Roll γ-glutamyltranspeptidase i patogenesen av Helicobacter suis och Helicobacter pylori-infektion

Roll γ-glutamyltranspeptidase i patogenesen av Helicobacter suis
och Helicobacter pylori
infektioner Bild Sammanfattning
Helicobacter
(H.
) suis
kan kolonisera magen på grisar som liksom människor, orsakar kronisk gastrit och andra mag patologiska förändringar inklusive magsår och slemhinnor associerad lymfoid vävnad (MALT) lymfom. Nyligen har en virulensfaktor av H. suis
, γ-glutamyltranspeptidas (GGT), har visat sig spela en viktig roll vid induktion av human gastrisk epitelial celldöd och modulering av lymfocytproliferation beroende på glutamin och glutation katabolism. I den aktuella studien har relevans GGT i patogenesen av H. suis
infektion studeras i mus och mongolisk ökenråtta modeller. Dessutom var den relativa betydelsen av H. suis
GGT jämfört med den för H.pylori
GGT. En betydande och annorlunda bidraget från GGT av H. suis
och H. pylori
sågs i termer av bakteriell kolonisering, inflammation och den framkallade immunsvaret. Till skillnad från H. pylori
Δggt
stammar, H. suis
Δggt
stammar kan kolonisera magen på nivåer jämförbara med WT-stammar, även om de inducerade betydligt mindre total gastric inflammation hos möss. Detta kännetecknades av lägre antal T- och B-celler, och en lägre nivå av epitelial cellproliferation. I allmänhet, jämfört med WT stam infektion, GGT
mutantstammar av H. suis
utlöste lägre nivåer av Th1 och Th17 signatur cytokinexpression. En uttalad uppreglering av B-lymfocyter chemoattractant CXCL13 observerades både i djur infekterade med WT och GGT
mutantstammar av H. suis
. Intressant nog var H. suis
GGT visats påverka glutamin metabolismen av gastriskt epitelium genom nedreglering av glutamin transportör ASCT2.
Introduktion
Helicobacter
(H.
) pylori
är en gramnegativ bakterie som koloniserar magen hos mer än hälften av världens befolkning. Infektion med denna bakterie kan orsaka gastrit, magsår, gastriskt adenokarcinom och slemhinnor associerad lymfoid vävnad (MALT) lymfom [1-3]. Förutom H. pylori
, icke-H. pylori
helicobacters (NHPh) har också påvisats i magsäcken hos människor och dessa bakterier orsakar liknande gastric sjukdomar. Risken att utveckla gastric MALT lymfom är högre under NHPh infektion jämfört med infektion med H. pylori
[4-9]. H. suis
är den vanligaste gastric NHPh hos människor. Grisar är den naturliga värd för denna bakterie, med förekomsten gående 90% eller mer [10] och troligen, grisar och eventuellt också fläsk är de viktigaste källorna till mänsklig H. suis
infektion [4,11-13].
H. suis
infektion verkar bestå för livet, åtminstone i grisar och gnagare som används som modeller för mänskliga infektioner [14]. Hos svin, orsakar infektion utveckling av gastrit och en minskning i viktökning. Dessutom verkar bakterien att spela en roll i utvecklingen av sår i icke-körtel pars oesophagea [15]. Hos möss och mongolisk ökenråtta modeller av gastric sjukdom människa, orsakar experimentell H. suis
infektion svår gastric patologi [4,16,17], inklusive gastrit, parietalcellens nekros och utvecklingen av gastric MALT lymfom liknande lesioner liknar skador som har observerats H. suis
infekterade människor.
Tidigare studier har visat att denna bakterie saknar en homolog för flera virulensfaktorer av H. pylori
, såsom cellgift associerade gener
patogenicitet ö ( CAG
PAI) och vakuoliserande cellgift (VacA) [18]. Vi var dock kan identifiera γ-glutamyltranspeptidas (GGT) som en viktig virulensfaktor av H. suis
. Detta enzym har beskrivits orsaka gastrisk epitelcellskada [19] och modulering av lymfocytproliferation [20] genom samverkan av enzymet med två av sina substrat, L-glutamin och reducerat glutation, vilket gör det först identifierades och undersöktes H. suis
virulensdeterminant.
roll GGT under H. pylori
infektion in vivo
har undersökts i möss. Motstridiga slutsatser har dragits om vikten av GGT för kolonisering. Vissa grupper har dragit slutsatsen att H. pylori
GGT krävs för ihållande infektion hos möss [21], medan andra har gjort strider slutsatser [22]. Dessutom finns det ackumulerande bevis för att Helicobacter
GGT är en avgörande virulens faktor involverad i immunundandragande och immuntolerans [23-25].
För närvarande är det inte känt om och hur H. suis
GGT influenser under H. suis
infektion in vivo
. Syftet med denna studie var att utöka våra tidigare in vitro
fynd med H. suis
GGT, och att studera betydelsen av denna virulensfaktor vid patogenesen av H. suis
infektion in vivo
. Samtidigt, vi syftar till att jämföra dess relativa betydelse med den hos GGT av H. pylori
. De aktuella experiment utfördes i BALB /c-möss och utavlade mongoliska gorillor, eftersom dessa djurmodeller har i själva verket visat sig vara värdefulla verktyg för att undersöka rollen av Helicobacter
arter i gastrisk patologi. Typiskt, i mongoliska gerbiler, en snabbare och allvarlig utveckling av magsår kan observeras jämfört med möss [4,26,27].
Material och metoder
djur och bakteriestammar
Sextio 4-vecka- gammal, kvinnlig specifik-patogen-fria (SPF) BALB /c-möss köptes från Harlan NL (Horst, Nederländerna). Tjugofem fyra veckor gamla, kvinnliga SPF avlade mongoliska gerbiler (CRL: MON) erhölls från Charles River Laboratories (Lille, Frankrike) Hus Till H. suis
infektion hos möss och mongoliska gerbiler, stam HS5cLP. var använd. Denna stam har isolerats 2008 från magen på ett slakteri gris [28]. För experimentell H. pylori
infektion i mongoliska ökenråttor, stam PMSS1 [29] användes, eftersom denna stam har ingen historia av in vivo
anpassning hos möss, i motsats till mus-anpassade stammen SS1. I BALB /c-möss, H. pylori
stam SS1 [29] användes, eftersom stammen PMSS1 har tidigare visats att inte kunna kolonisera magen hos BALB /c-möss [29] Konstruktion av isogena.
GGT
mutantstammar av H. suis
och H. pylori
En isogen H. suis GGT
mutant stam (HS5cLPΔggt
) framställdes såsom beskrivits tidigare [20]. Den isogena GGT
mutant stam av H. pylori
erhölls med användning av samma strategi som för skapandet av H. suis
isogena GGT
mutant, förutom att en kanamycinresistens kassett användes i stället för en kloramfenikolresistens kassett [20]. Mycket kortfattat, var borttagningen av GGT
i H. pylori
SS1 och PMSS1 infördes genom alleliskt utbyte med hjälp av pBluescript II SK (+) fagemidvektorn (Agilent Technologies, Kalifornien, USA) där ~ 440 bp av den 5 ' -end och ~ 430 bp av 3 '-end av målgenen och kanamycinresistens kassetten från plasmid pKD4 [30] ligerades genom en PCR-medierad strategi med 2 cykler av omvänd PCR och fiisions-PCR [20]. Alla primrar som användes för PCR-förmedlad konstruktionen av de rekombinanta plasmiderna visas i tabell 1.
Den resulterande plasmiden amplifierades i XL1-Blue MRF 'E. coli
(Agilent Technologies) och användes som en självmords plasmid i H . pylori
SS1 och PMSS1 (en slags gåva från Sara Lindén och Anne Muller, respektive). H. pylori
SS1 GGT
mutant (SS1Δggt
) och H. pylori
PMSS1 GGT
mutant (PMSS1Δggt
) erhölls genom electrotransformation [31] eller naturlig transformation [32 ] såsom beskrivits tidigare. Slutligen, var bakterier selekterades på Columbia agar plattor (Oxoid, Basingstoke, UK) med Vitox tillägg (Oxoid), 5% (v /v) defibrinerat fårblod (E & O Laboratories Ltd, Bonnybridge, UK) och kanamycin (25 mikrogram /ml). Plattorna inkuberades under 5-9 dagar. De isogena GGT
mutanter verifierades genom en GGT aktivitetsanalys [19], PCR och nukleotid sequencing.Table 1 Primers som används för konstruktion av H. pylori GGT isogena mutantstammar
Primer namn
sekvens (5'3 ')
Primer använda
pBlue linjär Fwd en
GGGGATCCACTAGTTCTAGAGCG
Linjärisering av plasmid
pBlue linjär Rev1
CGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAG
Linjärisering av plasmid
HpGGT-flank_fusion1F
CTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGTAACCGGTAAAATCAACACGGACGC
Amplification H. pylori GGT Mössor och partiella upp- och nedströms flankerande gener
HpGGT-flank_fusion1R
CGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCGCGCTCTTATAAAAAGAAGCCGC
Amplification H. pylori GGT Mössor och partiella upp- och nedströms flankerande gener
pBluelinear_Hpggtflank1F
CCAAGGAAAGAATTTTAATCCTATTTAG
Linjärisering av den rekombinanta plasmiden
pBluelinear_Hpggtflank1R
CTGTTTTCCTTTCAATCAACAATAATC
Linjärisering av den rekombinanta plasmiden
Hpkana_fusion_1F
ATTATTGTTGATTGAAAGGAAAACAGATGATTGAACAAGATGGATTGC
Amplification kanamycinresistensgen
Hpkana_fusion_1R
CTAAATAGGATTAAAATTCTTTCCTTGGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG
Amplifiering kanamycinresistensgenen
T7 prom3
TAATACGACTCACTATAGGG
Sekvense
M13R
CAGGAAACAGCTATGAC
Sekvense
Odlingsbetingelser betingelser~~POS=HEADCOMP av bakteriestammar
vildtyp (WT) H. suis
stam HS5cLP odlades under 48 timmar såsom beskrivits tidigare [29]. HS5cLPΔggt
Bakterierna odlades under samma betingelser som stam HS5cLP, med undantag av att de använda odlingsplattor kompletterades med kloramfenikol (30

• Intag av trimetoprim-sulfadimidin förbättrar inte läkningen av körtel magsår hos hästar som fick omeprazol: en randomiserad, blind, klinisk studie
• Svepelektronmikroskopi observationer av hedgehog magen masken, Physaloptera clausa (spirurida: Physalopteridae)