Rolle von γ-Glutamyltranspeptidase in der Pathogenese von Helicobacter suis und Helicobacter pylori-Infektionen

Die Rolle von γ-Glutamyl in der Pathogenese von Helicobacter suis
und Helicobacter pylori
Infektionen
Zusammenfassung Helicobacter
(H.
) suis
den Magen von Schweinen besiedeln können als chronische Gastritis und andere Magen-pathologischen Veränderungen einschließlich Magengeschwüren und schleimhaut assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT) Lymphom auch Menschen, verursacht. Kürzlich wurde ein Virulenzfaktor von H. suis
, γ-Glutamyl-Transpeptidase (GGT), wurde gezeigt, eine wichtige Rolle bei der Induktion von menschlichen Magen epithelialen Zelltod und Modulation der Lymphozytenproliferation spielen abhängig von Glutamin und Glutathion-Katabolismus. In der vorliegenden Studie wurde die Relevanz von GGT in der Pathogenese der
Infektion H. suis wurde in der Maus und mongolischen Wüstenrennmaus-Modelle untersucht. Zusätzlich wurde die relative Bedeutung von H. suis
GGT im Vergleich mit der des GGT
H. pylori. Eine signifikante und unterschiedliche Beitrag der GGT von H. suis
und H. pylori
wurde im Hinblick auf die bakterielle Besiedlung, Entzündung und der Immunantwort hervorgerufen gesehen. Im Gegensatz zu H. pylori
Δggt
Stämme, H. suis
Δggt
Stämme waren in der Lage, den Magen auf einem Niveau vergleichbar mit WT-Stämme besiedeln, obwohl sie deutlich weniger Gesamtmagenentzündung bei Mäusen induziert. Dies wurde durch geringere Zahl von T- und B-Zellen gekennzeichnet sind, und einem unteren Niveau der epithelialen Zellproliferation. In der Regel im Vergleich zu WT-Stamm-Infektion, GGT
Mutantenstämme von H. suis
unteren Ebenen der Th1 und Th17 Unterschrift Cytokin-Expression ausgelöst. Eine ausgeprägte Hochregulation von B-Lymphozyten-chemische Lockstoffe CXCL13 wurde in infizierten Tieren mit WT und GGT
mutierten Stämme von H. suis
beobachtet, die beide. Interessanterweise wurde H. suis
GGT gezeigt, um die Glutamin Stoffwechsel von Magen-Epithel durch Herunterregulieren des Glutamin-Transporter ASCT2 zu beeinflussen.
Einführung Helicobacter
(H.
) pylori
ist eine Gram-negative Bakterium, das den Magen von mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung kolonisiert. Die Infektion mit diesem Bakterium kann Gastritis, Magengeschwüre verursachen, Adenokarzinom des Magens und schleimhaut assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT) Lymphom [1-3]. Neben H. pylori
, nicht-H. pylori
helicobacters (NPSH) haben auch im Magen des Menschen und diese Bakterien verursachen ähnliche Magenerkrankungen nachgewiesen worden. Das Risiko von Magen-MALT-Lymphom zu entwickeln, ist höher während der NPSH-Infektion im Vergleich zu einer Infektion mit H. pylori
[4-9]. H. suis
die am weitesten verbreitete Magen-NPSH beim Menschen ist. Schweine sind der natürliche Wirt dieses Bakteriums, mit Prävalenzen Erreichen von 90% oder mehr [10] und höchstwahrscheinlich, Schweine und möglicherweise auch Schweinefleisch sind die wichtigsten Quellen der menschlichen H. suis
Infektion [4,11-13].
H. suis
Infektion scheint für das Leben zu bestehen, zumindest bei Schweinen und Nagetiere als Modelle für menschliche Infektionen verwendet [14]. Bei Schweinen verursacht Infektion Entwicklung von Gastritis und eine Abnahme der Körpergewichtszunahme. Außerdem scheint das Bakterium eine Rolle in der Entwicklung von Geschwüren der nicht-glandulären pars oesophagea [15] zu spielen. Bei Mäusen und mongolische Gerbils Modelle menschlicher Erkrankungen des Magens, experimentelle H. suis
Infektion verursacht schwere Magen-Pathologie [4,16,17], einschließlich Gastritis, Parietalzelle Nekrose und die Entwicklung von Magen-MALT-Lymphom-ähnliche Läsionen, ähnlich der Läsionen in H. suis beobachtet
infizierten Menschen.
Frühere Studien haben gezeigt, dass dieses Bakterium
Pathogenitätsinsel ein Homolog mehrere Virulenzfaktoren von H. pylori
wie die Cytotoxin assoziierter Gene fehlen ( cag
PAI) und die Vakuolen cytotoxin (VacA) [18]. Wir waren jedoch fähig ist, die γ-Glutamyl-Transpeptidase (GGT) als wichtiger Virulenzfaktor von H. suis
identifizieren. Dieses Enzym wurde beschrieben mit zwei seiner Substrate, L-Glutamin und reduziertes Glutathion Magenepithelzellen Zellschädigung [19] und die Modulation der Lymphozytenproliferation [20] durch die Wechselwirkung des Enzyms zu verursachen, ist es die erste identifizierte machen und untersuchte H. suis
Virulenzdeterminante.
Die Rolle der GGT bei H. pylori
Infektion in vivo
in Mäusen untersucht worden ist. Widersprüchliche Schlussfolgerungen wurden in Bezug auf die Bedeutung von GGT für die Besiedlung gezogen. Einige Gruppen haben festgestellt, dass H. pylori
GGT für persistierende Infektion erforderlich ist, bei Mäusen [21], während andere im Gegensatz Schlussfolgerungen gemacht haben [22]. Darüber hinaus gibt es vermehrt Hinweise, dass Helicobacter
GGT ist ein entscheidender Faktor bei der Virulenz Immunevasion und Immuntoleranz beteiligt [23-25].
Derzeit ist nicht bekannt, ob und wie H. suis
GGT Einflüsse der Verlauf der H. suis
Infektion in vivo
. Das Ziel der vorliegenden Studie war es unsere bisherigen in vitro
Erkenntnisse mit H. suis
GGT zu erweitern und die Rolle dieses Virulenzfaktor in der Pathogenese von H. zu studieren suis
Infektion in vivo
. Zugleich wollten wir an ihrer relativen Bedeutung zu vergleichen mit derjenigen der GGT von H. pylori
. Die derzeitigen Versuche wurden in BALB /c Mäusen und outbred mongolische Gerbils durchgeführt, da diese Tiermodelle haben in der Tat wertvolle Werkzeuge zu sein, zu untersuchen, die Rolle von Helicobacter
Spezies in Magen Pathologie gezeigt. Typischerweise kann in der mongolischen Wüstenrennmäuse, eine schnellere und starke Entwicklung von Magen-Läsionen bei Mäusen beobachtet werden, im Vergleich [4,26,27].
Material und Methoden
Tier- und Bakterienstämme
Sixty 4-Wochen- alt, weiblich spezifischen pathogenfreien (SPF) Balb /c-Mäuse wurden von Harlan NL (Horst, Niederlande) erworben. Fünfundzwanzig 4 Wochen alten, weiblichen SPF Auszucht Mongolische Rennmäuse (Crl: MON) wurden von Charles River Laboratories (Lille, Frankreich) erhalten
Für H. suis
Infektion bei Mäusen und Mongolische Rennmäuse, Stamm HS5cLP. wurde benutzt. Dieser Stamm wurde im Jahr 2008 aus dem Magen eines Schlachthofs Schwein [28] isoliert. Für die experimentelle H. pylori
Infektion in der mongolischen Wüstenrennmäuse, Stamm PMSS1 [29] wurde verwendet, da dieser Stamm keine Geschichte von in vivo
Anpassung an Mäusen hat, im Gegensatz zum Maus-adaptierten Stamm SS1. In Balb /c-Mäuse, H. pylori
Stamm SS1 [29] verwendet wurde, ist seit dem Stamm PMSS1 bisher nicht in der Lage sein, den Magen von Balb /c-Mäusen nachgewiesen worden zu kolonisieren [29].
Bau von isogenen GGT
Mutantenstämme von H. suis
und H. pylori auf
isogene H. suis GGT
Mutantenstamm (HS5cLPΔggt
) wurde wie zuvor beschrieben hergestellt [20]. Die isogenen ggt
mutanten Stamm von H. pylori
wurde unter Verwendung der gleichen Strategie erhalten, wie für die Erstellung der H. suis
isogenen ggt
mutant, außer dass eine Kanamycin-Resistenzkassette anstelle eines verwendet wurde, Chloramphenicol-Resistenzkassette [20]. Sehr kurz, Löschen von GGT
in H. pylori
SS1 und PMSS1 wurde durch allelischen Austausch unter Verwendung von pBluescript II SK (+) Phagemid-Vektor (Agilent Technologies, California, USA), in dem ~ 440 bp der 5'eingeführt -Ende und ~ 430 bp der -Ende des Zielgens '3 und die Kanamycin-Resistenzkassette aus dem Plasmid pKD4 [30] wurden durch eine PCR-vermittelte Strategie mit 2 Zyklen inverse PCR und Fusions-PCR [20] ligiert. Alle Primer für die PCR-vermittelte Konstruktion der rekombinanten Plasmide sind in Tabelle 1 gezeigt. Das resultierende Plasmid
wurde in XL1-Blue MRF 'amplifiziert E. coli
(Agilent Technologies) und als suicide Plasmid in H verwendet .
SS1 und PMSS1 (ein freundliches Geschenk von Sara Lindén und Anne Müller, beziehungsweise) pylori. Die H. pylori
SS1 GGT
Mutante (SS1Δggt
) und H. pylori
PMSS1 GGT
Mutante (PMSS1Δggt
) durch Elektro erhalten wurden, [31] oder natürliche Transformation [32 ], wie zuvor beschrieben. Schließlich wurden Bakterien-Agar-Platten auf Columbia ausgewählt (Oxoid, Basingstoke, UK) mit Vitox Zuschlag (Oxoid), 5% (v /v) defibriniert Schafblut (E & O Laboratories Ltd, Bonnybridge, Großbritannien) und Kanamycin (25 &mgr; g /ml). Die Platten wurden für 5-9 Tage inkubiert. Die isogenen GGT
Mutanten von einem GGT-Aktivitätstest nachgewiesen wurden [19], PCR und Nukleotid sequencing.Table 1 Grundierungen für den Bau der H. pylori verwendet GGT isogenen Mutanten-Stämme
Primer Name
Sequence (5 '3')
Primer verwenden
pBlue linear Fwd 1

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