Úloha y-glutamyltranspeptidázy v patogenéze Helicobacter pylori suis a infekcie Helicobacter

Úloha y-glutamyltranspeptidázy v patogenéze Helicobacter suis stroje a Helicobacter pylori infekcií
Abstract
Helicobacter
(H.
) suis
môžu kolonizovať žalúdok ošípaných rovnako ako ľudia, čo spôsobuje chronickú gastritídu a ďalších žalúdočných patologické zmeny, vrátane žalúdočných vredov a sliznice-spojené lymfatického tkaniva (MALT) lymfómu. V poslednej dobe, faktor virulencie H. suis
, γ-glutamyl transpeptidázy (GGT), bolo preukázané, že hrajú dôležitú úlohu v indukcii ľudskej žalúdočnej smrti epitelových buniek a moduláciu proliferácie lymfocytov v závislosti na glutamínu a glutatión katabolizmu. V tejto štúdii, relevantnosti GGT v patogenéze H. suis
infekcie sa sledovala u myší a mongolských modelov pískomil. Okrem toho relatívny význam H. suis
GMT bola porovnávaná s H. pylori
GMT. Významný a iný prínos GGT H. suis stroje a H. pylori
bolo pozorované, pokiaľ ide o bakteriálnu kolonizácie, zápalu a vyvolal imunitnej odpovede. Na rozdiel od H. pylori
Δggt
kmeňov H. suis
Δggt
kmene boli schopné kolonizovať žalúdok na úrovni porovnateľnej s kmeňmi WT, aj keď indukované významne menšie celkovú žalúdočné zápalu u myší. Tento sa vyznačuje nižším počtom T a B buniek, a nižšou úrovňou epitelovej bunkovej proliferácie. Všeobecne platí, že v porovnaní s WT kmeňa infekciou, GGT
mutantných kmeňov H. suis
vyvolalo nižšiu hladinu expresie podpis cytokínov Th1 a Th17. Bolo pozorované výrazné zvýšenie expresie z B-lymfocytov chemostatický CXCL13, ako u zvierat, infikovaných WT a GMT
mutantných kmeňov H. suis
. Je zaujímavé, že H. suis
GMT bolo preukázané, že vplyv na glutamín metabolizmus žalúdočnej epitelu cez down-reguláciu na glutamín transportéra ASCT2.
Úvod
Helicobacter
(H.
) pylori
je gramnegatívne baktérie, ktorá kolonizuje žalúdok viac ako polovicu svetovej populácie. Infekcia touto baktériou môže spôsobiť gastritídu, peptické vredovej choroby, adenokarcinómu žalúdka a sliznice, lymfóm asociovaný s lymfoidné tkanív (MALT lymfóm) [1-3]. Okrem H. pylori
non-H. pylori
helicobacters (NHPh) sa zistili aj v žalúdku človeka a tieto baktérie spôsobujú podobné žalúdočné ochorenia. Riziko vzniku žalúdočné MALT lymfóm je vyššia počas infekcie NHPh v porovnaní s infekciou H. pylori
[4-9]. H. suis
je najrozšírenejší žalúdočnej NHPh u ľudí. Ošípané sú prirodzeným hostiteľom tejto baktérie, sa prevalencia dosahuje 90% alebo viac [10] a s najväčšou pravdepodobnosťou, ošípané a prípadne aj bravčové mäso sú hlavnými zdrojmi ľudského H. suis
infekcii [4,11-13].
H. suis
infekcie sa zdá, pretrváva po celý život, aspoň u ošípaných a hlodavcov ako modely infekcií u ľudí [14]. U ošípaných, infekcie spôsobuje rozvoj gastritídy a zníženie prírastku telesnej hmotnosti. Navyše sa zdá, že baktérie zohrávajú úlohu vo vývoji vredov nesekretorické pars oesophagea [15]. U myší a mongolských Gerbil modelov ľudskej žalúdočnej choroby, experimentálne H. suis
infekcie spôsobuje ťažkú ​​žalúdočné patológie [4,16,17], vrátane gastritídy, parietálnej nekróza buniek a vývoj žalúdočné MALT lymfómu podobné lézie, podobať lézie pozorované v H. suis
-infected ľudí.
Predchádzajúce štúdie ukázali, že táto baktéria postráda homolog na niekoľko faktorov virulencie baktérií H. pylori
, ako sú napríklad cytotoxin spojené gény
patogenity ostrov ( bunda
PAI) a vacuolating cytotoxin (krava) [18]. Boli sme však schopné identifikovať γ-glutamyltranspeptidasy (GGT), ako dôležitý faktor virulencie H. suis
. Tento enzým bol opísaný spôsobiť žalúdočné epitheliální poškodenie buniek [19] a moduláciu proliferácie lymfocytov [20] prostredníctvom interakcie enzýmu s dvoch svojich substrátov, L-glutamínu a redukovaného glutatiónu, a je tak prvýkrát identifikovaný a skúmané H. suis
virulencie determinant.
úlohu GMT počas H. pylori
infekcii in vivo
bol vyšetrovaný u myší. S ňou v rozpore závery boli vyvodené ohľadom významu GMT pre kolonizáciu. Niektoré skupiny majú k záveru, že je potrebné H. pylori
GMT pre pretrvávajúce infekcie u myší [21], zatiaľ čo iní robili v rozpore závery [22]. Okrem toho je tu Hromadia sa dôkazy, že Helicobacter
GGT je kľúčovým faktorom virulencie podieľa na imunitný únikov a imunitný tolerancie [23-25].
V súčasnej dobe nie je známe, či a akým spôsobom H. suis
GGT vplyvmi priebeh H. suis
infekcii in vivo
. Cieľom tejto štúdie bolo rozšíriť naše predchádzajúce in vitro
zistení v H. suis
GMT, a pre štúdium role tohto faktora virulencie v patogenéze H. suis
infekcie in vivo
. V rovnakej dobe, sme sa zamerali na porovnaním relatívny význam, ktorý sa v GGT H. pylori
. Súčasné pokusy boli vykonané v Balb /c myší a mimodruhovo mongolských Gerbil, pretože tieto zvieracie modely skutočne bolo preukázané, že je cenným nástrojom pre skúmať úlohu Helicobacter
druhov v žalúdku patológie. Typicky, v mongolských Gerbil, oveľa rýchlejší a závažnejší vývoj žalúdočných lézií možno pozorovať v porovnaní s myšami [4,26,27].
Materiál a metódy
zvierat a bakteriálne kmene
Sixty-4 týd- nu stará žena, špecifického patogénu (SPF) Balb /c myši boli získané od Harlan NL (Horst, Holandsko). Dvadsaťpäť 4 týždne staré samice SPF mimodruhovo pískomil mongolský (CRL: MON) boli získané od Charles River Laboratories (Lille, Francúzsko) Apartmán V H. suis
infekcie u myší a mongolskej pieskomily, kmeň HS5cLP. bol použitý. Tento kmeň bol izolovaný v roku 2008 z žalúdka bitúnkov prasaťa [28]. Pre experimentálne H. pylori
infekcie u mongolských Gerbil, kmeň PMSS1 [29] bol použitý, pretože tento kmeň nemá históriu in vivo
prispôsobenie u myší, na rozdiel od kmeňa myší prispôsobené SS1. V Balb /c myší, H. pylori kmeňa
SS1 [29] bol použitý, pretože kmeň PMSS1 už skôr bolo preukázané, že nie sú schopné kolonizovať žalúdok myší Balb /c [29].
Konštrukcia isogenních GGT
mutantný kmene H. suis stroje a H. pylori
An isogenní H. suis GGT
mutantný kmeň (HS5cLPΔggt
) sa pripraví ako je opísané skôr [20]. Isogenní GGT
mutantný kmeň H. pylori
bola získaná s použitím rovnakej stratégie, ako pre tvorbu H. suis
isogenní GGT
mutant, okrem toho, že kazeta rezistencie ku kanamycínu bol použitý namiesto kazeta rezistencie voči chloramfenikolu [20]. Veľmi stručne, delécie GGT
v H. pylori
SS1 a PMSS1 bola zavedená výmenou alelickou použitie pBluescript II SK (+) fágomid vektora (Agilent Technologies, Kalifornia, USA), v ktorej ~ 440 bp 5 ' -konci a ~ 430 bp z 3 '-konci cieľového génu a kazeta rezistencie ku kanamycínu z plazmidu pKD4 [30] boli ligovány pomocou PCR sprostredkovanej stratégie s 2 cyklami inverznej PCR a fúzny PCR [20]. Všetky priméry použité pre PCR-sprostredkovanú konštrukcia rekombinantných plazmidov sú uvedené v tabuľke 1.
Výsledný plazmid bol amplifikovaný v XL1-Blue MRF 'E. coli
(Agilent Technologies) a používa sa ako samovražedný plazmidu v H . pylori
SS1 a PMSS1 (láskavý dar od Sara Linden a Anne Muller, v uvedenom poradí). H. pylori
SS1 GMT
mutant (SS1Δggt
) a H. pylori
PMSS1 GMT
mutant (PMSS1Δggt
) boli získané elektrotransformace [31] alebo prírodné transformácie [32 ], ako bolo popísané skôr. Napokon, baktérie boli vybrané na Columbia agarové doštičky (Oxoid, Basingstoke, UK) s Vitox doplnok (Oxoid), 5% (v /v) defibrinované ovčej krvi (E &Co. O Laboratories Ltd, Bonnybridge, UK) a kanamycín (25 ug /ml). Doštičky boli inkubované po dobu 5-9 dní. Isogenní GMT
mutanty boli overené testom GGT aktivity [19], PCR a nukleotidové sequencing.Table 1 Primery použité pre konštrukciu H. pylori GMT izogénnymi mutantných kmeňoch
Primer názov
Sequence (5'-3 ')
Primer použiť
pBlue lineárny FWD 1
GGGGATCCACTAGTTCTAGAGCG
linearizácia plazmidu
pBlue lineárny REV1
CGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAG
linearizace plasmid
HpGGT-flank_fusion1F
CTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGTAACCGGTAAAATCAACACGGACGC
Amplification H. pylori GMT stroje a čiastkové hore a následní sprievodných gény
HpGGT-flank_fusion1R
CGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCGCGCTCTTATAAAAAGAAGCCGC
Amplification H. pylori GMT stroje a čiastkové hore a následné sprievodné gény
pBluelinear_Hpggtflank1F
CCAAGGAAAGAATTTTAATCCTATTTAG
Linearizácia rekombinantného plazmidu
pBluelinear_Hpggtflank1R
CTGTTTTCCTTTCAATCAACAATAATC
Linearizácia rekombinantného plazmidu
Hpkana_fusion_1F
ATTATTGTTGATTGAAAGGAAAACAGATGATTGAACAAGATGGATTGC
Amplification kanamycín gén rezistencie
Hpkana_fusion_1R
CTAAATAGGATTAAAATTCTTTCCTTGGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG
rezistencie na kanamycín Amplification gén
T7 prom3
TAATACGACTCACTATAGGG
Sekvenovanie
M13R
CAGGAAACAGCTATGAC
Sekvenovanie
kultúry podmienok bakteriálnych kmeňov
divokého typu (WT) H. suis
kmeň HS5cLP bol kultivovaný počas 48 hodín, ako bolo opísané skôr [29]. HS5cLPΔggt
baktérie boli pestované za rovnakých podmienok ako kmeň HS5cLP, okrem toho, že kultivačné doštičky boli doplnené chloramfenikol (30 ug /ml), ako bolo opísané skôr [20].
WT H. pylori kmeňov
SS1 a PMSS1 boli pestované na Columbia agarové doštičky s obsahom 5% (v /v) defibrinované ovčej krvi po dobu 48-72 hodín pri teplote 37 ° C pod mikroaerobní podmienok, ako bolo opísané skôr [29]. Následne, kolónie boli odobraté a kultivované v Brucella bujóne s prídavkom Vitox (Oxoid) a 5% fetálneho teľacieho séra (Hyclone) na rotačnej trepačke za mikroaerobní podmienkach (16 hodín, 125 otáčok za minútu). SS1Δggt stroje a kmene PMSS1Δggt
boli kultivované za rovnakých podmienok ako zodpovedajúce WT kmeňov na miskách doplnené kanamycín (25 ug /ml).
Experimentálne dizajn
Po príchode šesťdesiat Balb /C myší a dvadsaťpäť mongolskej gerbils boli rozdelené do 5 skupín, a zvieratá bola ponechaná aklimatizovať na nové prostredie po dobu 1 týždňa. Zvieratá boli očkujú do žalúdka 3 krát po 48 h intervaloch. Zvieratá zo skupiny 1 a 2 (ako u myšou tak Mongolian Gerbil) sa naočkujú Brucella bujónu, ktorý obsahuje 8 x 10 7 životaschopných baktérií kmeňov HS5cLP a HS5cLPΔggt
, v danom poradí. Zvieratá v skupine 3 a 4 boli vrúbľovať Brucella bujóne obsahujúcim 3 x 10 8 životaschopných baktérií kmeňov RZ1 a SS1Δggt
(myší) alebo 1 × 10 9 životaschopných baktérií kmeňov PMSS1 a PMSS1Δggt
(pieskomily). Zvieratá v piatej skupine boli Inokulované Brucella bujónu a slúžil ako nenakazenými kontrolami. Pre myši, na dobu 4 týždňov, 9 týždňov a 6 mesiacov po infekcii (PI), 4 zvieratá z každej skupiny sa usmrtia cervikálny dislokáciou pod izofluranom anestézii. Na mongolských Gerbil, všetky zvieratá usmrtené v 9 týždňov pi. V žalúdky boli resekováno na ďalšie spracovanie, ako bolo opísané skôr [27,29].
Pokusy na zvieratách boli schválené etickou komisiou Fakulty veterinárneho lekárstva Univerzity v Gente, Belgicko (EC2013 /29).
histopatologické vyšetrenie a imunohistochémia (IHC)
tromi pozdĺžnymi prúžkami žalúdočné tkaniva od myší a mongolskej pieskomily boli vyrezané z pažeráka do dvanástnika pozdĺž veľkého zakrivenia. Tkanivo bola stanovená v 4% fosfátom pufrovanom formaldehydu, spracované štandardnými metódami a vložené do parafínu pre svetelnú mikroskopiu. boli narezané päť sériových úseky 5 um. Prvá časť sa zafarbia hematoxylín /eosínu (H &E), ktorý strelí stupeň gastritídy v závislosti na aktuálnom systéme Sydney s určitými modifikáciami [33]. Po Deparafinizace a rehydratáciu na zostávajúcich častiach, sprístupnenie antigénu tepelne indukovaná bola vykonaná v citrátovom pufri (pH = 6,0). Pre blokovanie reakcie endogénne peroxidázy a nešpecifické, všetky rezy boli inkubované s 3% H 2O 2 v metanole (5 min) a 30% kozieho séra (30 min), v danom poradí. Pre odlíšenie medzi T a B lymfocytov, CD3 a CD20 antigény boli zafarbené na úsekoch dva a tri, s použitím polyklonálne králičie protilátkou anti-CD3 (1/100, DakoCytomation, Glostrup, Dánsko) a polyklonálne králičie anti-CD20 protilátky (1 /25, Thermo Scientific, Fremont, USA), resp. Tieto oddiely boli ďalej spracované s Envision + System-HPR (DAB) (DakoCytomation) pre použitie s králičie primárnej protilátky. Na štvrtom a piatom úseku, proliferácie epiteliálnych buniek a počtu parietálnych buniek boli stanovené IHC farbenie, za použitia myší monoklonálne protilátky anti-Ki67 (1/25; MENARINI Diagnostics, Zaventem, Belgicko) a myšou monoklonálnou anti-vodík ATPázy draselný β-podjednotky (H + /K + ATPáza) protilátka (1/25 000; abca Ltd., Cambridge, Veľká Británia), v danom poradí. Následná vizualizácia bola vykonaná s Envision + System-HPR (DAB) (DakoCytomation) pre použitie s myšou primárnou protilátky. Kvantifikácia T-buniek, B-buniek a epitelových buniek boli vykonávané ako bolo opísané skôr [4]. V stručnosti, počet buniek, ktoré patria do definovaných bunkových populácií (T-bunky, B-bunky a epitelové bunky), boli stanovené spočítaním pozitívnych buniek v piatich náhodne zvolenom High Power poľa (zväčšenie: x 400), a to ako v dutine a corpus regiónu .
aby bolo možné posúdiť možný rozvoj pseudopyloric metaplázia vyvolanej Helicobacter infekciou,
alcian blue-periodickej kyseliny Schiffovho farbenia farbením (AB /PAS) bola vykonaná.
kvantifikácia kolonizovať baktérií v žalúdku myši a mongolskej pieskomily
Pásy žalúdočné tkanivo obsahujúce všetky regióny na myšiach a samostatných kusov (antra a corpus) pre mongolských Gerbil boli uložené v 0,5 ml RNAlater
roztoku (Ambion, Austin, TE, USA) pri teplote -70 ° C C až do RNA a DNA extrakcie. Kvantitatívne PCR v reálnom čase (QRT-PCR) bola použitá pre stanovenie počtu baktérií kolonizovať v žalúdočnej tkanive, ako bolo opísané skôr [29,34].
Extrakcia RNA a reverznej transkripcie
QRT-PCR bola použitá pre stanovenie génová expresia v žalúdočnej tkaniva myší a mongolských Gerbil. Celková RNA bola extrahovaná s použitím súpravy RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa inštrukcií výrobcu. Koncentrácia RNA bola meraná pomocou spektrofotometra Nanodrop (ISOGEN Life Science, PW De Meern, Utrecht, Holandsko). Čistota RNA bola hodnotená s automatizovaný systém pre elektroforézu Experion pomocou StdSens RNA čipy (Bio-Rad, Hercules CA, USA). Koncentrácia RNA zo všetkých vzoriek bola upravená na 1 ug /ul a cDNA bola syntetizovaná bezprostredne po čistení RNA za použitia iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad).
Design a validáciu primerov a stanovenie génovej expresie
tieto gény upratovacia H2afz, PPIA stroje a HPRT
boli zahrnuté ako referenčné gény pre myší [29]. Na mongolských Gerbil, sada referenčných génov, bola testovaná na základe skutočnosti, že sa vo veľkej miere používa v iných živočíšnych druhov. Primery boli navrhnuté na základe konzervatívnych oblastí ACTB, p-aktínu, GAPDH, RPS18
HPRT1
SDHA stroje a UBC
úplných alebo čiastočných kódujúcich sekvencií k dispozícii pre ľudí, ošípané, myší a potkanov.
úrovne expresie mRNA rôznych cytokínov (IFN-y, IL-4, IL-5, IL-17, IL-1β, IL-6, IL-10), predtým preukázané, že sú rozdielne exprimované v H. suis
infekcie, ako aj iných génov (Foxp3, CXCL13, ASCT2, ATP4a a ATP4b) boli kvantifikované za použitia SYBR Green RT-PCR s iQ ™ SYBR Green Supermix. Reakcie boli vykonané za použitia CFX96 RT PCR System v C1000 termocykléra (Bio-Rad), ako bolo opísané skôr [29]. Všetky reakcie boli vykonávané v objeme 12 ul, obsahujúci 0,05 ul každého priméru (1,25 pmol /ul), 6 ul iQ ™ SYBR Green Supermix, 3,9 ul HPLC vody a 2 ul cDNA. Experimentálne Program sa skladal z 95 ° C na 15 minút, nasledovalo 40 cyklov denaturácie pri 95 ° C počas 20 s, Annealing pri 60 ° C počas 30 sekúnd a predĺženie pri 72 ° C počas 30 s. Hodnoty prahové hodnoty cyklu (Ct) boli normalizované na geometrické priemery hodnôt referenčných génov a normalizovaných hladín mRNA zo všetkých cieľových génov boli vypočítané za použitia metódy 2 -ΔΔCt [35].
Vzhľadom k nedostupnosti gén informácie pre forkhead /okrídlené helix transkripčný faktor (Foxp3) a chemokiny CXC ligand 13 (CXCL13) z mongolských Gerbil, boli navrhnuté priméry na základe konzervatívnych oblastí Foxp3 a CXCL13 úplných alebo čiastočných kódujúcich sekvencií dostupných pre ľudí, ošípané, myši a potkany s rovnakou stratégiou, ako je popísané vyššie. Úrovne expresie mRNA Foxp3 a CXCL13 boli stanovené s použitím rovnakého spôsobu, ako je popísané vyššie. Informácie o sekvencii zo všetkých primérov pre myší a pre mongolskej pieskomily je uvedený v tabuľkách 2 a 3.Table 2 Zoznam génov a primérov použitých pre QRT-PCR v mongolských Gerbil
Gene
Primer

Sequence (5'-3 ')
Referencie
Foxp3
zmysel
GCCCCTMGTCATGGTGGCA
Táto štúdia
nezmyselné
CCGGGCCTTGAGGGAGAAGA
CXCL13
zmysel
GAATGGCTGCCCCAAAACTGAA
Táto štúdia
nezmyselné
TCACTGGAGCTTGGGGAGTTGAA
GAPDH
zmysel
AACGGGAAGCTCACTGGCATG
Táto štúdia
nezmyselné
CTGCTTCACCACCTTCTTGATGTCA
HPRT1
zmysel
GCCCCAAAATGGTTAAGGTTGCA
Táto štúdia
nezmyselné
TCAAGGGCATATCCAACAACAAAC
RPS18
zmysel
CGAGTACTCAACACCAACATCGATGG
Táto štúdia
nezmyselné
ATGTCTGCTTTCCTCAACACCACATG
IL-1β
zmysel
GGCAGGTGGTATCGCTCATC
[64]
antisencie
CACCTTGGATTTGACTTCTA
IFN-γ

zmysel
CCATGAACGCTACACACTGCATC
[65]
antisencie
GAAGTAGAAAGAGACAATCTGG
IL-5
zmysel
AGAGAAGTGTGGCGAGGAGAGACG
[27]
antisencie
ACAGGGCAATCCCTTCATCGG
IL-6
zmysel
GAGGTGAAGGATCCAGGTCA
[66]
antisencie
GAGGAATGTCCTCAGCTTGG
IL-10
zmysel
GGTTGCCAAGCCTTATCAGA
[27]
antisencie
GCTGCATTCTGAGGGTCTTC
IL-17
zmysel
AGCTCCAGAGGCCCTCGGAC
[64]
antisencie
AGGACCAGGATCTCTTGCTG
ATP4b
zmysel
GGGGGTAACCTTGAGACCTGATG
[27]
antisencie
AAGAAGTACCTTTCCGACGTGCAG
β-aktínu
zmysel
TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA
[66]
antisencie
CCAGACAGCACTGTGTTGGC
Tabuľka 3 Zoznam génov a primérov použitých pre QRT-PCR u myší
Gene
Primer
sekvenciu (5'-3 ')

Referencie
IL-1β
zmysel
GGGCCTCAA AGGAAAGAATC
[29]
antisencie
TACCAGTTGGGGAACTCTGC
IFN-γ

zmysel
GCGTCATTGAATCACACCTG
[29]
antisencie
TGAGCTCATTGAATGCTTGG
IL-4
zmysel
ACTCTTTCGGGCTTTTCGAT
[29]
antisencie
AAAAATTCATAAGTTAAAGCATGGTG
IL-10
zmysel
ATCGATTTCTCCCCTGTGAA
[29]
antisencie
CACACTGCAGGTGTTTTAGCTT
IL-17
zmysel
TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA
[29]
antisencie
CTTTCCCTCCGCATTGACAC
Foxp3
zmysel
GCCCCTMGTCATGGTGGCA
Táto štúdia
nezmyselné
CCGGGCCTTGAGGGAGAAGA
CXCL13

zmysel
CTCTCCAGGCCACGGTATT
[67]
antisencie
TAACCATTTGGCACGAGGAT
ATP4a
zmysel
TGCTGCTATCTGCCTCATTG
[68]
antisencie
GTGCTCTTGAACTCCTGGTAG
ATP4b
zmysel
AACAGAATTGTCAAGTTCCTC
[68]
antisencie
AGACTGAAGGTGCCATTG
HPRT
zmysel
CAGGCCAGACTTTGTTGGAT
[29]
antisencie
TTGCGCTCATCTTAGGCTTT
PPIA
zmysel
AGCATACAGGTCCTGGCATC
[29]
antisencie
TTCACCTTCCCAAAGACCAC
H2afz
zmysel
CGTATCACCCCTCGTCACTT
[29]
protismerné
TCAGCGATTTGTGGATGTGT
Štatistická analýza
Rozdiely v kolonizačnej schopnosti boli analyzované za použitia neparametrického Mann-Whitney U
test. Rozdiely v lymfocytárnej infiltrácie, expresie cytokínov a IHC analýzy boli hodnotené s jednosmerným ANOVA nasledovanej Bonferroniho post hoc test. Štatistické analýzy boli vykonané pomocou SPSS Statistics 20 softvér (IBM). Párové porovnanie bolo vykonané pre každý jednotlivý časový bod a na základe súhrnných údajov s využitím čas ako faktor stratifikácie. P
hodnoty menšie ako 0,05 boli považované za štatisticky významné. Všetky dáta sú vyjadrené ako priemer ± SD. Všetky údaje boli vytvorené pomocou GraphPad Prism5 softvéru (GraphPad software Inc., San Diego, CA, USA).
Výsledky
hustote kolonizačné
všetky kontrolné zvieratá boli negatívne na Helicobacter
. Výsledky nakazených zvierat ukázali, že WT H. suis
môže trvalo kolonizovať žalúdok myši s úrovňami kolonizačných tak vysoko, ako 5,42 × 10 4 (± 1,46 x 10 4) baktérie /mg žalúdočné tkaniva i pri 6 mesiaca pi (obrázok 1C). H. pylori kmeňa
SS1 bolo preukázané, že kolonizovať žalúdok myší za oveľa nižšiu bakteriálnej hustoty je 1,68 x 10 3 (± 1,73 x 10 3) baktérií /mg tkaniva na 6 mesiacov pi (obrázok 1C, p
menšie ako 0,05). Obrázok 1 Korelácia medzi bakteriálne kolonizáciu kapacitou a skóre zápalu v žalúdku myší a mongolských Gerbil. Kolonizácia kapacita je zobrazený ako log10 hodnôt H. suis
alebo H. pylori
na mg tkaniva, stanovuje s QRT-PCR v korpuse myší (A-C) a antra mongolských Gerbil (D). 0, bez infiltrácie mononukleárnych a /alebo polymorfonukleárne bunky; 1, veľmi mierne difúzny infiltrácie mononukleárnych a /alebo polymorfonukleárne bunky alebo prítomnosť jednej malej (20-50 bunky) agregátu zápalových buniek; 2, mierna difúzna infiltrácia mononukleárnych a /alebo polymorfonukleárne bunky alebo prítomnosť jednej malej (50-200 buniek) agregátu zápalových buniek; 3, stredná difúzna infiltrácia mononukleárnych a /alebo polymorfonukleárne bunky a /alebo prítomnosti zápalových 2-4 agregátov; 4, označené difúzna infiltráciu mononukleárnych a /alebo polymorfonukleárne bunky a /alebo prítomnosť aspoň piatich zápalových agregátov. HS vs. HSM: Kolonizácia: p Hotel > 0,05; Zápal: p Hotel < 0.05. SS1 vs. SS1m: Kolonizácia: p Hotel < 0,05; Zápal: p Hotel < 0.05. PMSS1 vs. PMSS1m: Kolonizácia: p Hotel > 0,05; Zápal: p Hotel < 0.05. HS: zvieratá nakazené WT H. suis
Šrain HS5cLP; HSM: živočíchov infikovaných H. suis
kmeň HS5cLPΔggt
; SS1: zvieratá nakazené WT H. pylori
SS1; SS1m: zvieratá nakazené H. pylori
SS1Δggt
; PMSS1: zvieratá nakazené WT H. pylori
PMSS1; PMSS1m: zvieratá nakazené H. pylori
PMSS1Δggt
Je zaujímavé, H. suis
kmeň HS5cLPΔggt
bol schopný kolonizovať korpus žalúdka myší v podobnom rozsahu ako EÚ. WT kmeň, a to bolo pozorované vo všetkých časových bodoch (obrázky 1A-1C). Na rozdiel od toho H. pylori kmeňa
SS1Δggt
bolo preukázané, že majú zhoršenú schopnosť kolonizácie u myší pri všetkých troch časových bodoch (obrázky 1A-1C, p
menšie ako 0,05). Podobné údaje kolonizácie bola preukázaná v dutine Helicobacter
infikovaných-myší vo všetkých troch časových bodoch (dáta nie sú uvedené).
Ako HS5cLP a HS5cLPΔggt
kmeň úspešne kolonizoval antra a korpus žalúdka mongolských Gerbil , aj keď kolonizácia sadzby boli oveľa nižšie v korpuse v porovnaní s dutine. Sme nezaznamenali štatisticky významné rozdiely medzi oboma kmeňmi (obr 1D, p Hotel > 0,05). H. pylori
kmeň PMSS1Δggt
bol schopný kolonizovať dutine a korpus žalúdka na podobných úrovniach v porovnaní s PMSS1 (obrázok 1D, p Hotel &0,05), hoci 2 z 5 mongolskej pískomily boli negatívne pre prítomnosť PMSS1Δggt
v korpuse žalúdku (dáta nie sú uvedené).
infekcia, zápal vyvolaný
Všetky kontrolné myši a pieskomily zistili normálne žalúdočnej histomorphology vo všetkých časových intervaloch. Korelácia medzi zápalu skóre a bakteriálnej kolonizácie je zobrazený na obrázku 1.
V porovnaní s myšou WT kmeň infekcie, infekcie H. suis
kmeň HS5cLPΔggt
všeobecne indukované významne menšie celkovú zápal a to ako v dutine (p Hotel < 0,01) a corpus (p Hotel < 0,01), zatiaľ čo iba v corpus regióne (p Hotel < 0,01), infekcie H. pylori
kmeňa SS1Δggt
vyvolaná menej zápal, v porovnaní s pozorovaným u WT myší kmeňa infikovaných. Po 6 mesiacoch pí, oblasť korpus na 2 zo 4 myší s infekciou HS5cLP obsahoval veľké lymfoidné agregáty alebo lymfoidné folikuly sprevádzané deštrukciou normálnej sliznice architektúry (obrázok 2A), ktorý nebol pozorovaný u zvierat, z iných skupín. Obrázok 2 H &E farbenie žalúdočné dielov z Helicobacter -infected myší a mongolských Gerbil. Reprezentatívne mikrofotografie H &E zafarbené rezy tu uvedené boli získané z myší orálne inokulovaných H. suis
HS5cLP (A), H. suis
HS5cLPΔggt
(B), H. pylori
SS1 ( C) a H. pylori
SS1Δggt
(D) po 6 mesiacoch po naočkovaní a mongolskej pieskomily orálne infikované H. suis
HS5cLP (E), H. suis
HS5cLPΔggt
(F ), H. pylori
PMSS1 (G) a H. pylori
PMSS1Δggt
(H) na 9 týždňov po inokulácii. Šípky ukazujú na prítomnosť zápalových buniek, zápalových agregátov, lymfocytárnej infiltrácie, alebo lymfatických folikulov. HS: zvieratá nakazené WT H. suis
kmeňa HS5cLP; HSM: živočíchov infikovaných H. suis
kmeň HS5cLPΔggt
; SS1: zvieratá nakazené WT H. pylori
SS1; SS1m: zvieratá nakazené H. pylori
SS1Δggt
; PMSS1: zvieratá nakazené WT H. pylori
PMSS1; PMSS1m: zvieratá nakazené H. pylori
PMSS1Δggt
; WT: divokého typu. Pôvodný zväčšenie :. 100 x Apartmán V mongolskej pieskomily, infekcie HS5cLP alebo PMSS1 vyvolanú ťažkou antra-dominantné gastritídu s tvorbou lymfatických agregátov v lamina propria a /alebo sub-sliznicu žalúdka (obr 1D, 2E a 2G ). Neboli žiadne významné rozdiely medzi WT a mutantný kmeň H. suis
vzhľadom na zápalové reakcie vyvolané u pieskomilov (obr 1D, 2E a 2F), aj keď všetky zvieratá nakazené kmeňom HS5cLP ukázala, zápal v oblasti corpus , zatiaľ čo to bolo len v prípade niektorých zvierat infikovaných HS5cLPΔggt
(dáta nie sú uvedené). V jednom Gerbil infikovaných H. suis
kmeň HS5cLP, bola pozorovaná výrazná zápalová reakcia, v ktorých viac ako 65% plochy v lamina propria a submukóze v dutine bola husto infiltrovaná zápalových buniek, tavený lymfoidné agregáty a . lymfatické folikuly (ďalší súbor 1)
zápal vyvolaný H. pylori
kmeňa PMSS1Δggt
v dutine z pieskomilov bolo menej závažné v porovnaní s pozorovaným u infikovaných zvierat WT (str Hotel < 0,05) . (obr 1D, 2G a 2H)
zápalové infiltráciu buniek
všeobecne platí, že zvýšenie počtu T-buniek bola pozorovaná v korpuse (obrázok 3A, s Hotel &0,05) u myší infikovaných H. suis
kmeň HS5cLP a H. pylori
kmeň SS1 vo všetkých troch časových bodoch. V porovnaní s myšou infikovaných H. WT suis
, HS5cLPΔggt
indukuje nižšiu odpoveď T-buniek v korpuse po 6 mesiacoch PI (p Hotel &0,01). H. pylori kmeňa
SS1Δggt
indukuje zníženú odpoveď T-buniek v corpus regióne (p Hotel &0,01) v porovnaní s infikovanými zvieratami WT, ako na 9 týždňov a 6 mesiacov pi (obrázok 3A). Podobné výsledky boli pozorované v dutine myší (dáta nie sú uvedené). Obrázok 3 Kvantitatívna analýza definovaných bunkových populácií s imunohistochemicky.

• Podanie trimetoprim-sulphadimidine nezlepší hojenie žľazovej žalúdočných vredov u koní užívajúcich omeprazol: randomizovanej, zaslepenej, klinické štúdie
• Snímacie elektrónové mikroskopia pozorovanie ježko žalúdka červa, Physaloptera Clausa (Spirurida: Physalopteridae)