Le rôle de γ-glutamyl-transpeptidase dans la pathogenèse des infections par Helicobacter suis et de Helicobacter pylori

Rôle de γ-glutamyl dans la pathogenèse de Helicobacter suis
et les infections de Helicobacter pylori
Résumé
Helicobacter
(H.
) Suís
peut coloniser l'estomac des porcs comme ainsi que les humains, provoquant une gastrite chronique et d'autres changements pathologiques gastriques, y compris l'ulcération gastrique et le tissu lymphoïde associé aux muqueuses (MALT) lymphome. Récemment, un facteur de virulence de H. suis
, γ-glutamyl transférase (GGT), il a été démontré à jouer un rôle important dans l'induction de la mort gastrique humaine de l'épithélium des cellules et la modulation de la prolifération des lymphocytes en fonction de la glutamine et de la glutathion catabolisme. Dans la présente étude, la pertinence de la GGT dans la pathogenèse de H. suis
infection a été étudiée chez la souris et les modèles de gerbille de Mongolie. En outre, l'importance relative de H. suis
GGT a été comparée à celle du GGT du H. pylori. Une contribution importante et différente de la GGT de H. suis
et H. pylori
a été vu en termes de colonisation bactérienne, l'inflammation et la réponse immunitaire évoquée. Contrairement à H. pylori
Δggt
souches, H.
Δggt Suis
souches étaient capables de coloniser l'estomac à des niveaux comparables à des souches WT, bien qu'ils induit beaucoup moins inflammation gastrique globale chez la souris. Ceci a été caractérisé par un nombre plus faible de cellules T et B, et un niveau inférieur de la prolifération des cellules épithéliales. En général, par rapport à WT infection par une souche, GGT
souches mutantes de H. suis
déclenché des niveaux inférieurs de Th1 et Th17 signature cytokine expression. Une surexpression prononcée de lymphocytes B chimiotactique CXCL13 a été observée, à la fois chez les animaux infectés par des souches mutantes
WT et GGT de H. suis
. Fait intéressant, H. suis
GGT a été montré pour affecter le métabolisme de la glutamine de l'épithélium gastrique par régulation négative de l'ASCT2 glutamine transporteur
. Présentation
(H. de
) de Helicobacter pylori est
une bactérie à Gram négatif qui colonise l'estomac de plus de la moitié de la population mondiale. L'infection par cette bactérie peut causer la gastrite, l'ulcère gastro-duodénal, l'adénocarcinome gastrique et le tissu lymphoïde associé aux muqueuses (MALT) lymphome [1-3]. Outre H. pylori
, non-H. pylori de les helicobacters (NHPh) ont également été détectés dans l'estomac de l'homme et ces bactéries provoquent des maladies gastriques similaires. Le risque de développer un lymphome gastrique du MALT est plus élevé lors de l'infection NHPh par rapport à l'infection par H. pylori
[4-9]. H. suis
est le NHPh gastrique la plus répandue chez les humains. Les porcs sont l'hôte naturel de cette bactérie, avec des prévalences atteignant 90% ou plus [10] et le plus probable, les porcs et peut-être aussi le porc sont les principales sources de H. humain suis
infection [4,11-13].
H. suis
infection semble persister pour la vie, au moins chez les porcs et les rongeurs utilisés comme modèles pour les infections humaines [14]. Chez le porc, l'infection provoque le développement d'une gastrite et d'une diminution du gain de poids corporel. De plus, la bactérie semble jouer un rôle dans le développement de l'ulcération de la pars non-glandulaires oesophagea [15]. Chez les souris et les modèles de gerbille de Mongolie de la maladie gastrique humaine, expérimentale H. suis
infection provoque une pathologie gastrique sévère [4,16,17], y compris la gastrite, la nécrose des cellules pariétales et le développement de lésions de lymphome comme MALT gastrique, ressemblant à la lésions observées chez H. suis
humains infectés par.
des études antérieures ont montré que cette bactérie manque un homologue pour plusieurs facteurs de virulence de H. pylori
, tels que les cytotoxine gènes associés
île de pathogénicité ( cag
PAI) et la cytotoxine vacuolante (VacA) [18]. Nous étions cependant, capable d'identifier la transpeptidase γ-glutamyl transférase (GGT) comme un important facteur de virulence de H. suis
. Cette enzyme a été décrite pour provoquer des lésions gastriques des cellules épithéliales [19] et la modulation de prolifération des lymphocytes [20] à travers l'interaction de l'enzyme avec deux de ses substrats, L-glutamine et le glutathion réduit, ce qui en fait le premier identifié et étudié H. virulence le déterminant de suis.
Le rôle de la GGT au cours de l'infection par H. pylori in vivo
a été étudiée chez la souris. conclusions contradictoires ont été établis en ce qui concerne l'importance de la GGT pour la colonisation. Certains groupes ont conclu que la GGT de H. pylori est nécessaire pour une infection persistante chez la souris [21], tandis que d'autres ont fait des conclusions contraires [22]. En outre, il existe des preuves que l'accumulation de Helicobacter de la GGT est un facteur de virulence essentiel impliqué dans l'évasion immunitaire et la tolérance immunitaire [23-25].
Actuellement, on ne sait pas si et comment H. suis
GGT influences le cours de H. suis
infection in vivo
. Le but de la présente étude était d'étendre nos précédentes in vitro
conclusions avec H. suis
GGT, et d'étudier le rôle de ce facteur de virulence dans la pathogenèse de H. Suís
infection in vivo
. Dans le même temps, nous avons cherché à comparer l'importance relative à celle de la GGT de H. pylori
. Les expériences en cours ont été réalisées chez des souris BALB /c et gerbilles de Mongolie consanguins, car il a été démontré en effet ces modèles animaux pour être des outils précieux pour étudier le rôle des espèces Helicobacter en pathologie gastrique. Typiquement, dans gerbilles de Mongolie, un développement plus rapide et sévère des lésions gastriques peut être observée par rapport à des souris [4,26,27].
Matériel et méthodes
animaux et les souches bactériennes
Sixty 4-semaine- vieux, souris (SPF) BALB /c femelles spécifiques exempts d'organismes pathogènes ont été achetés chez Harlan NL (Horst, Pays-Bas). Vingt-cinq 4 semaines d'âge, SPF gerbilles de Mongolie consanguines femelles (Crl: MON) ont été obtenus auprès de Charles River Laboratories (Lille, France)
Pour H. suis
infection chez les souris et les gerbilles de Mongolie, souche HS5cLP. a été utilisé. Cette souche a été isolée en 2008 à partir de l'estomac d'un porc à l'abattoir [28]. Pour l'infection expérimentale H. pylori chez des gerbilles de Mongolie, la souche PMSS1 [29] a été utilisé, puisque cette souche n'a pas d'antécédents de vivo
adaptation chez la souris, contrairement à la souche de souris adaptée SS1. Chez les souris BALB /c, H. pylori souche
SS1 [29] a été utilisé, puisque la souche PMSS1 a déjà été démontré ne pas être en mesure de coloniser l'estomac de souris BALB /c [29]
. Construction de isogénique GGT
souches mutantes de H. suis
et H. pylori
Un isogénique H. GGT suis
souche mutante (HS5cLPΔggt
) a été préparé comme décrit précédemment [20]. La GGT isogénique
souche mutante de H. pylori
a été obtenu en utilisant la même stratégie que pour la création de l'H.
isogénique suis GGT
mutant, sauf que une cassette de résistance à la kanamycine a été utilisé au lieu d'un la cassette de résistance au chloramphénicol [20]. Très brièvement, la suppression de la GGT
chez H. pylori
SS1 et PMSS1 a été introduit par échange allélique en utilisant pBluescript II SK (+) du vecteur phagemide (Agilent Technologies, Californie, USA) où ~ 440 pb de l'extrémité 5 ' -fin et ~ 430 pb de -fin 3 'du gène cible et la cassette de résistance à la kanamycine provenant du plasmide pKD4 [30] ont été liés grâce à une stratégie à médiation par PCR avec 2 cycles de PCR inverse et PCR de fusion [20]. Toutes les amorces utilisées pour la construction par PCR des plasmides recombinants sont présentés dans le tableau 1.
Le plasmide résultant a été amplifié dans XL1-Blue MRF 'E. coli
(Agilent Technologies) et utilisé comme un plasmide suicide dans H . pylori
SS1 et PMSS1 (un cadeau genre de Sara Lindén et Anne Muller, respectivement). Le H. pylori
SS1 GGT
mutant (SS1Δggt
) et H. pylori
PMSS1 GGT
mutant (PMSS1Δggt
) ont été obtenus par électrotransformation [31] ou la transformation naturelle [32 ] comme décrit précédemment. Enfin, les bactéries ont été sélectionnées sur gélose columbia plaques (Oxoid, Basingstoke, Royaume-Uni) avec Vitox supplément (Oxoid), 5% (v /v) de sang de mouton défibriné (E & O Laboratories Ltd, Bonnybridge, Royaume-Uni), et kanamycine (25 pg /mL). Les plaques ont été incubées pendant 5-9 jours. Les isogéniques
mutants GGT ont été vérifiés par un dosage de l'activité de la GGT [19], sequencing.Table PCR et nucléotides 1 Amorces utilisées pour la construction du H. pylori des souches mutantes isogéniques GGT
nom Primer
Sequence (5'-3 ')
Primer utiliser
pBlue linéaire Fwd 1
GGGGATCCACTAGTTCTAGAGCG de la linéarisation du plasmide
pBlue linéaire Rev1
CGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAG de la linéarisation des plasmid
HpGGT-flank_fusion1F
CTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGTAACCGGTAAAATCAACACGGACGC
Amplification H. pylori GGT
et les gènes flanquant en amont et en aval partielles
CGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCGCGCTCTTATAAAAAGAAGCCGC
Amplification H. HpGGT-flank_fusion1R pylori GGT
et les gènes en amont et en aval partielles flanquant
pBluelinear_Hpggtflank1F
CCAAGGAAAGAATTTTAATCCTATTTAG de la linéarisation du plasmide recombinant
pBluelinear_Hpggtflank1R
CTGTTTTCCTTTCAATCAACAATAATC
linéarisation du plasmide recombinant gène de résistance
Hpkana_fusion_1F
ATTATTGTTGATTGAAAGGAAAACAGATGATTGAACAAGATGGATTGC
Amplification kanamycine
Hpkana_fusion_1R
CTAAATAGGATTAAAATTCTTTCCTTGGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG
gène de résistance à la kanamycine Amplification
T7 prom3
TAATACGACTCACTATAGGG
séquençage
M13R
CAGGAAACAGCTATGAC
séquençage
conditions de culture de souches bactériennes
de type sauvage (WT) H. suis la souche a été cultivée HS5cLP pendant 48 heures comme décrit précédemment [29]. Les bactéries ont été cultivées de HS5cLPΔggt dans les mêmes conditions que la souche HS5cLP, sauf que les plaques de culture ont été complétées avec du chloramphenicol (30 ug /ml) comme décrit précédemment [20].
WT H.pylori
souches SS1 et PMSS1 ont été cultivées sur des plaques de gélose Columbia contenant 5% (v /v) de sang de mouton défibriné pendant 48-72 h à 37 ° C dans des conditions micro-aérobies comme décrit précédemment [29]. Par la suite, les colonies ont été prélevées et cultivées dans du bouillon Brucella complété avec Vitox (Oxoid) et 5% de sérum de veau foetal (Hyclone) sur un agitateur rotatif dans des conditions microaérobies (16 h, 125 tpm). SS1Δggt
et les souches PMSS1Δggt de ont été cultivées dans les mêmes conditions que les souches correspondantes WT sur des plaques complétées avec de la kanamycine (25 pg /mL). Conception
expérimentale de
À l'arrivée, les souris soixante BALB /C et vingt-cinq gerbilles de Mongolie ont été divisés en 5 groupes, et les animaux ont été autorisés à s'acclimater au nouvel environnement pendant 1 semaine. Les animaux ont été inoculés par voie intragastrique 3 fois à 48 heures d'intervalle. Les animaux du groupe 1 et 2 (les souris et les gerbilles de Mongolie) ont été inoculés avec du bouillon Brucella contenant 8 x 10 7 bactéries viables de souches HS5cLP et HS5cLPΔggt
, respectivement. Les animaux du groupe 3 et 4 ont été inoculés avec du bouillon Brucella contenant 3 x 10 8 bactéries viables de (la souris) de souches SS1 et SS1Δggt ou 1 x 10 9 bactéries viables de souches PMSS1 et PMSS1Δggt
(gerbilles). Les animaux dans le cinquième groupe ont été inoculés avec du bouillon Brucella et servaient de témoins non infectés. Pour les souris, à 4 semaines, 9 semaines et 6 mois après l'infection (pi), 4 animaux de chaque groupe ont été euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie isoflurane. Pour gerbilles de Mongolie, tous les animaux ont été sacrifiés à 9 semaines pi. Les estomacs des animaux ont été réséquées pour un traitement ultérieur comme décrit précédemment [27,29].
Expériences sur les animaux ont été approuvés par le comité d'éthique de la Faculté de médecine vétérinaire, Université de Gand, Belgique (EC2013 /29).
l'examen histopathologique et immunohistochimie (IHC)
Trois bandes longitudinales de tissu gastrique de souris et gerbilles de Mongolie ont été coupées de l'oesophage au duodénum le long de la grande courbure. Le tissu a été fixé dans 4% de phosphate tamponnée formaldéhyde, traitées par des méthodes standard et inclus dans la paraffine pour la microscopie optique. Cinq sections série de 5 um ont été coupées. La première section a été colorée avec de l'hématoxyline /éosine (H & E) pour marquer le degré de gastrite selon le Système de Sydney Mise à jour avec quelques modifications [33]. Après déparaffinage et réhydratation pour les sections restantes, la récupération de l'antigène induite par la chaleur a été réalisée dans un tampon citrate (pH = 6,0). Afin de bloquer les réactions de l'activité de peroxydase endogène et non spécifiques, toutes les lames ont été mises en incubation avec 3% de H 2 O 2 dans du methanol (5 min) et du sérum de chèvre à 30% (30 min), respectivement. Pour la différenciation entre les lymphocytes T et B, les antigènes CD3 et CD20 ont été colorées sur les sections deux et trois, en utilisant un anticorps polyclonal de lapin anti-CD3 (1/100; DakoCytomation, Glostrup, Danemark) et un anticorps polyclonal de lapin anti-CD20 (1 /25; Thermo Scientific, Fremont, États-Unis), respectivement. Ces sections ont été traitées ultérieurement avec Envision + System-HPR (DAB) (DakoCytomation) pour une utilisation avec des anticorps primaires de lapin. Sur la quatrième et la cinquième section, la prolifération des cellules épithéliales et le nombre de cellules pariétales ont été déterminées par coloration IHC, en utilisant un anticorps monoclonal de souris anti-Ki67 (25/01; Menarini Diagnostics, Zaventem, Belgique) et d'anticorps monoclonal de souris anti-hydrogène ATPase de potassium β-unité (H + /K + ATPase) anticorps (1/25 000; Abcam Ltd, Cambridge, Royaume-Uni), respectivement. visualisation ultérieure a été effectuée avec Envision System-+ HPR (DAB) (DakoCytomation) pour une utilisation avec des anticorps primaires de souris. La quantification des cellules T, les cellules B et les cellules épithéliales ont été effectuées comme décrit précédemment [4]. En bref, le nombre de cellules appartenant à des populations cellulaires définies (lymphocytes T, les lymphocytes B et les cellules épithéliales) ont été déterminées en comptant les cellules positives dans les cinq choisis au hasard à haute champs d'énergie (grossissement x 400), tant dans la région antrale et corpus .
afin d'évaluer le développement possible de la métaplasie pseudopyloric induite par Helicobacter de l'infection, bleu alcian-acide périodique schiff tache coloration (AB /PAS) a été réalisée
. Quantification des bactéries colonisant dans l'estomac souris et mongoles gerbilles
bandes de tissu gastrique contenant toutes les régions pour les souris et les morceaux séparés (antre et corpus) pour gerbilles de Mongolie ont été stockés dans une solution de 0,5 mL RNAlater (Ambion, Austin, TE, États-Unis) à -70 ° C jusqu'à ce que l'ARN et l'ADN extrait. Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) a été utilisé pour déterminer le nombre de bactéries colonisant dans le tissu gastrique comme décrit précédemment [29,34].
Extraction de l'ARN et la transcription
qRT-PCR inverse a été utilisée pour déterminer l'expression du gène dans le tissu gastrique des souris et gerbille de Mongolie. L'ARN total a été extrait en utilisant le mini kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon les instructions du fabricant. La concentration d'ARN a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop (Isogen Life Science, PW De Meern, Utrecht, Pays-Bas). La pureté de l'ARN a été évaluée avec le système d'électrophorèse automatisé Experion utilisant des puces StdSens ARN (Bio-Rad, Hercules CA, USA). La concentration d'ARN à partir de tous les échantillons a été ajusté à 1 ug /ul et l'ADNc a été synthétisé immédiatement après la purification de l'ARN en utilisant le kit de synthèse d'ADNc iScript ™ (Bio-Rad).
Conception et validation d'amorces et la détermination de l'expression du gène
Les gènes de ménage H2afz, PPIA
et HPRT
ont été inclus en tant que gènes de référence pour la souris [29]. Pour les gerbilles de Mongolie, un ensemble de gènes de référence a été testé sur la base du fait qu'ils sont largement utilisés dans d'autres espèces animales. Les amorces ont été conçues sur la base des régions conservées de ACTB, β-actine, RPS18
, GAPDH
, HPRT1
, SDHA
et UBC
séquences complètes ou partielles de codage disponibles pour les humains, les porcs, les souris et les rats.
Le taux de diverses cytokines (IFN-y-, l'IL-4, IL-5, IL-17, IL-1β, IL-6, IL-10) l'expression de l'ARNm, précédemment montré pour être exprimé de manière différentielle pendant H. suis
infection, ainsi que d'autres gènes (Foxp3, CXCL13, ASCT2, ATP4a et ATP4b) ont été quantifiés par RT-PCR à base de SYBR Green avec iQ ™ SYBR Green Supermix. Les réactions ont été réalisées en utilisant un système de PCR RT CFX96 dans un cycleur thermique C1000 (Bio-Rad) tel que décrit précédemment [29]. Toutes les réactions ont été effectuées dans 12 volumes uL contenant 0,05 pi de chaque amorce (1,25 pmol /ul), 6 pi iQ ™ SYBR Green Supermix, 3,9 pi HPLC eau et 2 ul d'ADNc. Le programme expérimental se composait de 95 ° C pendant 15 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 20 s, annelage à 60 ° C pendant 30 s et extension à 72 ° C pendant 30 s. Les valeurs du cycle seuil (CT) ont été normalisés à la moyenne géométrique des gènes de référence et les taux d'ARNm normalisé de tous les gènes cibles ont été calculées en utilisant la méthode de 2 -ΔΔCt [35].
En raison de l'absence de l'information génétique pour Forkhead /ailée facteur hélice de transcription (Foxp3) et la chimiokine CXC ligand 13 (CXCL13) de gerbilles de Mongolie, des amorces ont été conçues sur la base des régions conservées de Foxp3 et CXCL13 séquences complètes ou partielles de codage disponibles pour les humains, les porcs, les souris et les rats avec la même stratégie que celle décrite ci-dessus. Les niveaux de Foxp3 et CXCL13 d'expression d'ARNm ont été déterminés en utilisant le même procédé que celui décrit ci-dessus. L'information de séquence de toutes les amorces pour les souris et pour gerbilles de Mongolie est présenté dans les tableaux 2 et 3.Table 2 Liste des gènes et des amorces utilisées pour qRT-PCR dans gerbilles de Mongolie
Gene
Primer

séquence (5'-3 ')
Références
Foxp3
sens
GCCCCTMGTCATGGTGGCA
Cette étude
antisens
CCGGGCCTTGAGGGAGAAGA
CXCL13
sens
GAATGGCTGCCCCAAAACTGAA
Cette étude
antisens
TCACTGGAGCTTGGGGAGTTGAA
GAPDH
sens
AACGGGAAGCTCACTGGCATG
Cette étude
antisens
CTGCTTCACCACCTTCTTGATGTCA
HPRT1
sens
GCCCCAAAATGGTTAAGGTTGCA
Cette étude
antisens
TCAAGGGCATATCCAACAACAAAC
RPS18
sens
CGAGTACTCAACACCAACATCGATGG
Cette étude
antisens
ATGTCTGCTTTCCTCAACACCACATG
IL-1β
sens
GGCAGGTGGTATCGCTCATC
[64]
antisens
CACCTTGGATTTGACTTCTA
IFN-γ

sens
CCATGAACGCTACACACTGCATC
[65]
antisens
GAAGTAGAAAGAGACAATCTGG
IL-5
sens
AGAGAAGTGTGGCGAGGAGAGACG
[27]
antisens
ACAGGGCAATCCCTTCATCGG
IL-6
sens
GAGGTGAAGGATCCAGGTCA
[66]
antisens
GAGGAATGTCCTCAGCTTGG
IL-10
sens
[27]
antisens
GCTGCATTCTGAGGGTCTTC
IL-17
sens de GGTTGCCAAGCCTTATCAGA
AGCTCCAGAGGCCCTCGGAC
[64]
antisens
AGGACCAGGATCTCTTGCTG
de ATP4b
sens
GGGGGTAACCTTGAGACCTGATG
[27]
antisens
AAGAAGTACCTTTCCGACGTGCAG
β-actine
sens
TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA
[66]
antisens
CCAGACAGCACTGTGTTGGC
Tableau 3 Liste des gènes et des amorces utilisées pour qRT-PCR Gene
Primer
la séquence de souris (5'-3 ')

Références
IL-1β
sens
GGGCCTCAA AGGAAAGAATC
[29]
antisens
TACCAGTTGGGGAACTCTGC
IFN-γ

sens
GCGTCATTGAATCACACCTG
[29]
antisens
TGAGCTCATTGAATGCTTGG
IL-4
sens
ACTCTTTCGGGCTTTTCGAT
[29]
antisens
IL-10
sens de AAAAATTCATAAGTTAAAGCATGGTG
ATCGATTTCTCCCCTGTGAA
[29]
antisens
CACACTGCAGGTGTTTTAGCTT
IL-17
sens
TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA
[29]
antisens
CTTTCCCTCCGCATTGACAC
Foxp3
sens
GCCCCTMGTCATGGTGGCA
Cette étude
antisens
CCGGGCCTTGAGGGAGAAGA
CXCL13

sens
CTCTCCAGGCCACGGTATT
[67]
antisens
TAACCATTTGGCACGAGGAT
ATP4a
sens
TGCTGCTATCTGCCTCATTG
[68]
antisens
GTGCTCTTGAACTCCTGGTAG
ATP4b
sens
AACAGAATTGTCAAGTTCCTC
[68]
antisens
AGACTGAAGGTGCCATTG
HPRT
sens
CAGGCCAGACTTTGTTGGAT
[29]
antisens
TTGCGCTCATCTTAGGCTTT
PPIA
sens
AGCATACAGGTCCTGGCATC
[29]
antisens
TTCACCTTCCCAAAGACCAC
H2afz
sens
CGTATCACCCCTCGTCACTT
[29]
antisens
TCAGCGATTTGTGGATGTGT
Différences
analyse statistique de la capacité de colonisation ont été analysées à l'aide d'un test
Mann-Whitney U non paramétrique. Les différences dans l'infiltration lymphocytaire, l'expression des cytokines et de l'analyse IHC ont été évalués par un ANOVA suivi d'un test de Bonferroni post hoc. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de SPSS Statistics 20 logiciels (IBM). comparaisons par paires sages ont été faites pour chaque point de temps individuel et sur les données mises en commun en utilisant le temps comme facteur de stratification. P
valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Toutes les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. Tous les chiffres ont été créés à l'aide du logiciel GraphPad Prism5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)
. Résultats
densité de Colonisation
Tous les animaux de contrôle étaient négatifs pour Helicobacter
. Résultats des animaux infectés ont montré que WT H.
suis peut constamment coloniser l'estomac de la souris avec des niveaux aussi élevés que la colonisation 5,42 × 10 4 (± 1,46 × 10 4) bactéries /tissu gastrique mg même à 6 mois pi (figure 1C). la souche de H. pylori SS1 a été montré pour coloniser l'estomac de la souris à une densité bactérienne beaucoup plus faible, étant 1,68 × 10 3 (± 1,73 × 10 3) bactéries /mg de tissu à 6 mois pi (Figure 1C, p
< 0,05). Figure 1 Corrélation entre la capacité de colonisation bactérienne et le score de l'inflammation dans l'estomac de souris et gerbilles de Mongolie. La capacité de colonisation est montré comme log10 valeurs de H.
suis ou H. pylori
par mg de tissu, déterminée par qRT-PCR dans le corpus de souris (A-C) et antrum des gerbilles de Mongolie (D). 0, aucune infiltration de mononucléaires et /ou polynucléaires; 1, l'infiltration diffuse très doux avec mononucléaires et /ou polynucléaires ou la présence d'une petite (20-50 cellules) agrégat de cellules inflammatoires; 2, avec une infiltration diffuse légère mononucléaires et /ou polynucléaires ou la présence d'une petite taille (50-200 cellules) agrégat de cellules inflammatoires; 3, une infiltration diffuse modérée avec mononucléaires et /ou polynucléaires et /ou la présence d'agrégats 2-4 inflammatoires; 4, marqué avec une infiltration diffuse mononucléaires et /ou polynucléaires et /ou la présence d'au moins cinq agrégats inflammatoires. HS vs HSm: Colonization: p
> 0,05; Inflammation: p
< 0,05. SS1 vs. SS1m: Colonization: p
< 0,05; Inflammation: p
< 0,05. PMSS1 vs. PMSS1m: Colonization: p
> 0,05; Inflammation: p
< 0,05. HS: animaux infectés par H. WT suis
Teinture HS5cLP; HSm: animaux infectés par H. suis
souche HS5cLPΔggt
; SS1: les animaux infectés par WT H. pylori
SS1; SS1m: animaux infectés par H. pylori
SS1Δggt
; PMSS1: les animaux infectés par WT H. pylori
PMSS1; PMSS1m: animaux infectés par H. pylori
PMSS1Δggt
intéressant, H. suis
souche HS5cLPΔggt
a pu coloniser le corps de l'estomac des souris dans une mesure similaire à celle du. souche WT, et cela a été observé pour tous les timepoints (figures 1A-1C). En revanche, H. pylori
souche SS1Δggt
a été montré pour avoir une capacité de colonisation avec facultés affaiblies chez les souris à trois timepoints (Figures 1A-1C, p
< 0,05). Des données similaires de colonisation ont été démontrées dans l'antre de Helicobacter-souris infectées à tous les trois timepoints (données non présentées).
Tant le HS5cLP et HS5cLPΔggt la souche colonisées avec succès l'antre et du corps de l'estomac des gerbilles de Mongolie , bien que les taux de colonisation étaient beaucoup plus faibles dans le corpus par rapport à l'antre. Aucune différence statistiquement significative n'a été observée entre les deux souches (figure 1D, p
> 0,05). souche PMSS1Δggt de
H. pylori était capable de coloniser l'antre et du corps de l'estomac à des niveaux similaires par rapport à PMSS1 (figure 1D, p
> 0,05), bien que 2 sur 5 gerbilles de Mongolie ont été négatifs pour la présence de PMSS1Δggt
dans le corps de l'estomac (données non présentées).
l'inflammation induite par l'infection
toutes les souris témoins et les gerbilles ont montré histomorphologie gastrique normale à tous les timepoints. La corrélation entre les scores d'inflammation et la colonisation bactérienne est affichée dans la figure 1.
Comparativement aux souris avec WT infection par une souche, l'infection par H.
suis souche HS5cLPΔggt
généralement induit une inflammation générale beaucoup moins à la fois dans l'antre (p
< 0,01) et le corps (p
< 0,01), alors que dans la région de corpus (p
< 0,01), l'infection par H. pylori souche
SS1Δggt
induit moins l'inflammation, par rapport à celle observée chez les souris infectées par la souche WT. Au bout de 6 mois pi, la région de corps chez les souris 2 sur 4 ayant une infection HS5cLP contenait de grands agrégats lymphoïdes ou des follicules lymphoïdes accompagnée d'une destruction de l'architecture de la muqueuse normale (figure 2A), ce qui n'a pas été observé chez les animaux des autres groupes. Figure 2 H & E coloration des sections de l'estomac de souris Helicobacter infectés par et gerbilles de Mongolie. micrographies représentatifs de H & E sections colorées présentées ici ont été prélevés sur les souris inoculées par voie orale avec H. HS5cLP suis
(A), H. suis
HS5cLPΔggt
(B), H. pylori
SS1 ( C) et H. pylori
SS1Δggt
(D) à 6 mois après l'inoculation et mongole gerbilles contestées par voie orale avec H. HS5cLP suis
(E), H. suis
HS5cLPΔggt
(F ), H. pylori
PMSS1 (G) et H. pylori
PMSS1Δggt
(H) à 9 semaines après l'inoculation. Les flèches indiquent la présence de cellules inflammatoires, des agrégats inflammatoires, des infiltrations lymphocytaires ou des follicules lymphoïdes. HS: animaux infectés par H. WT suis
souche HS5cLP; HSm: animaux infectés par H. suis
souche HS5cLPΔggt
; SS1: les animaux infectés par WT H. pylori
SS1; SS1m: animaux infectés par H. pylori
SS1Δggt
; PMSS1: les animaux infectés par WT H. pylori
PMSS1; PMSS1m: animaux infectés par H. pylori
PMSS1Δggt
; WT: type sauvage. grossissement d'origine:. 100 ×
Pour gerbilles de Mongolie, l'infection par HS5cLP ou PMSS1 induite grave gastrite antrale-dominante avec formation d'agrégats lymphocytaires dans la lamina propria et /ou sous-muqueuse de l'estomac (figures 1D, 2F et 2G ). Aucune différence significative n'a été observée entre le WT et souche mutante de H.
suis par rapport à la réponse inflammatoire induite dans les gerbilles (figures 1D, 2E et 2 F), bien que tous les animaux infectés avec la souche HS5cLP ont montré une inflammation dans la région de corpus , alors que ce ne fut le cas pour certains animaux infectés par HS5cLPΔggt
(données non présentées). Dans une gerbilles infectés par H. suis
souche HS5cLP, une réponse inflammatoire marquée a été observée dans plus de 65% de la superficie dans la lamina propria et la sous-muqueuse antrale a été fortement infiltrée par des cellules inflammatoires, des agrégats fusionnés lymphoïdes et . follicules lymphoïdes (fichiers supplémentaires 1)
inflammation induite par H. pylori
souche PMSS1Δggt
dans l'antre de gerbilles était moins sévère par rapport à celle observée chez les animaux infectés WT (p
< 0,05) . (figures 1D, 2G et 2H)
infiltration de cellules inflammatoires
en général, on a observé une augmentation du nombre de cellules T dans le corpus (figure 3A, p
< 0,05) de souris infectées par H. suis la souche HS5cLP et la souche de H. pylori SS1 à tous les trois timepoints. Par rapport aux souris infectées par WT H.
suis, HS5cLPΔggt
induit une réponse plus faible des lymphocytes T dans le corpus à 6 mois pi (p
< 0,01). H. pylori
souche SS1Δggt
induit une réponse cellulaire T réduite dans la région de corpus (p
< 0,01) par rapport à des animaux infectés WT, aux deux 9 semaines et 6 mois pi (figure 3A). Des résultats similaires ont été observés dans l'antre de souris (données non présentées). Figure 3 Analyse quantitative des populations de cellules définies par immunohistochimie.

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