L'abbassamento di espressione SPARC riduce cancro gastrico invasione cellulare e la sopravvivenza

L'abbassamento di espressione SPARC riduce cancro gastrico invasione cellulare e la sopravvivenza
Abstract
sfondo
proteina secreta acido e ricco di cisteina (SPARC) svolge un ruolo chiave nello sviluppo di molti tessuti e tipi di organi. espressione SPARC Aberrant è stato trovato in una vasta gamma di tumori umani, contribuisce allo sviluppo del tumore. Perché SPARC è risultato essere sovraespresso nel tessuto cancro gastrico umano, abbiamo quindi di esplorare l'espressione di SPARC in linee di cancro gastrico e dei meccanismi cancerogeni.
Metodi
espressione SPARC è stata valutata in un pannello di linee di cellule di cancro gastrico umano . linee cellulari di cancro gastrico MGC803 e HGC 27 esprimono alto livello di SPARC sono state trasfettate con piccoli RNA interferenti specifici per SPARC e successivamente valutati per gli effetti sulla invasione e la proliferazione
. Risultati
small interfering RNA atterramento-mediata di SPARC in MGC803 e HGC 27 cellule di cancro gastrico è diminuita drasticamente la loro invasione. Knockdown di SPARC è stato osservato anche per aumentare in modo significativo la apoptosi delle 27 cellule di cancro gastrico MGC803 e HGC rispetto al gruppo di controllo trasfettate.
Conclusioni
I nostri dati hanno mostrato che downregulating di SPARC inibisce l'invasione e la crescita delle cellule di cancro gastrico umano. Così, il targeting di SPARC potrebbe essere un approccio terapeutico efficace contro il cancro gastrico.
Introduzione
cancro gastrico è la seconda causa di decessi correlati al cancro in tutto il mondo ed è uno dei tumori più aggressivi ed è frequentemente associata con linfonodo metastasi, diffusione peritoneale, e le metastasi ematogena [1]. Nel complesso, il 65-70% dei nuovi casi e decessi per cancro gastrico si verificano in paesi meno sviluppati [2]. Nel 2005, i tassi di incidenza di cancro gastrico (0,3 milioni di morti e 0,4 milioni di nuovi casi) al terzo posto tra i tumori più comuni in Cina [3]. Le attuali terapie per la fase avanzata o carcinoma gastrico metastatico hanno scarso effetto, la rimozione chirurgica con resezione dei linfonodi adiacenti offre l'unica possibilità di cura, che è inferiore al 33% dei pazienti con cancro gastrico. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni è solo del 30-40%, con una prognosi peggiore per i tumori avanzati. La comprensione dei meccanismi molecolari alla base della progressione del cancro gastrico può fornire approfondimenti di nuovi bersagli terapeutici
proteina secreta acido e ricco di cisteina (SPARC, noto anche come osteonectin o BM-40). Appartiene alla famiglia matricellular di proteine ​​secrete [4 ]. SPARC è un componente non strutturale di matrici extracellulari che modula le interazioni cellula-matrice, in particolare durante lo sviluppo dei tessuti, rimodellamento e riparazione [5]. Molti tipi di tumori sono caratterizzati da espressione upregulated di [6] SPARC. Sovraespressione di SPARC è stata documentata in diversi tipi di tumori solidi, come il seno [7], della prostata [8], il melanoma [9] e glioblastomi [10]. Al contrario, i livelli più bassi di espressione SPARC sono stati trovati in altri tipi di tumori, come ad esempio ovaie [11], del colon-retto [12], del pancreas [13, 14] e la leucemia mieloide acuta [15]. Queste osservazioni suggeriscono che effetto oncogeno di SPARC è tipo di cellula specifica e può essere dipendente della cellula tumorale ambiente circostante.
La conoscenza sulle funzioni SPARC in cellule di cancro gastrico è ancora scarsa. Sovraespressione del gene SPARC è stata osservata nel cancro gastrico umano in altre cinque rapporti [16-20]. Tuttavia, tutti gli studi sopra citati hanno avuto nessun dettaglio in linee cellulari di cancro gastrico e il meccanismo cancerogeno. SPARC è stata associata a fasi aggressive di cancro gastrico ed è correlato con prognosi infausta [16], il che suggerisce che la riduzione dell'espressione SPARC può avere benefici terapeutici. In effetti, l'espressione di oligonucleotidi antisenso contro SPARC in cellule di melanoma bloccato la formazione di tumori [21]. I precisi meccanismi biologici e molecolari attraverso i quali una riduzione dell'espressione SPARC potrebbe contribuire a migliorare la terapia dei tumori rimangono da indagare. Pertanto, lo scopo del presente studio è stato quello di caratterizzare le funzioni SPARC in cellule di cancro gastrico ed esplorare il suo meccanismo possibilmente cancerogeni.
Materiali e metodi
cellulare di coltura
linee di cellule di cancro gastrico umani NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 sono stati ottenuti dal Cancer Institute della Accademia Cinese delle Scienze mediche. Tutte le cellule sono state coltivate in RMPI 1640 (GIBCO ™) medium supplementato con 10% di siero fetale bovino, penicillina G (100 unità /ml), e streptomicina (100 ug /ml) chiamato mezzo completo. Le cellule sono state mantenute in coltura monostrato a 37 ° C in aria umidificata con 5% di CO 2.
Chimica e reagenti
EDTA-2 sodico, arancio di acridina, bromuro di etidio (EB) e 3- [4, 5-dimethylthiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazoliumbromide (MTT) sono stati acquistati da Sigma (St Louis, MO, USA). Mouse anticorpo monoclonale specifico per beta-actina era da Sigma. anticorpi policlonali di coniglio specifici per Bcl-2 (SC-492), caspasi-3 (SC-7148) e PARP (SC-7150) sono stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Mouse anticorpi monoclonali specifici per SPARC (sc-74.295) e Bax (SC-7480) sono stati ottenuti da Santa Cruz Biotechnology. Capra anti-coniglio (w3960) e anti-topo (w3950) anticorpi secondari sono stati acquistati da Promega (Madison, WI, USA)
. RNAi e trasfezione
umana SPARC siRNA e siRNA di controllo erano da Dharmacon Bioscience Corp (Chicago , IL, USA). quantità equimolari di siRNA sono stati utilizzati secondo le istruzioni del produttore con il controllo non-targeting siRNA (CTRL). 150 000 cellule sono state placcate per sei pozzetti in DMEM con 10% FBS e sono stati autorizzati a montare durante la notte. quantità equimolari di siRNA sono stati incubati con transito-TKO Transfection Reagent da Mirus (Madison, WI, USA) secondo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state mantenute per 48 h prima degli esperimenti, se non diversamente indicato
analisi Western blot
Venti microgrammi di proteine ​​totali sono state separate mediante SDS-PAGE e trasferite su una membrana PVDF. La membrana è stata poi incubata con anticorpi specifici per SPARC (Santa Cruz; 1: 500), o anti-β-actina (Sigma; 1: 1.000) notte a 4 ° C. Gli anticorpi legati sono stati visualizzati mediante chemiluminescenza. Per confermare parità di carico, membrane sono state spogliate per 30 minuti a 50 ° C in tampone contenente 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,7), e 100 mM 2-mercaptoetanolo e reprobed con un anticorpo anti-β-actina per dimostrare parità loading . La densità delle bande è stata quantificata mediante analisi densitometrica utilizzando il sistema ImageTool (versione 3.0).
RT-PCR L'RNA totale
(1-2 mg) è stato trascritto inverso utilizzando un kit pre-amplificazione SuperScript (Invitrogen, Carlsbad , CA). I primer sono stati basati su sequenze riportate su Genebank (NM 003.118). SPARC sequenza senso era 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'e SPARC sequenza anti-senso 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3'. Il formato del prodotto atteso di SPARC cDNA era 512bp. ß-actina sequenza senso era 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'e ß-actina sequenza anti-senso 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. Il formato del prodotto atteso di cDNA ß-actina era 514bp. l'amplificazione PCR è stata effettuata in 25 volumi di reazione microlitri contenente 0,2 mM dNTP, 20 pmol di ciascun primer oligonucleotidi, e 0.2U Tag polimerasi in tampone PCR. cDNA è stato amplificato in un controller termico PCR con una denaturazione iniziale a 95 ° C per 5 minuti, seguiti da cicli di 95 ° C per 1 min, 65 ° C per 1 minuto, e 72 ° C per 1 minuto, 27 cicli, e una fase di estensione finale di 72 ° C per 10 min. La quantità di partenza cDNA è stata regolata utilizzando intensità β-actina. Saggio di migrazione cellulare

la capacità delle cellule di migrare attraverso filtri è stata misurata utilizzando una camera di invasione BIOCOAT Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Coltura cellulare inserisce con una dimensione dei pori di membrana PET 8 micron sono stati utilizzati secondo il protocollo del produttore. La camera inferiore inclusa medio (0,75 ml) contenente 10% FCS, considerando SPARC siRNA transfettate o cellule di controllo trasfettate (1,0 × 10 5 sospese in 0,5 ml di terreno contenente 1% FCS) sono state seminate nella camera superiore e incubate overnight a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2. cellule remaning sulla superficie superiore sono stati rimossi meccanicamente. Le membrane sono state poi lavate, fissate e colorate con Diff-Quik (Medion Diagnostics). Il numero di cellule che migrati alla superficie inferiore dei filtri è stato determinato contando le cellule colorate con un microscopio ottico in tre settori indipendenti (0,25 mm 2 /pozzetto).
La crescita cellulare e la vitalità dosaggio
L' effetto di SPARC SiRNA sulla vitalità delle cellule è stata determinata mediante il saggio MTT. In breve, MGC803 e HGC 27 cellule sono state placcate a 1 × 10 4 cellule per pozzetto in piastre da microtitolazione novantasei pozzetti. Dopo incubazione per 72 h, la vitalità cellulare è stata determinata. Poi 20 microlitri MTT (10 mg /ml in PBS magazzino, diluito alla concentrazione di 1 mg /ml con mezzi di lavorazione) è stato aggiunto a ciascun pozzetto e incubate per 4 ore. Dopo un'attenta rimozione del mezzo, 200 microlitri dimetilsolfossido è stato aggiunto a ciascun pozzetto e agitata accuratamente. L'assorbanza è stata registrata sul lettore di micropiastre (ELX 800; Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, USA) ad una lunghezza d'onda di 570 nm. L'effetto di SPARC siRNA sulla inibizione della crescita cellulare è stata valutata come percentuale vitalità cellulare in cui le cellule del veicolo trattati sono stati presi come 100% praticabile. Analisi
del ciclo cellulare e annessina V colorazione
Per l'analisi del ciclo cellulare citometria a flusso, le cellule trattate con siRNA sono stati raccolti, lavati con PBS, fissate a freddo 70% di etanolo e conservato a -20 ° C fino colorazione. Dopo la fissazione, le cellule sono state lavate con PBS e incubate con 50 ug /mL RNaseA (Sigma) per 30 minuti a 37 ° C, prima della colorazione con 50 ug /mL ioduro di propidio (Sigma). apoptosi delle cellule in fase precoce e tardiva sono stati rilevati utilizzando un V-FITC apoptosi Detection Kit annessina da BioVision (Mountain View, CA, USA). In breve, le cellule sono state trasfettate con siRNA. A 96 h post-trasfezione, i media e le cellule di coltura sono stati raccolti e centrifugati. Dopo il lavaggio, le cellule sono state risospese in 490 microlitri di annessina V binding buffer, seguita dall'aggiunta di 5 microlitri annessina V-FITC e 5 microlitri ioduro di propidio. I campioni sono stati incubati al buio per 5 minuti a temperatura ambiente e analizzati utilizzando la citometria a flusso. &Statistiche
I risultati sono stati espressi come media livelli di espressione (± SD). t di Student
-test o somma rank test sono stati utilizzati per l'analisi statistica. Un valore di p < 0.05 è stato preso come livello di significatività (fronte-retro).
Risultati
espressione di SPARC in cellule di cancro gastrico in coltura
In primo luogo abbiamo valutato l'espressione endogena di SPARC in diverse linee di cellule di cancro gastrico umano. Abbiamo scoperto che SPARC proteine ​​e mRNA erano prevalenti nelle cellule MGC803 e HGC27, sono stati prodotti a livelli più bassi di linea cellulare SGC7901 erano undectable in linee cellulari BGC823 (Figura 1) NCI-N87 e. Figura 1 L'espressione di SPARC in linee cellulari di cancro gastrico. A, analisi immunoblot utilizzando un coniglio policlonale SPARC anticorpi (1: 500). B, specifica reazione a catena della polimerasi transcriptasi inversa (RT-PCR) per SPARC. ß-actina stato utilizzato come controllo di caricamento. C, relativi livelli di espressione di mRNA SPARC. Autoradiografie sono stati scansionati e analizzati con densitometria seguita da quantificazione rispetto al beta-actina. I risultati sono mostrati come espressione (in%) rispetto al beta-actina e sono mezzi (± SD) di 3 esperimenti
. L'inibizione di espressione SPARC endogena
A seguito di questo primo screening, MGC803 cellule e HGC27 cellule che esprimono relativamente alto endogena SPARC sono stati istituiti atterramento esprimendo SPARC in maniera transitoria per determinare l'importanza di espressione SPARC endogena. Come mostrato nella Figura 2A, espressione SPARC è stata inibita con transfettanti SPARC siRNA a livelli di proteine. Questi risultati suggeriscono che questi SPARC siRNA esercitare con successo un effetto di silenziamento per l'espressione SPARC. Figura 2 Effetto della SPARC atterramento sulla migrazione delle cellule nelle linee di cellule di cancro gastrico MGC 803 e HGC 27 celle. espressione A. SPARC in MGC 803 e HGC 27, il controllo e le cellule transfettate SPARC siRNA è stata rilevata mediante analisi immunoblot utilizzando un coniglio policlonale SPARC anticorpi (1: 500). ß-actina stato utilizzato come controllo di caricamento. B. Effetti di SPARC atterramento sulla migrazione delle cellule nelle linee di cellule di cancro gastrico. espressione SPARC è stato abbattuto in MGC 803 e HGC 27 celle utilizzando SPARC siRNA e sottoposto ad un test di migrazione utilizzando un apparato di invasione a due camere, come descritto in Materiali e Metodi, istogramma che mostra l'inibizione per cento di MGC 803 e HGC 27 l'invasione delle cellule. L'esperimento è stato fatto in triplice copia e il valore ottenuto da cellule transfettate siRNA strapazzate è stato fissato al 100%
. L'abbassamento di espressione SPARC inibito gastrico cellule tumorali in vitro invasione
Per determinare se SPARC siRNA potrebbe ridurre i comportamenti cellulari protumorigenic associati espressione SPARC, abbiamo determinato in primo luogo l'effetto di espressione SPARC diminuito su invasione delle cellule tumorali. saggio cellulare invasione fosse quindi eseguita utilizzando Transwell camere. Abbiamo misurato la capacità delle cellule di cancro gastrico di invadere attraverso Matrigel, una matrice extracellulare artificiale, dopo trasfezione con siRNA controllo non targeting o SPARC siRNA. Diminuita espressione SPARC portato alla inibizione della invasione da 69% e il 79% in MGC803 e HGC27, rispettivamente (Figura 2B, C). Presi insieme, questi risultati indicano chiaramente che la soppressione di SPARC inibisce la capacità di migrazione e l'invasione delle cellule e MGC803 HGC27 cellule.
L'abbassamento di espressione SPARC inibisce la crescita di cellule di cancro gastrico in vitro
Abbiamo studiato se SPARC siRNA potrebbe diminuire la sopravvivenza delle cellule di cancro gastrico. MGC 803 e HGC 27 cellule di cancro gastrico trasfettate con siRNA SPARC sono sopravvissuti a tassi relativi alle cellule abbinate trasfettate con un controllo non-targeting siRNA (figura 3A) è diminuito. L'abbassamento di espressione SPARC non ha indotto l'arresto del ciclo cellulare in cellule di cancro gastrico. Abbiamo esaminato gli effetti di SPARC siRNA sulla progressione del ciclo cellulare. Silenziamento di SPARC in MGC803 e HGC27 cellule non ha cambiato G1 o fase S popolazioni a 72 h posttransfection con SPARC siRNA in confronto al gruppo di controllo negativo (Figura 3B). Figura 3 Effetti della SPARC atterramento sulla crescita delle cellule nelle linee di cellule di cancro gastrico. i dati di metà sinistra rappresentano i dati ottenuti da MGC 803 cellule e quelle giuste rappresentano i dati ottenuti da HGC 27 celle. crescita A. basale è stata determinata dopo 48 ore in terreno completo dal saggio MTT. I risultati sono riportati come media di crescita (in%) della rispettiva linea cellulare MGC 803 e HGC 27 e sono mezzi (± SE) di determinazioni quadruplicato da sei esperimenti separati. Le cellule dei gruppi siRNA e di controllo sono stati raccolti per l'analisi del ciclo cellulare citometria. B. silenziamento di SPARC da siRNA transfection non ha cambiato la distribuzione del ciclo cellulare in MGC 803 e HGC 27 cellule di cancro gastrico. MGC 803 e HGC 27 cellule sono state trasfettate con siRNA SPARC o controllo negativo siRNA. A 72 ore dopo la trasfezione, contenuto di DNA è stata misurata utilizzando ioduro di propidio (PI) colorazione sulla citometria a flusso
. L'inibizione di espressione SPARC migliora l'apoptosi nelle cellule di cancro gastrico
abbiamo studiato se SPARC siRNA potrebbe indurre la morte delle cellule nel cancro gastrico linee cellulari. Il trattamento delle cellule MGC803 e HGC27 con SPARC siRNA aumentato cellule apoptotiche precoce e cellule apoptotiche fine, rispetto al controllo negativo trattamento siRNA (Figura 4A), misurato con il test annessina V. Come previsto, la diminuzione della sopravvivenza delle cellule trasfettate con siRNA SPARC è stato associato ad un aumento dei tassi di apoptosi del 91% in MGC803 e il 92% in HGC27 cellule (Figura 4B). Questi risultati suggeriscono che SPARC è coinvolto in apoptosi per mantenere la sopravvivenza cellulare in alcune cellule di cancro gastrico. Figura 4 SPARC risultati atterramento nel induzione di apoptosi nelle linee cellulari di cancro gastrico. Per l'analisi di citometria di flusso, le cellule sono state raccolte 96 ore dopo la trasfezione con siRNA SPARC o controllo negativo siRNA, poi colorati con annessina V-FITC e ioduro di propidio (PI). i dati di metà sinistra rappresentano i dati ottenuti da MGC 803 cellule e quelle giuste rappresentano i dati ottenuti da HGC 27 celle. Le percentuali di annessina V /PI (inizio apoptosi) e annessina V /PI (fine apoptosi) delle cellule è mostrato in ogni pannello. I valori in grassetto indicano diminuzione espressione SPARC sono aumentati apoptosi del 65% in MGC803 e il 92% in HGC27 rispetto al controllo negativo siRNA.
Effetto apoptotica di SPARC siRNA trattamento trasfettati in MGC 803 e cellule HGC27
Nel tentativo di chiarire la meccanismo di SPARC siRNA apoptosi indotta in MGC 803 cellule e HGC27 cellule, livelli di espressione di proteine ​​apoptosi-regolazione, come Bcl-2, Bax e caspasi-3 e PARP sono stati valutati. MGC 803 cellule e cellule HGC27 sono state trasfettate con siRNA SPARC. Come mostrato in figura 5, vi sono state differenze significative nelle espressioni di Bax e Bcl-2 in MGC 803 cellule e cellule HGC27 in confronto con il gruppo di controllo negativo (P < 0,05 e P < 0.01). In risposta a stimoli apoptotici, procaspase-3 viene scisso in un kDa frammento di 20, e la successiva reazione autocatalitica porta alla formazione del attiva 17 kDa frammento. Quando la caspasi-3 è attivata, PARP viene aperto. Così clivaggio di PARP è utilizzato come indicatore di apoptosi. Al fine di ottenere la prova diretta che mostra la relazione di attivazione delle caspasi e apoptosi, procaspasi-3 scissione e PARP sono stati esaminati in MGC 803 cellule e cellule HGC27 dopo SPARC siRNA transfettate. Come mostrato in figura 5, SPARC SiRNA indotto la scissione di 32 kDa procaspase-3 nella sua attiva 17 kDa forma e clivaggio di PARP apparso in MGC 803 cellule e HGC27 cellule. Figura 5 l'espressione di proteine ​​apoptosi nelle MGC 803 e cellule HGC27 dopo trasfezione con il controllo o il siRNA SPARC. I lisati cellulari sono stati separati su gel 10% SDS-PAGE, trasferiti su una membrana di nitrocellulosa e sondato con anticorpi anti-PARP, anti-caspasi-3, anti-Bcl-2, e anti-Bax. il contenuto di proteine ​​sono stati normalizzati sondando la stessa membrana con l'anti-β-actina. . I dati metà sinistra rappresentano i dati ottenuti da MGC 803 cellule e quelle giuste rappresentano i dati ottenuti da HGC 27 celle
Discussione
proteina secreta e ricca di cisteina, SPARC (noto anche come osteonectin, o membrana basale-40 , BM-40), è un membro di una famiglia di proteine ​​matricellular, la cui funzione è di modulare le interazioni cellula-matrice e la funzione delle cellule senza partecipare alla impalcatura strutturale della matrice extracellulare. Sovraespressione di SPARC è stata documentata in diversi tipi di tumori solidi, come il seno [7], della prostata [8], il melanoma [9] e glioblastomi [10]. Al contrario, i livelli più bassi di espressione SPARC sono stati trovati in altri tipi di tumori, come ad esempio ovaie [11], del colon-retto [12], del pancreas [13, 14] e la leucemia mieloide acuta [15]. Queste osservazioni suggeriscono che effetto oncogeno di SPARC è tipo di cellula specifica e può essere dipendente della cellula tumorale ambiente circostante.
La conoscenza sulle funzioni SPARC in cellule di cancro gastrico è ancora scarsa. Alcuni studi di immunoistochimica [16-20, 22] hanno riportato collettivamente un up-regulation di SPARC nel carcinoma gastrico rispetto alla mucosa non neoplastica. Wewer et al. [17] ha descritto l'espressione differenziale delle SPARC nelle epiteliali e stromali compartimenti di sei campioni di cancro gastrico. Maeng [18] ha rilevato che SPARC è altamente espresso in stroma reattiva associati con adenocarcinomi differenziati invasive e che può servire come un utile marker diagnostico clinico per il cancro allo stomaco. Wang et al. [16] ha trovato anche un differenziale espresso SPARC in pazienti affetti da cancro gastrico valutata mediante analisi gene array, RT-PCR quantitativa, e immunostaining, l'espressione più alta SPARC era significativamente associato con la progressione del tumore e gli stadi avanzati del cancro gastrico. Franke et al. [20] ha dimostrato in una serie più ampia paziente SPARC è differenzialmente espressi nei tumori gastrici e che la sua espressione correla con la progressione del tumore e la diffusione linfonodale usando microarrays tissutali (TMA), il livello di espressione di SPARC, determinato da immunoistochimica, correlata in intestinale di tipo cancro gastrico con la crescita locale del tumore, la diffusione linfonodale, e lo stadio del tumore in base alla Unione Internazionale contro il cancro. Zhao ZS et al. [19] ha trovato che SPARC è stato rilevato in 334 su 436 casi di cancro gastrico umano ed è stato altamente espresso in 239 tumori. Nelle fasi I, II, e III, il tasso di sopravvivenza a 5 anni dei pazienti con elevata espressione di SPARC era significativamente più bassa rispetto a quelle nei pazienti con bassa espressione. Ulteriori analisi multivariata ha suggerito che upregulation di SPARC, MMP-2, e integrina beta1, erano indicatori prognostici indipendenti per la malattia.
Abbiamo raccolto 49 tessuti di cancro gastrico e corrispondenti tessuti normali attraverso procedure chirurgiche (Jie Yin, Guowei Chen, Si Liu, Jianxun Zhao, Yucun Liu: Espressione di SPARC nel cancro gastrico umano è associata con le caratteristiche clinico-patologiche, presentato). La distribuzione e l'espressione di SPARC sono stati osservati mediante immunoistochimica, Western Blotting e RT-PCR, rispettivamente. SPARC proteine ​​e mRNA espressi significativamente più alta nei tessuti di cancro gastrico rispetto ai tessuti normali. I gradi della sua espressione sono stati associati con la differenziazione di tumore, divisione TNM, semina peritoneale e l'invasione vascolare notevolmente. I pazienti con elevata espressione di SPARC hanno prognosi peggiore rispetto a quelli con bassa espressione di SPARC.
Nel loro insieme, l'espressione più alta SPARC era significativamente associato con la progressione del tumore e stadi avanzati del cancro gastrico. Una recente ricerca di Inoue M et al [23], anche identifed SPARC come un antigene bersaglio candidato per l'immunoterapia dei vari tipi di cancro, tra cui cancro gastrico da genome-wide cDNA microarray. E 'eccitante che la terapia mira la subunità SPARC può essere un approccio utile per sopprimere la crescita del cancro gastrico. Tuttavia, i meccanismi molecolari responsabili della oncogenesi di SPARC nel cancro gastrico non è del tutto compreso. Attraverso l'analisi di espressione di un pannello di linee di cellule di cancro gastrico, abbiamo dimostrato che SPARC è anche sovraespresso in linee cellulari di cancro gastrico umano Sevel. Pertanto, abbiamo testato le nostre ipotesi che SPARC potrebbe essere una molecola chiave nella gastrica invasione del cancro, e che il targeting SPARC può presentare una nuova strategia terapeutica per l'anti-invasione del cancro gastrico.
Diffusione delle cellule tumorali, sia a livello locale o metastatica a distanza siti, richiede che le cellule maligne acquisiscono la capacità di invadere la membrana basale e di aderire ad altre matrici. E 'stato suggerito che SPARC può svolgere un ruolo chiave durante le fasi iniziali del processo di invasione tumorale e metastasi [24]. Inoltre, SPARC può indurre l'espressione di metalloproteinasi o enzimi che successivamente svolgono un ruolo importante nella degradazione delle membrane basali e componenti della matrice extracellulare [25]. SPARC è stata associata con l'invasività dei meningiomi [26, 27] e [28] gliomi. Inoltre, la soppressione di espressione SPARC utilizzando RNA antisenso motilità inibita e l'invasione delle cellule tumorali al seno umano in vitro [21].
Per determinare se SPARC siRNA potrebbe ridurre i comportamenti cellulari protumorigenic associati con l'espressione SPARC, in primo luogo abbiamo determinato l'effetto della diminuzione SPARC espressione sul invasione delle cellule tumorali. Abbiamo misurato la capacità delle cellule di cancro gastrico di invadere attraverso Matrigel, una matrice extracellulare artificiale, dopo trasfezione con siRNA SPARC o un controllo non-targeting siRNA. Diminuita espressione SPARC ha portato alla inibizione della invasione da 69% e il 79% in MGC803 e HGC27, rispettivamente. Così, SPARC siRNA può diminuire gastrica invasione del cancro in vitro.
Un recente studio ha rilevato che SPARC protegge le cellule da apoptosi indotta da stress in vitro attraverso una interazione con integrina eterodimeri b1 che migliorano attivazione ILK e l'attività prosurvival [28]. Gli studi iniziali che utilizzano strategie di RNA antisenso completamente abrogata la crescita del melanoma umano in topi nudi [21]. Horie et al. [29] hanno dimostrato che la down-regulation dell'espressione SPARC indotto inibizione della crescita con G 1 arresto in cellule di melanoma umano. E 'stato riportato che SPARC promuove la sopravvivenza delle cellule di glioma attraverso l'attivazione di Akt attraverso la segnalazione integrina in condizioni di assenza di siero [30]. Questi rapporti suggeriscono fortemente che SPARC svolge un ruolo come fattore antistress.
D'altra parte, alcuni articoli hanno scoperto che SPARC può promuovere l'apoptosi nelle cellule tumorali. Yiu e colleghi [11] hanno mostrato che il trattamento esogena di varie linee di cellule di cancro ovarico con l'apoptosi indotta SPARC. Said e Motamed [31] hanno trovato l'esposizione SPARC aumentato spaccati caspasi 3 nelle cellule di carcinoma ovarico umano che hanno sostenuto l'ex osservazione. Pancreatica [13] e tumori ovarici [30] hanno mostrato una maggiore crescita e ridotto l'apoptosi quando sono impiantati nel SPARC - /-. In linee cellulari di cancro del colon-retto, l'iperespressione di SPARC ridotta vitalità cellulare e una maggiore apoptosi in cellule esposte a diversi agenti chemioterapici [32].
Queste osservazioni apparentemente paradossali all'interno di ogni tipo di cancro e tra i diversi tipi di cancro può essere spiegato con la comprensione del Tai di SPARC biologia [33]: piccoli frammenti peptidici di SPARC che rappresentano i diversi domini di SPARC conferiscono attività biologiche che a volte, si oppongono a quelli di altri frammenti o la proteina SPARC nativa. Dal momento che il profilo della proteasi del microambiente tumorale possono differire in diversi tipi di tumori, e, come è noto SPARC di sottoporsi proteolisi da metalloproteinasi della matrice [34], queste differenze, in combinazione con cambiamenti nella composizione locale di molecole della matrice e citochine, possono tutti essere contribuendo al comportamento complesso di SPARC in diversi tipi di cancro.
per chiarire gli effetti di SPARC siRNA sulla crescita delle cellule del cancro gastrico, saggio MTT proliferazione è stata eseguita per confrontare il proliferare tra SPARC siRNA transfettate e controllo trasfettate MGC803 e HGC 27 cellule. cellule di cancro gastrico MGC803 e HGC27 trasfettate con siRNA SPARC sono sopravvissuti a tassi relativi alle cellule abbinate trasfettate con un controllo non-targeting siRNA (Figura 3) è diminuito. La diminuzione della sopravvivenza delle cellule trasfettate con siRNA SPARC è stato associato ad un aumento dei tassi di apoptosi, come misurate con il test annessina V. Diminuendo espressione SPARC aumentata apoptosi del 91% in MGC803 e 92% in HGC27 (Figura 4B).
Caspasi attive svolgono un ruolo importante nella induzione di apoptosi. Quando caspasi-3 è stato attivato, PARP viene scissa in ritardo. Di solito il clivaggio di PARP è stato utilizzato come indicatore di apoptosi. Nel presente studio, abbiamo riscontrato SPARC siRNA attiva caspasi-3 per la produzione di frammenti clivati ​​caspasi-3 (P17) in MGC 803 cellule e HGC 27 alle 48 ore. Allo stesso tempo, è stato anche rilevato il clivaggio di PARP. I risultati indicano che SPARC frammentazione di PARP, nonché una maggiore attività della caspasi-3 in MGC 803 cellule indotta.
La famiglia Bcl-2 proteine ​​sono stati segnalati per regolare l'apoptosi attraverso il controllo della permeabilità della membrana mitocondriale. SPARC fino regolata l'espressione di Bax e giù regolata l'espressione di Bcl-2 in MGC 803 cellule e HGC 27 cellule. Abbiamo scoperto che SPARC siRNA potrebbe indurre gastrica apoptosi delle cellule tumorali e ridurre allo stesso tempo il rapporto di Bcl-2 a Bax. Pertanto, la regolazione dell'espressione Bcl-2 e Bax può essere un meccanismo chiave alla base di induzione SPARC di apoptosi nelle cellule di cancro gastrico.
Così i nostri dati indicano che sottoregolazione di SPARC ha inibito la proliferazione cellulare delle cellule di cancro gastrico per l'iniziazione apoptosi, che la coscienza con melanoma e glioma, ma contrariamente a cancro ovarico e del pancreas. L'induzione di apoptosi è stata in parte regolamentato per via mitocondriale come via caspasi attivazione così come scissione di PARP. studio futuro ha bisogno di concentrarsi sul meccanismo esatto.
In conclusione, i nostri dati attuali suggerisce che SPARC ha giocato un ruolo importante nella apoptosi e le metastasi del cancro gastrico. Allo stato attuale, non esistono approcci efficaci per curare il cancro gastrico fase avanzata. Come espressione SPARC elevata è associata ad una diminuzione cancro gastrico sopravvivenza del paziente [16], riteniamo che i nostri risultati, dimostrando diminuito invasione e aumento della morte cellulare con siRNA diretto contro SPARC, suggeriscono che diminuendo l'espressione SPARC può avere benefici terapeutici per i pazienti affetti da cancro gastrico.
Dichiarazione
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da scientifico Tecnologico di supporto Fondo nazionale Progetto [30.901.417]. Ringraziamo il professor Yang Ke e Xiaojuan Du dell'Università di Pechino Health Science Center, Pechino, Cina, per il supporto tecnico.
Degli autori originali dei file inviati per le immagini
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Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

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