Ruolo della γ-glutamiltranspeptidasi nella patogenesi di Helicobacter suis e le infezioni da Helicobacter pylori

Ruolo della γ-glutamiltranspeptidasi nella patogenesi dell'infezione da Helicobacter pylori Helicobacter suis
infezioni Comprare e vendere astratta
Helicobacter
(H.
) suis
possono colonizzare lo stomaco dei suini come così come gli esseri umani, causando gastrite cronica e altri cambiamenti patologici gastrici tra cui ulcera gastrica e associato alla mucosa tessuto linfoide (MALT) linfoma. Recentemente, un fattore di virulenza di H. suis
, γ-glutamil transpeptidasi (GGT), ha dimostrato di giocare un ruolo importante nell'induzione della gastrico morte cellulare epiteliale umana e la modulazione della proliferazione dei linfociti seconda glutamina e glutatione catabolismo. Nel presente studio, la rilevanza della GGT nella patogenesi di H. suis
infezione è stata studiata nel topo e modelli gerbillo della Mongolia. Inoltre, l'importanza relativa di H. suis
GGT è stata confrontata con quella del H. pylori
GGT. Un contributo significativo e diverso della GGT di H. suis
e H. pylori
è stato visto in termini di colonizzazione batterica, l'infiammazione e la risposta immunitaria evocata. A differenza di H. pylori
Δggt
ceppi, H. suis
Δggt
ceppi erano in grado di colonizzare lo stomaco a livelli paragonabili a ceppi WT, anche se indotte significativamente meno infiammazione gastrica generale nei topi. Questo è stato caratterizzato da un numero inferiore di cellule T e B, e un livello inferiore di proliferazione delle cellule epiteliali. In generale, rispetto al WT infezione ceppo, GGT
ceppi mutanti di H. suis
innescato livelli più bassi di Th1 e Th17 espressione firma di citochine. È stata osservata una upregulation pronunciato di B-linfociti chemiotattico CXCL13, sia negli animali infettati con ceppi mutanti
WT e GGT di H. suis
. È interessante notare che, H. suis
GGT ha dimostrato di influenzare il metabolismo della glutammina dell'epitelio gastrico attraverso downregulation del ASCT2 glutammina trasportatore
. Introduzione
Helicobacter
(H.
) pylori
è un batterio Gram-negativo che colonizza lo stomaco di più della metà della popolazione mondiale. L'infezione da questo batterio può causare gastrite, ulcera peptica, adenocarcinoma gastrico e associato alla mucosa tessuto linfoide (MALT) linfoma [1-3]. Oltre H. pylori
, non-H. pylori
helicobacters (NHPH) sono stati rilevati anche nello stomaco degli esseri umani e di questi batteri causare malattie gastriche simili. Il rischio di sviluppare linfoma gastrico MALT è più alto durante l'infezione NHPH rispetto a infezione da H. pylori
[4-9]. H. suis
è il NHPH gastrica più prevalente negli esseri umani. I maiali sono l'ospite naturale di questo batterio, con prevalenze che raggiungono il 90% o più [10] e, molto probabilmente, maiali e forse anche carne di maiale sono le principali fonti di umana H. suis
infezione [4,11-13].
H. suis
infezione sembra persistere per tutta la vita, almeno nei suini e roditori utilizzati come modelli per le infezioni umane [14]. Nei suini, infezione provoca lo sviluppo di gastrite e una diminuzione del peso corporeo. Inoltre, il batterio sembra giocare un ruolo nello sviluppo di ulcerazione della pars non ghiandolare oesophagea [15]. Nei topi e modelli gerbillo della Mongolia di malattie gastriche umane, sperimentale H. suis
infezione provoca grave patologia gastrica [4,16,17], tra cui gastrite, necrosi delle cellule parietali e lo sviluppo di MALT gastrico lesioni linfoma-like, simile al lesioni osservate in H. suis
esseri umani -infected.
studi precedenti hanno dimostrato che questo batterio è priva di un omologo per diversi fattori di virulenza di H. pylori
, come citotossina associati geni
patogenicità dell'isola ( cag
PAI) e la citotossina vacuolizzante (VacA) [18]. Siamo stati, però, in grado di identificare il transpeptidasi γ-glutamil (GGT) come un importante fattore di virulenza di H. suis
. Questo enzima è stato descritto per causare danno epiteliale gastrica cellule [19] e la modulazione della proliferazione linfocitaria [20] attraverso l'interazione dell'enzima con due dei suoi substrati, L-glutamina e glutatione ridotto, rendendo la prima identificato e studiato H. suis
virulenza determinante.
Il ruolo del GGT durante H. pylori
infezione in vivo
è stata studiata nei topi. conclusioni contrastanti sono state tratte per quanto riguarda l'importanza della GGT per la colonizzazione. Alcuni gruppi hanno concluso che H. pylori
GGT è necessario per infezione persistente nei topi [21], mentre altri hanno fatto conclusioni contrarie [22]. Inoltre, non vi è accumulo di prove che Helicobacter
GGT è un fattore di virulenza cruciale coinvolti in evasione immune e tolleranza immunitaria [23-25].
Attualmente, non si sa se e come H. suis
GGT influenze il corso di H. suis
infezione in vivo
. Lo scopo del presente studio è stato quello di estendere le nostre precedenti in vitro
risultati con H. suis
GGT, e di studiare il ruolo di questo fattore di virulenza nella patogenesi di H. suis
infezione in vivo
. Allo stesso tempo, abbiamo puntato al confronto la sua importanza relativa con quella del GGT di H. pylori
. Gli esperimenti in corso sono stati eseguiti in topi BALB /c e gerbilli mongoli outbred, dal momento che questi modelli animali hanno infatti dimostrato di essere validi strumenti per indagare il ruolo di Helicobacter
specie nella patologia gastrica. In genere, in gerbilli mongoli, uno sviluppo più rapido e grave di lesioni gastriche può essere osservato rispetto ai topi [4,26,27].
Materiali e metodi
animali e ceppi batterici
Sixty 4-settimana- vecchi, femminile-specific patogeni senza topi (SPF) BALB /c sono stati acquistati da Harlan NL (Horst, Paesi Bassi). Venticinque 4 settimane di età, di sesso femminile SPF gerbilli mongoli outbred (CRL: MON) sono stati ottenuti da Charles River Laboratories (Lille, Francia) Compra di H. suis
infezione nei topi e gerbilli mongoli, ceppo HS5cLP. era usato. Questo ceppo è stato isolato nel 2008 dallo stomaco di un maiale macello [28]. Per sperimentale H. pylori
infezione in gerbilli mongoli, ceppo PMSS1 [29] è stato utilizzato, dal momento che questo ceppo non ha una storia di in vivo
adattamento nei topi, in contrasto con il ceppo di topi-adattato SS1. Nei topi BALB /c, H. pylori
ceppo SS1 [29] è stato utilizzato, in quanto ceppo PMSS1 ha già dimostrato di non essere in grado di colonizzare lo stomaco di topi BALB /c [29]
. Costruzione di isogenico ggt
ceppi mutanti di H. suis
e H. pylori
Un isogenico H. suis GGT
ceppo mutante (HS5cLPΔggt
) è stato preparato come descritto in precedenza [20]. La GGT isogenico
ceppo mutante di H. pylori
sono stati ottenuti utilizzando la stessa strategia per la creazione di H. suis
isogenico GGT
mutante, tranne che una cassetta resistenza alla kanamicina è stato utilizzato al posto di un resistenza al cloramfenicolo cassette [20]. In estrema sintesi, la cancellazione di GGT
in H. pylori
SS1 e PMSS1 è stato introdotto da scambio allelica utilizzando pBluescript II SK (+) fagemidi vettore (Agilent Technologies, California, USA) in cui ~ 440 bp del 5 ' -end e ~ 430 bp del -end del 3 'del gene bersaglio e la resistenza alla kanamicina cassetta dal plasmide pKD4 [30] sono stati ligati con una strategia PCR-mediata con 2 cicli di PCR inversa e fusione PCR [20]. Tutti i primer utilizzati per la costruzione PCR-mediata dei plasmidi ricombinanti sono riportati in Tabella 1.
Il plasmide risultante è stato amplificato in XL1-Blue MRF 'E. coli
(Agilent Technologies) e utilizzati come un plasmide suicida in H . pylori
SS1 e PMSS1 (un gentile dono da Sara Linden e Anne Muller, rispettivamente). Il H. pylori
SS1 GGT
mutante (SS1Δggt
) e H. pylori
PMSS1 GGT
mutante (PMSS1Δggt
) sono stati ottenuti da electrotransformation [31] o di trasformazione naturale [32 ] come descritto in precedenza. Infine, i batteri sono stati selezionati su Columbia piastre di agar (Oxoid, Basingstoke, UK) con supplemento Vitox (Oxoid), 5% (v /v) di sangue defibrinato di montone (E & O Laboratories Ltd, Bonnybridge, Regno Unito), e kanamicina (25 mcg /mL). Le piastre sono state incubate per 5-9 giorni. I isogenici GGT
mutanti sono stati verificati da un saggio di attività GGT [19], la PCR e nucleotidi sequencing.Table 1 primer utilizzati per la costruzione del H. pylori GGT isogenici ceppi mutanti
nome Primer
Sequence (5'-3 ')
Primer utilizzare
pBlue lineare Fwd 1
GGGGATCCACTAGTTCTAGAGCG
linearizzazione del plasmide
pBlue lineare Rev1
CGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAG
linearizzazione di plasmid
HpGGT-flank_fusion1F
CTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGTAACCGGTAAAATCAACACGGACGC
Amplification H. pylori GGT
e parziali di geni fiancheggianti a monte ea valle
HpGGT-flank_fusion1R
CGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCGCGCTCTTATAAAAAGAAGCCGC
Amplificazione H. pylori GGT
e parziali di geni a monte ea valle accompagnamento
pBluelinear_Hpggtflank1F
CCAAGGAAAGAATTTTAATCCTATTTAG
linearizzazione del plasmide ricombinante
pBluelinear_Hpggtflank1R
CTGTTTTCCTTTCAATCAACAATAATC
linearizzazione del plasmide ricombinante gene di resistenza
Hpkana_fusion_1F
ATTATTGTTGATTGAAAGGAAAACAGATGATTGAACAAGATGGATTGC
Amplification kanamicina
Hpkana_fusion_1R
CTAAATAGGATTAAAATTCTTTCCTTGGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG
resistenza alla kanamicina gene Amplificazione
T7 prom3
TAATACGACTCACTATAGGG
Sequencing
M13R
CAGGAAACAGCTATGAC
Sequencing
condizioni culturali di ceppi batterici
Wild-type (WT) H. suis
ceppo HS5cLP è stato coltivato per 48 ore, come descritto in precedenza [29]. HS5cLPΔggt
batteri sono stati coltivati ​​nelle stesse condizioni come ceppo HS5cLP, tranne che le piastre di coltura sono stati integrati con cloramfenicolo (30 mg /mL) come precedentemente descritto [20].
WT H. pylori
ceppi SS1 e PMSS1 sono state coltivate su Columbia agar piastre contenenti 5% (v /v) defibrinato sangue di pecora per 48-72 ore a 37 ° C in condizioni microaerobiche come precedentemente descritto [29]. Successivamente, le colonie sono stati raccolti e coltivate in brodo Brucella integrato con Vitox (Oxoid) e il 5% di siero di vitello fetale (HyClone) su un agitatore di rotazione in condizioni microaerofilia (16 h, 125 rpm). SS1Δggt
e PMSS1Δggt
ceppi sono stati coltivati ​​nelle stesse condizioni dei corrispondenti ceppi WT su piastre integrato con kanamicina (25 mg /ml).
Experimental Design in All'arrivo, topi sessanta BALB /c e venticinque gerbilli mongoli sono stati divisi in 5 gruppi, e gli animali sono stati autorizzati per acclimatarsi al nuovo ambiente per 1 settimana. Gli animali sono stati inoculati intragastricamente 3 volte a 48 h intervalli. Gli animali appartenenti al gruppo 1 e 2 (entrambi i topi e gerbilli della Mongolia) sono state inoculate con brodo Brucella contenente 8 × 10 7 batteri vitali dei ceppi HS5cLP e HS5cLPΔggt
, rispettivamente. Animali in gruppo 3 e 4 sono stati inoculati con brodo Brucella contenente 3 × 10 8 batteri vitali dei ceppi SS1 e SS1Δggt
(topi) o 1 × 10 9 batteri vitali dei ceppi PMSS1 e PMSS1Δggt
(gerbilli). Animali nel quinto gruppo sono stati inoculati con Brucella brodo e servite come controlli non infetti. Per i topi, a 4 settimane, 9 settimane e 6 mesi dopo l'infezione (pi), 4 animali di ogni gruppo sono stati sacrificati per dislocazione cervicale in anestesia isoflurano. Per gerbilli della Mongolia, tutti gli animali sono stati sacrificati a 9 settimane PI. Gli stomaci degli animali sono stati asportati per ulteriori elaborazioni, come descritto in precedenza [27,29].
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Gand, Belgio (EC2013 /29).
l'esame istopatologico e immunoistochimica (IHC)
Tre strisce longitudinali di tessuto gastrico da topi e gerbilli mongoli sono stati tagliati dall'esofago al duodeno lungo la grande curvatura. Tessuto è stato fissato in 4% tamponata con fosfato di formaldeide, trattati con metodi standard e inclusi in paraffina per la microscopia ottica. Cinque sezioni seriali di 5 micron sono stati tagliati. La prima sezione è stata macchiata con ematossilina /eosina (H & E) di segnare il grado di gastrite secondo il sistema Sydney Aggiornato con alcune modifiche [33]. Dopo deparaffinizzazione e reidratazione per le sezioni restanti, indotta dal calore recupero dell'antigene è stata effettuata in tampone citrato (pH = 6,0). Per bloccare reazioni endogena perossidasi e non specifici, tutti i vetrini sono stati incubati con 3% H 2O 2 in metanolo (5 min) e siero di capra 30% (30 min), rispettivamente. Per la differenziazione tra linfociti T e B, antigeni CD3 e CD20 sono state colorate su sezioni due e tre, utilizzando un anticorpo policlonale di coniglio anti-CD3 (1/100; DakoCytomation, Glostrup, Danimarca) ed un coniglio policlonale anticorpo anti-CD20 (1 /25; Thermo Scientific, Fremont, Stati Uniti d'America), rispettivamente. Queste sezioni sono stati successivamente trattati con Envision + Sistema-HPR (DAB) (DakoCytomation) per l'uso con anticorpi di coniglio primari. Nella quarta e quinta sezione, la proliferazione delle cellule epiteliali e il numero di cellule parietali sono stati determinati tramite colorazione immunoistochimica, utilizzando un anticorpo monoclonale di topo anti-anticorpo Ki67 (1/25; Menarini Diagnostics, Zaventem, Belgio) e monoclonale di topo anti-ATPasi potassio idrogeno β-subunità (H + /K + ATPasi) anticorpo (1/25 000; Abcam Ltd, Cambridge, UK), rispettivamente. visualizzazione successiva è stato fatto con Envision + Sistema-HPR (DAB) (DakoCytomation) per l'utilizzo con il mouse anticorpi primari. Quantificazione di cellule T, cellule B e cellule epiteliali sono state eseguite come descritto in precedenza [4]. Brevemente, il numero di celle appartenenti a popolazioni cellulari definiti (cellule T, cellule B e cellule epiteliali) sono stati determinati contando le cellule positive in cinque scelto casualmente alto potere Fields (ingrandimento: × 400), sia nella regione antro e corpus .
al fine di valutare il possibile sviluppo di metaplasia pseudopilorica indotta da Helicobacter
infezione, Alcian blu-acido periodico di Schiff macchia colorazione (AB /PAS) è stata eseguita
. Quantificazione dei batteri che colonizzano nello stomaco di topi e mongoli gerbils
strisce di tessuto gastrico che contiene tutte le regioni per i topi e pezzi separati (antro e corpo) per gerbilli mongoli sono stati memorizzati in 0,5 ml RNAlater
soluzione (Ambion, Austin, TE, stati Uniti d'America) a -70 ° C fino RNA e DNA estrazione. Quantitativa Real-Time PCR (qRT-PCR) è stato utilizzato per determinare il numero di batteri che colonizzano nel tessuto gastrico, come descritto in precedenza [29,34].
Estrazione di RNA e trascrizione
qRT-PCR inversa è stata utilizzata per determinare l'espressione genica nel tessuto gastrico da topi e gerbilli mongoli. L'RNA totale è stato estratto utilizzando il kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Germania) secondo le istruzioni del produttore. La concentrazione di RNA è stata misurata utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop (Isogen Life Science, PW De Meern, Utrecht, Paesi Bassi). La purezza del RNA è stata valutata con il sistema automatizzato di elettroforesi Experion utilizzando StdSens RNA chip (Bio-Rad, Hercules CA, USA). La concentrazione di RNA da tutti i campioni è stata regolata a 1 mg /mL e cDNA è stato sintetizzato subito dopo la purificazione di RNA utilizzando il kit iScript ™ cDNA Synthesis (Bio-Rad).
Progettazione e validazione di primer e determinazione dell'espressione genica
i geni housekeeping H2afz, PPIA Comprare e HPRT
sono stati inclusi come i geni di riferimento per topi [29]. Per gerbilli della Mongolia, una serie di geni di riferimento è stato testato in base al fatto che essi sono ampiamente utilizzati in altre specie animali. I primer sono stati progettati in base alle regioni conservate di ACTB, β-actina, RPS18
, GAPDH
, HPRT1
, SDHA
e UBC
sequenze codificanti complete o parziali disponibili per gli esseri umani, maiali, topi e ratti.
I livelli di espressione di mRNA di varie citochine (IFN-gamma, IL-4, IL-5, IL-17, IL-1β, IL-6, IL-10), precedentemente dimostrato di essere espressi in modo differenziale durante H. suis
infezione, così come altri geni (Foxp3, CXCL13, ASCT2, ATP4a, e ATP4b) sono stati quantificati usando basato SYBR Green RT-PCR con iQ ™ SYBR Green Supermix. Le reazioni sono state eseguite utilizzando un sistema PCR CFX96 RT in una C1000 Cycler termico (Bio-Rad), come descritto in precedenza [29]. Tutte le reazioni sono state eseguite in 12 volumi microlitri contenenti 0,05 ml di ciascun primer (1,25 pmol /mL), 6 ml iQ ™ SYBR Green Supermix, 3,9 microlitri HPLC acqua e 2 ml cDNA. Il programma sperimentale consisteva di 95 ° C per 15 minuti, seguiti da 40 cicli di denaturazione a 95 ° C per 20 s, ricottura a 60 ° C per 30 s, e estensione a 72 ° C per 30 s. I valori del ciclo soglia (Ct) sono stati normalizzati per le medie geometriche dei geni di riferimento ei livelli di mRNA normalizzati di tutti i geni bersaglio sono stati calcolati secondo il metodo di 2 -ΔΔCt [35].
A causa della indisponibilità di informazioni gene per /alato fattore Forkhead elica trascrizione (Foxp3) e chemochine CXC ligando 13 (CXCL13) da gerbilli mongoli, primer sono stati progettati sulla base dei regioni conservate di Foxp3 e CXCL13 sequenze complete o parziali di codifica disponibili per gli esseri umani, maiali, topi e ratti con la stessa strategia sopra descritta. I livelli di espressione di mRNA di Foxp3 e CXCL13 sono stati determinati usando lo stesso metodo come descritto sopra. informazioni sulla sequenza di tutti i primer per topi e per gerbilli mongoli è illustrato nelle tabelle 2 e 3.Table 2 Elenco dei geni e primer utilizzati per qRT-PCR in gerbilli mongoli
Gene
Primer

Sequence (5'-3 ')
Riferimenti
Foxp3
senso
GCCCCTMGTCATGGTGGCA
Questo studio
antisenso
CCGGGCCTTGAGGGAGAAGA
CXCL13
senso
GAATGGCTGCCCCAAAACTGAA
Questo studio
antisenso
TCACTGGAGCTTGGGGAGTTGAA
GAPDH
senso
AACGGGAAGCTCACTGGCATG
Questo studio
antisenso
CTGCTTCACCACCTTCTTGATGTCA
HPRT1
senso
GCCCCAAAATGGTTAAGGTTGCA
Questo studio
antisenso
TCAAGGGCATATCCAACAACAAAC
RPS18
senso
CGAGTACTCAACACCAACATCGATGG
Questo studio
antisenso
ATGTCTGCTTTCCTCAACACCACATG
IL-1β
senso
GGCAGGTGGTATCGCTCATC
[64]
antisenso
CACCTTGGATTTGACTTCTA
IFN-γ

senso
CCATGAACGCTACACACTGCATC
[65]
antisenso
GAAGTAGAAAGAGACAATCTGG
IL-5
senso
AGAGAAGTGTGGCGAGGAGAGACG
[27]
antisenso
ACAGGGCAATCCCTTCATCGG
IL-6
senso
GAGGTGAAGGATCCAGGTCA
[66]
antisenso
GAGGAATGTCCTCAGCTTGG
IL-10
senso
GGTTGCCAAGCCTTATCAGA
[27]
antisenso
GCTGCATTCTGAGGGTCTTC
IL-17
senso
AGCTCCAGAGGCCCTCGGAC
[64]
antisenso
AGGACCAGGATCTCTTGCTG
ATP4b
senso
GGGGGTAACCTTGAGACCTGATG
[27]
antisenso
AAGAAGTACCTTTCCGACGTGCAG
β-actina
senso
TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA
[66]
antisenso
CCAGACAGCACTGTGTTGGC
Tabella 3 Elenco dei geni e primer utilizzati per qRT-PCR nei topi
Gene
Primer
Sequence (5'-3 ')

Referenze
IL-1β
senso
GGGCCTCAA AGGAAAGAATC
[29]
antisenso
TACCAGTTGGGGAACTCTGC
IFN-γ

senso
GCGTCATTGAATCACACCTG
[29]
antisenso
TGAGCTCATTGAATGCTTGG
IL-4
senso
ACTCTTTCGGGCTTTTCGAT
[29]
antisenso
AAAAATTCATAAGTTAAAGCATGGTG
IL-10
senso
ATCGATTTCTCCCCTGTGAA
[29]
antisenso
CACACTGCAGGTGTTTTAGCTT
IL-17
senso
TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA
[29]
antisenso
CTTTCCCTCCGCATTGACAC
Foxp3
senso
GCCCCTMGTCATGGTGGCA
Questo studio
antisenso
CCGGGCCTTGAGGGAGAAGA
CXCL13

senso
CTCTCCAGGCCACGGTATT
[67]
antisenso
TAACCATTTGGCACGAGGAT
ATP4a
senso
TGCTGCTATCTGCCTCATTG
[68]
antisenso
GTGCTCTTGAACTCCTGGTAG
ATP4b
senso
AACAGAATTGTCAAGTTCCTC
[68]
antisenso
AGACTGAAGGTGCCATTG
HPRT
senso
CAGGCCAGACTTTGTTGGAT
[29]
antisenso
TTGCGCTCATCTTAGGCTTT
PPIA
senso
AGCATACAGGTCCTGGCATC
[29]
antisenso
TTCACCTTCCCAAAGACCAC
H2afz
senso
CGTATCACCCCTCGTCACTT
[29]
antisenso
TCAGCGATTTGTGGATGTGT
analisi statistica
differenze di capacità di colonizzazione sono stati analizzati utilizzando un non-parametrico di Mann-Whitney U
test. Le differenze di infiltrazione linfocitaria, espressione di citochine e l'analisi IHC sono stati valutati con un ANOVA seguito da un test di Bonferroni post hoc. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software SPSS Statistics 20 (IBM). confronti a coppie sono state fatte per ogni time-point individuale e sui dati aggregati utilizzando il tempo come fattore di stratificazione. P
valori inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. Tutti i dati sono espressi come media ± SD. Tutti i dati sono stati creati utilizzando il software GraphPad Prism5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).
Risultati
densità colonizzazione
Tutti gli animali di controllo sono risultati negativi per Helicobacter
. I risultati di animali infetti hanno mostrato che la WT H. suis
persistente può colonizzare lo stomaco del mouse con i livelli di colonizzazione più in alto 5,42 × 10 4 (± 1,46 × 10 4) i batteri /mg di tessuto gastrico anche a 6 mesi pi (Figura 1C). H. pylori
ceppo SS1 è stato mostrato a colonizzare lo stomaco del mouse ad una densità batterica molto più bassa, essendo 1.68 × 10 3 (± 1.73 × 10 3) batteri /tessuto mg a 6 mesi pi (Figura 1C, p
< 0,05). Figura 1 Correlazione tra la capacità di colonizzazione batterica e punteggio infiammazione nello stomaco di topi e gerbilli mongoli. La capacità di colonizzazione è mostrato come log10 valori di H. suis
o H. pylori
per mg di tessuto, determinato con qRT-PCR nel corpus di topi (A-C) e antro di gerbilli mongoli (D). 0, nessuna infiltrazione con mononucleare e /o di cellule polimorfonucleati; 1, molto lieve infiltrazione diffusa con mononucleare e /o cellule polimorfonucleati o la presenza di una piccola (20-50 cellule) aggregato di cellule infiammatorie; 2, lieve infiltrazione diffusa con mononucleare e /o cellule polimorfonucleati o la presenza di una piccola (50-200 cellule) aggregato di cellule infiammatorie; 3, moderata infiltrazione diffusa con mononucleare e /o cellule polimorfonucleati e /o la presenza di 2-4 aggregati infiammatori; 4, contrassegnati con infiltrazione diffusa mononucleare e /o cellule polimorfonucleati e /o la presenza di almeno cinque aggregati infiammatorie. HS contro HSM: Colonizzazione: p
> 0,05; Infiammazione: p
< 0.05. SS1 vs SS1m: Colonizzazione: p
< 0,05; Infiammazione: p
< 0.05. PMSS1 vs PMSS1m: Colonizzazione: p
> 0,05; Infiammazione: p
< 0.05. HS: animali infetti con WT H. suis
srain HS5cLP; HSM: animali infettati da H. suis
ceppo HS5cLPΔggt
; SS1: animali infettati con WT H. pylori
SS1; SS1m: animali infettati da H. pylori
SS1Δggt
; PMSS1: animali infettati con WT H. pylori
PMSS1; PMSS1m: animali infettati da H. pylori
PMSS1Δggt
È interessante notare che, H. suis
ceppo HS5cLPΔggt
è stato in grado di colonizzare il corpus dello stomaco dei topi in misura simile come il. WT sforzo, e questo è stato osservato per tutti i momenti (figure 1A-1C). Al contrario, H. pylori
ceppo SS1Δggt
ha dimostrato di avere una capacità di colonizzazione ridotta nei topi in tutti e tre i tempi di valutazione (Figure 1A-1C, p
< 0,05). dati colonizzazione simili sono stati dimostrati nel antro di Helicobacter
infettato-topi in tutti e tre i tempi di valutazione (dati non riportati).
Sia la HS5cLP e HS5cLPΔggt
ceppo colonizzato con successo l'antro e corpus dello stomaco di gerbilli della Mongolia , anche se i tassi di colonizzazione erano molto più bassi nel corpus rispetto al antro. Non sono state osservate differenze statisticamente significative tra i due ceppi (Figura 1D, p
> 0,05). H. pylori
ceppo PMSS1Δggt
è stato in grado di colonizzare l'antro e corpus dello stomaco a livelli simili rispetto a PMSS1 (Figura 1D, p
> 0,05), anche se 2 su 5 gerbilli della Mongolia sono risultati negativi per la presenza di PMSS1Δggt
nel corpus dello stomaco (dati non riportati).
infiammazione infezione indotta
tutti i topi di controllo e gerbilli hanno mostrato normale istomorfologia gastrico in tutti i momenti. La correlazione tra i punteggi di infiammazione e la colonizzazione batterica viene visualizzato in figura 1.
rispetto ai topi WT con infezione da ceppo, l'infezione da H. suis
ceppo HS5cLPΔggt
generalmente indotta significativamente meno infiammazione generale sia nel antro (p
< 0,01) e corpus (p
< 0,01), mentre solo nella regione corpus (p
< 0,01), l'infezione da H. pylori
ceppo SS1Δggt
indotta meno infiammazione, rispetto a quello osservato nei topi infettati ceppo WT. A 6 mesi pi, regione corpus in 2 di 4 topi con infezione HS5cLP conteneva grandi aggregati linfoidi o follicoli linfoidi accompagnati dalla distruzione della normale architettura della mucosa (Figura 2A), che non è stato osservato in animali da altri gruppi. Figura 2 H & E colorazione di sezioni di stomaco di topi Helicobacter -infected e gerbilli mongoli. micrografie Rappresentante di H & sezioni colorate E qui illustrati sono stati prelevati dai topi per via orale inoculati con H. suis
HS5cLP (A), H. suis
HS5cLPΔggt
(B), H. pylori
SS1 ( C) e H. pylori
SS1Δggt
(D) a 6 mesi dall'inoculazione e mongoli gerbilli per via orale sfidati con H. suis
HS5cLP (e), H. suis
HS5cLPΔggt
(F ), H. pylori
a 9 settimane dopo l'inoculazione PMSS1 (G) e H. pylori
PMSS1Δggt
(H). Le frecce indicano la presenza di cellule infiammatorie, aggregati infiammatorie, infiltrazione linfocitaria, o follicoli linfocitarie. HS: animali infetti con WT H. suis
ceppo HS5cLP; HSM: animali infettati da H. suis
ceppo HS5cLPΔggt
; SS1: animali infettati con WT H. pylori
SS1; SS1m: animali infettati da H. pylori
SS1Δggt
; PMSS1: animali infettati con WT H. pylori
PMSS1; PMSS1m: animali infettati da H. pylori
PMSS1Δggt
; WT: wild-type. ingrandimento originale:. 100 × Compra di gerbilli della Mongolia, l'infezione con HS5cLP o PMSS1 indotto grave gastrite antro-dominante con formazione di aggregati linfocitica nella lamina propria e /o sub-mucosa dello stomaco (figure 1D, 2E, 2G e ). Non sono state osservate differenze significative tra il WT e ceppo mutante di H. suis
rispetto alla risposta infiammatoria indotta in gerbilli (Figure 1D, 2E e 2 F), anche se tutti gli animali infettati con ceppo HS5cLP hanno mostrato l'infiammazione nella regione corpus , mentre questo è stato solo il caso di alcuni animali infettati con HS5cLPΔggt
(dati non riportati). In un gerbillo infettati da H. suis
ceppo HS5cLP, è stata osservata una risposta infiammatoria marcata, in cui oltre il 65% della superficie della lamina propria e sottomucosa del antro era densamente infiltrati di cellule infiammatorie, fuso aggregati linfoidi e . follicoli linfoidi (file aggiuntivo 1)
infiammazione indotta da H. pylori
ceppo PMSS1Δggt
nel antro di gerbilli era meno grave rispetto a quello visto in animali infetti WT (p
< 0,05) . (figure 1D, 2G e 2H)
infiammatoria infiltrazione di cellule
in generale, un aumento del numero di cellule T è stata osservata nel corpus (Figura 3A, p
< 0,05) dei topi infettati con H. suis
ceppo HS5cLP e H. pylori
ceppo SS1 a tutti i tre momenti. Rispetto ai topi infettati con WT H. suis
, HS5cLPΔggt
ha indotto una risposta inferiore di cellule T nel corpus a 6 mesi pi (p
< 0,01). H. pylori
ceppo SS1Δggt
ha indotto una risposta delle cellule T ridotto nella regione corpus (p
< 0,01) rispetto agli animali infetti WT, sia a 9 settimane e 6 mesi pi (Figura 3A). Risultati simili sono stati osservati nel antro dei topi (dati non mostrati). Figura 3 Analisi quantitativa delle popolazioni cellulari definiti con immunoistochimica.

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