Den roll som CCL22-CCR4 axeln i metastas av gastriska cancerceller i omental mjölkaktiga fläckar

Den roll som CCL22-CCR4 axeln i metastas av gastriska cancerceller i omental mjölkaktiga fläckar Bild Sammanfattning
Bakgrund
omentum är en av de första platserna för peritoneal metastas eftersom den har mjölkaktiga fläckar som ger en mikromiljö för cancerceller att lätt migrera och växa till mikrometastaser. Denna studie undersökte den roll som CCL22-CCR4 axeln i gastric cancerceller selektivt infiltrerar i mjölkaktiga fläckar.
Metoder
magcancer MFC celler märkta med Dil injicerades intraperitonealt i stam 615 möss. Mössen avlivades vid angivna intervall och omentum skars för immunohistokemi. Effekterna av CCL22 på spridningen och migreringen av MFC bedömdes av MTT och trans-brunns analyser. RT-PCR och Western blot-analys detekterades CCR4 mRNA och proteinexpressionsnivåer i MFC. Immunohistokemi användes för att analysera CCL22 och CCR4-expression i de mjölkaktiga spotmikrometastaser.
Resultat
Två veckor efter intraperitoneal injektion, var de mjölkaktiga fläckområden helt upptagen av prolifererande gastriska cancerceller och cellkluster-typ mikrometastaser observerades. I kontrast, cancerceller bildade enkelcell-typ mikrometastaser i de icke-mjölkaktiga fläckområden. MFC uttryckt CCR4, som var lokaliserad på cellytan och eller i cytoplasman. Olika koncentrationer av CCL22 ökat markant spridningen förmåga MFC. Dessutom, koncentrationer av CCL22 mellan 10-100 ng /ml signifikant ökad migration av MFC. Inom omental mjölkaktiga fläckar, var CCL22 lokaliserad huvudsakligen på cellytan och eller i cytoplasman. Inom delar av omental milky plats mikrometastaser var CCR4 redovisas eller gastric cancerceller, ingående celler milky fläckar, blodkroppar och blod endotelceller.
Slutsatser
omental mjölkaktiga fläckar är ett trivsamt mikro för peritoneala fria gastric cancerceller att migrera, överleva och etablera cellkluster typ metastaser. Den CCL22-CCR4 axeln bidrar till denna selektiva infiltration process.
Nyckelord
Magcancer omental mjölkig plats Peritoneal metastaser CCL22 CCR4 Inledning
Peritoneal metastaser är ett vanligt mönster av fjärrmetastaser i magcancer. Ett flertal studier har bekräftat att prognosen för gastric cancerpatienter med peritoneal metastas är dålig, även i de patienter som behandlats med radikal kirurgi [1]. Peritoneal metastaser utvecklas från mikrometastaser som härrör från fria peritoneal cancerceller [2]. Därför är det viktigt att förstå de egenskaper och mekanismer som är inblandade i bildandet av peritoneala mikrometastaser. En sådan förståelse kommer att hjälpa att förebygga och återkommande peritoneala metastaser, vilket förbättrar prognosen för patienter med ventrikelcancer.
mjölkaktiga fläckar är primitiva lymfvävnader i bukhålan hos människor och djur, som förekommer främst i större omentum. Däremot är relativt få mjölkaktiga fläckar som finns i mesenteriet och bäckenbotten, och inga mjölkaktiga fläckar återfinns i andra delar av peritoneum [3]. Mjölkaktiga fläckar innefattar ett flertal makrofager och lymfocyt samlingar och är involverade i clearance av partiklar, bakterier och tumörceller från bukhålan, spelar en viktig roll i peritoneal försvar [4] - [6]. Framför allt var omental makrofager visade sig vara cytotoxiska mot tumörceller [7], [8]. Vissa studier har visat att omental mjölkaktiga fläckar är välkända platser av metastaser av karcinom i äggstockarna, magen och kolon [9]. Cancerceller selektivt nästla sig in i mjölkaktiga fläckar i de tidiga stadierna av peritoneal cancer spridning och lokalisera en mikro där de har möjlighet att överleva, växa och bilda fasta metastaser [10]. Denna förmånliga fastsättning kan förklaras av att det finns vissa särdrag mjölkaktiga fläckar, inklusive högre nivåer av cellulära adhesionsmolekyler och tillväxtstimulerande faktorer [11], [12]. Därför, medan mjölkaktiga fläckar har cytotoxiska egenskaper mot tumörceller och spelar en viktig roll i peritoneal försvar, de ger också platser där tumörcellproliferation och mikrometastas inträffa.
Kemokiner är små utsöndrade proteiner som klassificeras in i de fyra underfamiljer baserat på sekvensen för konserverade N-terminala cysteinrester: CXC, CC, C, och CX3C [13], [14]. Många studier har visat att kemokiner och kemokinreceptorer är kausalt involverade i metastas av cancer [15] - [21]. Makrofagen härledda kemokin MDC /CCL22 är en av de CC-kemokinerna som produceras av makrofager och CCR4 identifierades som dess specifika receptor [17] - [21], vilket också är den funktionella receptom för andra CC-kemokiner. Uttrycket av kemokinreceptorer är känd för att vara förknippad med cancer metastaser, såsom CXCR4, CCR7 och CCR10 i bröstcancer [16] och CXCR5, CCR6, CCR7 och CCR4 i pankreas, mag- och prostatacancer [22], [23] . Vissa studier visade slutgiltigt att CXCR4 och CXCL12 spelar en viktig roll vid metastas av gastriska cancerceller in i peritonealhålan [23] - [25]
omental mjölkaktiga fläckar innefatta många makrofager, men rollen av MDC /CCL22-. CCR4 axel i gastric cancerceller selektivt infiltrerar i mjölkaktiga fläckar har ännu inte identifierats. Vi undersökte därför uttrycket av MDC /CCL22 och CCR4 i milky plats mikrometastaser, med syfte att upprätta en ny behandlingsmetod för att förhindra peritoneal metastas genom att fokusera på kemotaxi av gastric cancerceller.
Material och metoder
Tumörcells line och djur
murina magcancer MFC, som härrör från stammen 615 murina cancer i den proximala magen, erhölls från den centrala laboratorium Frist Anslutna sjukhuset i Dalian Medical University. MFC odlades i RPMI-1640 (Gibco) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Sigma) i en inkubator med 5% CO 2 vid 37 ° C. När sammanflytande cellerna trypsiniserades och sköljdes i D-Hanks media. En livskraftig cellräkning utfördes med hjälp av trypan blå utslagning.
Sex veckor gamla stammen 615 möss erhölls från Dalian Medical University i Kina. Mössen hölls under standardlaboratoriebetingelser och hade fri tillgång till standardlaboratorie mat och vatten. Studieprotokoll godkändes av kommittén för djurförsök i Dalian Medical University of Kina i enlighet med nationella riktlinjer (Tillståndsnummer: SYXK2008-0002). Alla åtgärder har vidtagits för att minimera någon smärta eller obehag.
Svepelektronmikroskopi
omental prover samlades in, fast över natten med 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M PIPES buffert (pH 6,9), tvättades tre gånger i färska Pipes buffert (pH 6,9), och efterfixerades i 1,5 h i 1% osmiumtetroxid i 0,1 M PIPES-buffert (pH 6,9). Proven tvättades i dH 2O tre gånger och dehydratiserades sedan i ökande koncentrationer av etanol (50, 70, 90 och 100%). Prover var kritisk punkt torkades ur flytande koldioxid, belagt till en tjocklek av 3 nm med en osmium plasmabeläggningsanordning, och observerades med ett Hitachi S-520 svepelektronmikroskop.
Transmissionselektronmikroskopi
Sex omental fettbanden erhållna från tre 615 möss av varje kön användes. Banden nedsänktes i en fixeringslösning innehållande 2% glutaraldehyd under 2 timmar, varefter efter fixerade i en lösning innehållande 2% osmiumtetroxid och 1,5% sackaros i en 0,05 M fosfatbuffert under 2 timmar vid 4 ° C. Proverna dehydratiserades i en graderad serie av etanol. Efter att ersätta aceton för etanol, proverna inbäddade i epoxiharts block. Ultratunna sektioner färgades med uranylacetat och blycitrat och observerades med ett transmissionselektronmikroskop (JEM-2000EX).
Tumörcells fastsättning till omentum sälja The MFC celler inkuberades i fullständigt RPMI-1640 vid en koncentration av 2 mg /L Dil (Sigma) under 60 min vid 37 ° C. Cellerna tvättades tre gånger med Hanks balanserade saltlösning. Den cellmärkningshastigheten var 100% och en × 10 4 celler injicerades intraperitonealt. Mössen avlivades vid 4, 12, 36, 48, 72 och 120 timmar, och 7, 10, och 14 dagar efter intraperitoneal injektion. Omentum exciderades och sträcks på objektglas för vidare bearbetning.
HE och immunhistokemisk färgning
omental Prover uppsamlades, fixerades i en 4% formaldehydlösning (pH 7,4) vid 4 ° C under 24 timmar, sköljdes tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,4) under 3 timmar, dehydratiserades i en graderad serie av etanol och inbäddades i paraffin. Därefter tillsattes 5 pm tjocka konsekutiva sektioner behandlas för HE och immunofärgning genom deparaffinisation med xylen och vätskeersättning med graderad etanol.
Att öka uttrycket av antigen i vävnader, citratbuffertlösning sattes till proverna och de kokades i en mikrovågsugn ugn. Proven behandlades med en 3% väteperoxidlösning i 10 min för att undertrycka den endogena peroxidasaktiviteten och sköljdes därefter med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). För att förhindra icke-specifika immunreaktioner, proverna behandlades med 3% normalt getserum under 10 min, och sköljdes med PBS. Den primära polyklonala kanin-anti-mus-CCL22-antikropp (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) och kanin-anti-mus-CCR4 antikropp (Abcam, Cambridge, UK) späddes 1: 100 med användning av get-serum och inkuberades vid rumstemperatur under 1 timme. Efter tre 2 min tvättar med PBS, inkuberades sektionerna med en biotinylerad get sekundär antikropp under 30 min (DAKO, Carpinteria, CA, USA). Efter tre 2 min tvättar med PBS, var streptavidin -horseradish peroxidas (Dako) till sektionen för 30 minuter, följt av ytterligare tre 2 min tvättar med PBS. Proverna har utvecklats med 3,3'-diaminobensidin substrat (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Kanada) under 1 minut och motfärgades med Mayers hematoxylin. Glasen dehydratiserades efter ett standardförfarande och förseglas med täck. Den negativa kontrollen preparerades genom samma procedur med användning av PBS i stället för den primära antikroppen. Normala magen vävnader användes som positiv kontroll.
Immuncytokemi färgning av CCR4
Gastric cancerceller ströks ut i kammarobjektglas belagda med poly-L-lysin, fick fästa under 48 timmar och sedan användas för immunocytokemi. Cellerna fixerades med 0,3% H 2O 2 i metanol under 60 min vid rumstemperatur, tvättades 4 gånger i PBS, blockerades med 3% BSA och permeabiliserades med PBS innehållande 0,1% Triton X-100 under 60 min vid rumstemperatur. Den antikropps, FITC-konjugerad anti-mus-CCR4 polyklonal antikropp (1

• Association of LEC och tnpA Helicobacter pylori gener med magcancer i brasilianska population
• Plasma mRNA expressionsnivåer av BRCA1 och TS som potentiella prediktiva biomarkörer för kemoterapi i gastric cancer