Papel de γ-glutamil en la patogénesis de Helicobacter suis y las infecciones por Helicobacter pylori

Papel de γ-glutamil en la patogénesis de Helicobacter suis y
infecciones por Helicobacter pylori
Resumen
Helicobacter gratis (H.
) suis
puede colonizar el estómago de los cerdos así como los seres humanos, causando gastritis crónica y otros cambios patológicos gástricos incluyendo ulceración gástrica y el tejido linfoide asociado a mucosas (MALT). Recientemente, un factor de virulencia de H. suis
, γ-glutamil transpeptidasa (GGT), se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la inducción de la muerte epitelial gástrica humana celular y la modulación de la proliferación de linfocitos en función de la glutamina y glutatión catabolismo. En el presente estudio, la relevancia de la GGT en la patogénesis de la infección por H. suis
fue estudiado en modelos de ratón y gerbo de Mongolia. Además, la importancia relativa de H. suis
GGT se comparó con la de la H. pylori
GGT. Una contribución importante y diferente de la GGT de H. suis
y H. pylori
fue visto en términos de la colonización bacteriana, la inflamación y la respuesta inmune evocada. En contraste con H. pylori
Δggt
cepas, H. suis
Δggt
cepas fueron capaces de colonizar el estómago a niveles comparables a cepas WT, aunque indujo significativamente menos inflamación gástrica en general en ratones. Este se caracteriza por un menor número de células T y B, y un nivel inferior de proliferación de células epiteliales. En general, en comparación con infección por una cepa WT, GGT
cepas mutantes de H. suis
provocó niveles más bajos de expresión de citoquinas Th1 firma y Th17. Se observó una regulación al alza pronunciada de los linfocitos B CXCL13 quimioatrayente, tanto en los animales infectados con WT y GGT
cepas mutantes de H. suis
. Curiosamente, H. suis
GGT ha demostrado afectar el metabolismo de la glutamina del epitelio gástrico a través de la regulación a la baja ASCT2 glutamina transportador.
Introducción
Helicobacter gratis (H.
) pylori es
una bacteria Gram-negativa que coloniza el estómago de más de la mitad de la población del mundo. La infección con esta bacteria puede causar gastritis, enfermedad de úlcera péptica, adenocarcinoma gástrico y el tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT) [1-3]. Además de H. pylori
, no-H. pylori
Helicobacters (NHPh) también se han detectado en el estómago de humanos y estas bacterias causar enfermedades gástricas similares. El riesgo de desarrollar un linfoma MALT gástrico es más alta durante la infección NHPH en comparación con la infección por H. pylori
[4-9]. H. suis
es la NHPH gástrica más frecuente en los seres humanos. Los cerdos son el huésped natural de esta bacteria, con prevalencias que alcanzan el 90% o más [10] y lo más probable, cerdos y posiblemente también el cerdo son las principales fuentes de humano H. suis
infección [4,11-13].
H. suis
infección parece manifestarse de por vida, por lo menos en los cerdos y roedores utilizados como modelos para las infecciones en humanos [14]. En los cerdos, infección causa desarrollo de gastritis y una disminución en la ganancia de peso corporal. Por otra parte, la bacteria parece jugar un papel en el desarrollo de la ulceración de la pars no glandulares oesophagea [15]. En ratones y jerbos mongoles modelos de enfermedad gástrica humana y experimental H. suis
infección causa la patología gástrica severa [4,16,17], incluyendo la gastritis, la necrosis de las células parietales y el desarrollo de lesiones tipo linfoma MALT gástrico, se asemeja a la lesiones observadas en H. suis
los seres humanos infectados.
estudios anteriores han demostrado que esta bacteria carece de un homólogo de varios factores de virulencia de H. pylori
, tales como los genes de citotoxina asociada
isla de patogenicidad ( cag
PAI) y la citotoxina vacuolating (VacA) [18]. Nos quedamos, sin embargo, capaz de identificar la transpeptidasa γ-glutamil transferasa (GGT) como un importante factor de virulencia de H. suis
. Esta enzima se ha descrito para causar daño gástrico de células epiteliales [19] y la modulación de la proliferación de linfocitos [20] a través de la interacción de la enzima con dos de sus sustratos, L-glutamina y glutatión reducido, por lo que es el primero en identificar e investigar H. suis
determinante de virulencia. Francia El papel de la GGT durante la infección por H. pylori
in vivo
se ha investigado en ratones. conclusiones contradictorias se han elaborado sobre la importancia de la GGT para la colonización. Algunos grupos han llegado a la conclusión de que se requiere H. pylori
GGT para la infección persistente en ratones [21], mientras que otros han hecho conclusiones contrarias [22]. Además, hay más pruebas de que Helicobacter
GGT es un factor de virulencia crucial que participa en la evasión inmune y la tolerancia inmunológica [23-25].
Actualmente, no se sabe si y cómo H. suis
GGT influencias el curso de la infección por H. suis
in vivo
. El objetivo del presente estudio fue ampliar nuestros hallazgos anteriores
in vitro con H. suis
GGT, y para estudiar el papel de este factor de virulencia en la patogénesis de la infección por H. suis
in vivo
. Al mismo tiempo, el objetivo de comparar su importancia relativa con la de la GGT de H. pylori
. Los experimentos actuales se realizaron en ratones BALB /c y jerbos mongoles no consanguíneos, ya que estos modelos animales de hecho han demostrado ser herramientas valiosas para investigar el papel de Helicobacter
especies en la patología gástrica. Por lo general, en jerbos de Mongolia, un desarrollo más rápido y grave de las lesiones gástricas se pueden observar en comparación con los ratones [4,26,27].
Material y métodos
animales y cepas bacterianas
Sesenta 4-semana- viejos, ratones (SPF) Balb /c hembra de patógenos específicos libre se adquirieron de Harlan NL (Horst, Países Bajos). El veinticinco por 4 semanas de edad, SPF jerbos de Mongolia no consanguíneos hembra (Crl: MON) se obtuvieron de Charles River Laboratories (Lille, Francia): perfil Para H. suis
infección en ratones y jerbos de Mongolia, cepa HS5cLP. se utilizó. Esta cepa ha sido aislada en 2008 desde el estómago de un cerdo del matadero [28]. Para experimental H. pylori
infección en gerbos de Mongolia, cepa PMSS1 [29] se utiliza, ya que esta cepa no tiene historia de in vivo
adaptación en ratones, a diferencia de la cepa adaptada a ratón SS1. En los ratones BALB /c, H. pylori
cepa SS1 [29] fue utilizado, ya que la cepa PMSS1 previamente se ha demostrado no ser capaces de colonizar el estómago de ratones BALB /c [29].
Construcción de isogénica GGT
cepas mutantes de H. suis
y H. pylori
Un H. suis GGT isogénica
cepa mutante (HS5cLPΔggt
) se preparó como se describe anteriormente [20]. El ggt isogénica
cepa mutante de H. pylori
se obtuvo usando la misma estrategia que para la creación de la H. suis
isogénica ggt
mutante, a excepción de que un casete de resistencia a la kanamicina se utilizó en lugar de una resistencia a cloranfenicol casete [20]. Muy brevemente, la supresión de la GGT Hoteles en H. pylori SS1 y
PMSS1 fue introducido por intercambio alélico usando pBluescript II SK (+) del vector fagémido (Agilent Technologies, California, EE.UU.) en el que ~ 440 pb de los 5 ' -end y ~ 430 pb de -fin el 3 'del gen diana y el casete de resistencia a kanamicina del plásmido pKD4 [30] se ligaron a través de una estrategia mediada por PCR con 2 ciclos de PCR inversa y la fusión PCR [20]. Todos los cebadores utilizados para la construcción mediada por PCR de los plásmidos recombinantes se muestran en la Tabla 1. Comentario El plásmido resultante se amplificó en XL1-Blue MRF 'de E. coli
(Agilent Technologies) y se utiliza como un plásmido suicida en H .
pylori SS1 y PMSS1 (una especie de regalo de Sara Lindén y Anne Muller, respectivamente). El H. pylori SS1
GGT
mutante (SS1Δggt
) y H. pylori
PMSS1 GGT
mutante fueron obtenidos por electrotransformación [31] o transformación natural [32 (PMSS1Δggt
) ] como se describió anteriormente. Finalmente, se seleccionaron las bacterias en placas de agar Columbia (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) con Vitox suplemento (Oxoid), 5% (vol /vol) de sangre de carnero desfibrinada (E & O Laboratories Ltd, Bonnybridge, Reino Unido) y kanamicina (25 mg /ml). Las placas se incubaron durante 5-9 días. Los mutantes isogénicas
ggt fueron verificadas por un ensayo de actividad GGT [19], PCR y nucleótidos sequencing.Table 1 Los cebadores utilizados para la construcción de la H. pylori cepas mutantes isogénicas GGT Galeria Título Primer
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