V-määrityksellä. Kuten odotettua, vähentynyt selviytymisen transfektoitujen solujen SPARC siRNA oli yhteydessä lisääntyneisiin apoptoosin 91% vuonna MGC803 ja 92% vuonna HGC27 soluissa (kuvio 4B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että SPARC on mukana apoptoosin ylläpitämiseksi solujen selviytymistä joillakin mahalaukun syöpäsoluja. Kuva 4 SPARC pudotus johtaa apoptoosin induktioon mahasyövän solulinjoissa. Virtaussytometrianalyysiä, solut otettiin talteen 96 h transfektion jälkeen SPARC siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA, sitten värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla (PI). vasen puoli tiedot edustavat saatuja tietoja MGC 803 soluista ja oikeat edustavat saatuja tietoja HGC 27 soluista. Prosenttiosuudet anneksiini V /PI (varhainen apoptoottinen) ja anneksiini V /PI (myöhäinen apoptoottiset) soluissa esitetään kussakin paneelissa. Arvot lihavoitu osoittavat alenevassa SPARC ilmaisua nousi apoptoosin 65% vuonna MGC803 ja 92% vuonna HGC27 verrattuna negatiiviseen kontrolliin siRNA.
Apoptoottinen vaikutus SPARC siRNA transfektoitujen hoitoa MGC 803 ja HGC27 solujen
pyrki valaista mekanismi SPARC siRNA aiheutti apoptoosia MGC 803 soluissa ja HGC27 soluja, ekspressiotasot apoptoottisten sääntelyn proteiineja, kuten Bcl-2, Bax ja kaspaasi-3 ja PARP arvioitiin. MGC 803-solut ja HGC27 solut transfektoitiin SPARC siRNA. Kuten kuviossa 5, oli huomattavia eroja ilmauksia Bax ja Bcl-2 in MGC 803 soluissa ja HGC27 soluja verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään (P < 0,05 ja P < 0,01). Vastauksena apoptoottisten ärsykkeille, prokaspaasi-3 pilkotaan 20 kDa: n fragmentti, ja sen jälkeen katalysoiva reaktio johtaa muodostumista aktiivisen 17 kDa fragmenttiin. Kun kaspaasi-3 on aktivoitu, PARP on hajonnut. Näin pilkkominen PARP käytetään indikaattorina apoptoosin. Saadakseen suoraa näyttöä siitä, että suhde kaspaasin aktivaation ja apoptoosin, prokaspaasi-3 pilkkominen ja PARP tutkittiin MGC 803 soluissa ja HGC27 solujen jälkeen SPARC siRNA transfektoitujen. Kuten on esitetty kuviossa 5, SPARC siRNA indusoi lohkaisu 32 kDa prokaspaasi-3 osaksi sen aktiivinen 17 kDa: n muotoon ja pilkkominen PARP esiintyi MGC 803-soluissa ja HGC27 soluja. Kuva 5 ilmentyminen apoptoosin proteiinien MGC 803 ja HGC27 solujen transfektion jälkeen joko ohjaus tai SPARC siRNA. Solulysaatit erotettiin 10% SDS-PAGE-geelissä, siirrettiin nitroselluloosakalvolle ja koetettiin anti-PARP, anti-kaspaasi-3, anti-Bcl-2 ja anti-Bax. Proteiini sisällöt normalisoitiin luotaa saman kalvo anti-β-aktiini. Vasen puoli Tulokset edustavat saatuja tietoja MGC 803-soluihin ja oikeat edustavat saatuja tietoja HGC 27-soluja.
Keskustelu
eritetty proteiini ja runsaasti kysteiiniä, SPARC (tunnetaan myös nimellä osteonektiini tai kellarissa-kalvoon 40 BM-40), on jäsen perheen Soluvälitilan proteiinit, joiden tehtävänä on moduloida solu-matriisi vuorovaikutuksia ja solujen toimintaa ilman osallistuvat rakenteellisen telineen soluväliaineen. Yliekspressio SPARC on dokumentoitu useita erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia, kuten rinta- [7], eturauhassyöpä [8], melanooma [9] ja glioblastoomat [10]. Sitä vastoin alhaisemmat SPARC ilmentymisen on havaittu muiden syöpien, kuten munasarjojen [11], peräsuolen [12], haiman [13, 14], ja akuutti myelooinen leukemia [15]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että kasvaimia aiheuttavasta vaikutuksesta SPARC on solutyyppispesifisiä ja se voi olla riippuvainen kasvain solun ympäristöön.
Tietoa SPARC toimintoja mahasyövässä soluissa on edelleen niukkaa. Jotkut Immunohistokemiallisten tutkimusten [16-20, 22] kollektiivisesti raportoitu ylös-säätely SPARC mahasyövän verrattuna hyvänlaatuinen limakalvon. Wewer et ai. [17] on kuvattu differentiaalinen ilmentyminen SPARC on epiteeli- ja strooman osastot kuuden mahasyövän yksilöitä. Maeng [18] todettiin, että SPARC ilmenee vahvasti reaktiivisia strooman liittyy invasiivisia eriytetyn adenokarsinomia ja että se voi olla hyödyllinen kliininen diagnostinen markkeri mahasyöpä. Wang et al. [16] havaitsivat myös ekspressoituu differentiaalisesti SPARC mahasyövän potilailla arvioituna geeni erilaisia ​​analyysi, kvantitatiivinen RT-PCR, ja Immuunivärjäystä korkeampi SPARC ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä taudin etenemiseen ja pitkälle edennyt mahasyöpä. Franke ym. [20] osoitti suuremmassa potilaan sarja, joka SPARC ilmentyy differentiaalisesti syöpien ja että sen ilmentyminen korreloi kasvaimen etenemiseen ja solmukohtien leviäminen käyttämällä kudossiruina (TMA), ilmentymistaso SPARC määritetty immunohistokemiallisesti, korreloi suolen-tyyppinen mahasyövän paikallisen kasvaimen kasvua, solmukohtien levitä, ja kasvaimen vaiheessa mukaan International Union syöpää vastaan. Zhao ZS ym. [19] todettiin, että SPARC havaittiin 334 436 ihmisen mahalaukun syöpätapausta ja oli hyvin ilmaistu 239 kasvaimia. Vaiheittain I, II, ja III, 5 vuoden eloonjäämisaste potilaiden, joilla on korkea ilmaus SPARC oli merkittävästi pienempi kuin potilailla, joilla on alhainen ilme. Edelleen monimuuttujamenetelmin ehdotti, että säätelyä SPARC, MMP-2, ja integriini beta1, olivat riippumattomia ennustetekijöitä indikaattorit tauti.
Olemme Kerätyt 49 mahasyövässä kudosten ja vastaavien normaalien kudosten kautta kirurgisia toimenpiteitä (Jie Yin, Guowei Chen, Si Liu, Jianxun Zhao, Yucun liu: n ilmentyminen SPARC ihmisen mahasyövän liittyy kliinisiä-patologiset ominaisuudet, toimitetaan). Jakelu ja ilmentyminen SPARC havaittiin immunohistokemiallisesti, Western-blottauksella ja RT-PCR, vastaavasti. SPARC-proteiinin ja mRNA: n merkitsevästi suurempi mahasyövän kudoksiin verrattuna normaaleihin kudoksiin. Astetta sen ilmaisun liittyi erilaistumista kasvain, TNM jako, vatsakalvon kylvö ja verisuonten invaasio huomattavasti. Potilaat, joilla on korkea ilmentymisen SPARC on huonompi ennuste kuin ne, joilla on alhainen ilmaus SPARC.
Yhdessä korkeampi SPARC ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä taudin etenemiseen ja pitkälle edennyt mahasyöpä. Viimeaikainen tutkimus on Inoue M et al [23] jopa Tunnistettu SPARC ehdokkaaksi kohdeantigeeni immunoterapiassa eri syöpiä, kuten mahalaukun syövän genominlaajuisten cDNA microarray. On jännittävää, että hoito kohdistettu SPARC alayksikkö voi olla hyödyllinen lähestymistapa tukahduttaa mahasyövän kasvua. Kuitenkin molekyylitason mekanismit, jotka synnyssä SPARC mahasyövän ei ole täysin ymmärretty. Ekspressoimalla analyysi paneelin mahalaukun syövän solulinjat, osoitimme, että SPARC yli-ilmentyy myös Sevel ihmisen mahasyövän solulinjoissa. Siksi testasimme hypoteesiemme että SPARC voi olla keskeinen molekyyli mahasyövän hyökkäyksen, ja että kohdistaminen SPARC voi esittää uusia terapeuttisia strategia anti-hyökkäys mahasyövän.
Levittäminen syöpäsolujen, joko paikallisesti tai kaukaisia ​​metastasoitunut sivustoja, edellyttää, että pahanlaatuisia soluja hankkia kyky hyökätä tyvikalvon ja noudattamaan muita matriiseja. On ehdotettu, että SPARC voi olla avainasemassa kauden ensimmäisessä vaiheista kasvaimen invaasion ja metastaasin [24]. Lisäksi SPARC voi indusoida metalloproteinaasien tai entsyymejä, jotka myöhemmin on tärkeä rooli hajoamiseen pohjapinta kalvot ja soluväliaineen komponenttien [25]. SPARC liittyi invasiivisuus on meningiomas [26, 27] ja gliooma [28]. Lisäksi tukahduttaminen SPARC ilmaisun käyttäen antisense-RNA esti liikkuvuutta ja hyökkäys ihmisen rintasyövän soluja in vitro [21].
Sen määrittämiseksi SPARC siRNA voisi vähentää protumorigenic solujen käyttäytymistä liittyy SPARC ilme, ensin määritti laski SPARC ilme kasvainsolun invaasiota. Mittasimme kapasiteettia mahasyövän solujen hyökätä läpi Matrigel, keinotekoisen soluväliaineen, transfektion jälkeen SPARC siRNA tai ei-kohdistuksen ohjaus siRNA. Vähentynyt SPARC ilmaus johti eston hyökkäystä 69% ja 79% vuonna MGC803 ja HGC27, vastaavasti. Siten SPARC siRNA voi pienentää mahasyövän invaasiota in vitro.
Tuoreessa tutkimuksessa todettiin, että SPARC suojaa soluja stressin aiheuttaman apoptoosin in vitro kautta vuorovaikutuksessa integriinin β1 heterodimeerejä, jotka parantavat ILK aktivointi ja prosurvival toimintaa [28]. Alustavat tutkimukset käyttäen antisense-RNA strategioita kumosi kokonaan ihmisen melanooman kasvun nude-hiirissä [21]. Horie et al. [29] osoitti, että downregulation SPARC ilmaisun aiheuttama kasvun esto G 1 pidätys ihmisen melanooman soluissa. On raportoitu, että SPARC edistää glioomasolulinjaa selviytymisen kautta Akt aktivaation kautta integriinin signalointia seerumittomissa olosuhteissa [30]. Nämä raportit viittaavat vahvasti siihen, että SPARC näyttelee roolia antistress tekijä.
Toisaalta, jotkut artikkeleita havaittu, että SPARC voivat edistää apoptoosia syöpäsoluissa. Yao ja työtovereiden [11] osoitti, että eksogeeninen hoitoon eri munasarjasyövän solulinjoissa SPARC aiheuttamaa apoptoosia. Said ja Motamed [31] löydetty SPARC altistuminen kasvoi lohkaista kaspaasi 3 ihmisen munasarjakarsinoomasolut jotka tukivat entinen havainto. Haiman [13] ja munasarjojen syöpien [30] osoitti suurempaa kasvua ja vähentää apoptoosin istutettuna SPARC - /-. Kolorektaalisyövässä solulinjoissa, yliekspressio SPARC vähensi solujen elinkelpoisuuden ja parannettu apoptoosin soluissa alttiina erilaisille kemoterapia-aineiden [32].
Nämä näennäisesti paradoksaalista havainnot kussakin syöpätyypin ja eri syöpiä voidaan selittää Tai ymmärrystä SPARC biology [33]: pienempiä peptidifragmentteja SPARC edustavat eri aloilla SPARC anneta biologisia toimintoja, jotka ajoittain vastustaa muiden fragmenttien tai natiivin SPARC-proteiinin. Koska proteaasi profiilin kasvaimen microenvironment voivat vaihdella eri syöpien, ja kuten SPARC tiedetään läpi proteolyysi matriisimetalloproteinaaseja [34], nämä erot, yhdistettynä muutoksiin paikallisessa koostumuksessa matriisin molekyylejä ja sytokiineja, voivat kaikki olla edistää monimutkaisen käyttäytymistä SPARC eri syöpätyyppien.
Valaistaan ​​vaikutusten SPARC siRNA mahalaukun syöpäsolujen kasvua, MTT runsaudenmäärityksessä suoritettiin vertaamaan leviämisen välillä SPARC siRNA transfektoidut ja kontrollitransfektoidut MGC803 ja HGC 27 solut. MGC803 ja HGC27 mahasyövän transfektoitujen solujen SPARC siRNA selvinnyt hengissä laski hinnat suhteessa täsmäsi transfektoitujen solujen ei-kohdistuksen ohjaus siRNA (kuvio 3). Pienentynyt selviytyminen transfektoitujen solujen SPARC siRNA oli yhteydessä lisääntyneisiin apoptoosin mitattuna anneksiini V määrityksessä. Vähenevät SPARC ilme nousi apoptoosin 91% vuonna MGC803 ja 92% vuonna HGC27 (kuva 4B).
Aktiivinen caspases tärkeä rooli apoptoosin. Kun kaspaasi-3 aktivoitiin, PARP pilkotaan myöhässä. Yleensä pilkkominen PARP käytettiin indikaattorina apoptoosin. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, SPARC siRNA aktivoitu kaspaasi-3 tuottaa katkaistun kaspaasi-3 (p17) fragmenttien MGC 803-soluissa ja HGC 27 48 h. Samaan aikaan, pilkkominen PARP havaittiin myös. Tulokset osoittavat, että SPARC indusoi pirstoutuminen PARP sekä lisääntynyt kaspaasi-3-aktiivisuus MGC 803-soluissa.
Bcl-2-perheen proteiinien on raportoitu apoptoosia säätelevissä ohjaamalla mitokondrion kalvon läpäisevyyden. SPARC ylös säädellään ilmaus Bax ja säädeltiin ilmaus Bcl-2 in MGC 803 soluissa ja HGC 27 solua. Olemme havainneet, että SPARC-siRNA voivat aiheuttaa mahalaukun syöpäsolujen apoptoosia ja samalla vähentää suhde Bcl-2 Bax. Siksi sääntely Bcl-2: n ja Bax: n ilmentyminen olla avainmekanismina taustalla SPARC induktion apoptoosin mahalaukun syöpäsoluissa.
Joten meidän data osoitti, että downregulation SPARC estivät solujen proliferaatiota mahalaukun syöpäsolujen apoptoosin aloittamista, mikä omatunto melanooma ja gliooma, mutta toisin kuin munasarjasyövän ja haimasyövän. Apoptoosin induktio oli osittain säännelty mitokondrioiden reitin kuten aktivointi kaspaasi-reitin sekä pilkkominen PARP. Tulevaisuuden tutkimus on keskityttävä tarkkaa mekanismia.
Johtopäätöksenä nykyinen tiedot osoittivat, että SPARC pelataan tärkeä rooli apoptoosin ja etäpesäkkeiden mahasyövän. Tällä hetkellä ei ole olemassa tehokkaita lähestymistapoja kuivatuksen myöhäisessä vaiheessa syöpään. Koska kohonnut SPARC ilmentyminen liittyy vähentynyt mahalaukun syövän elossaololuku [16], uskomme, että tuloksia, mikä osoittaa vähentynyt invaasion ja lisääntynyt solujen kuoleman vastaan ​​suunnattu siRNA SPARC, viittaavat siihen, että laskeva SPARC ilmentyminen voi olla terapeuttista hyötyä mahasyövän potilaille.
julistukset
Kiitokset
työtä tuki National Scientific Technologic tukeminen Project Fund [30901417]. Kiitämme professori Yang Ke ja Xiaojuan Du Pekingin yliopiston Health Science Centre, Peking, Kiina, teknistä tukea.
Kirjoittajien alkuperäinen toimitti asiakirjat kuville
Alla linkkejä kirjoittajien alkuperäiset toimitti asiakirjat kuville. 13046_2010_306_MOESM1_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 1 13046_2010_306_MOESM2_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 2 13046_2010_306_MOESM3_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 3 13046_2010_306_MOESM4_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 4 13046_2010_306_MOESM5_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäisen tiedoston luku 5 kilpailevat edut
kirjoittajat ilmoittavat, että heillä ei ole kilpailevia intressejä.

• Metallotioneiinin 2A estää NF-KB-reitin aktivaatio ja ennustaa kliinistä tulosta erillisiä kanssa TNM mahasyövän potilaista radikaali resektio
• Syvä sekvensointi mahakarsinooman paljastaa somaattiset mutaatiot liittyvät henkilökohtaista medicine