Proteinuttrycksprofilen för Gasterophilus intestinalis larver orsakar häst gastric larver och karakterisering av häst immunreaktion

Proteinuttrycksprofilen för Gasterophilus intestinalis
larver orsakar häst gastric larver och karakterisering av häst immunreaktion Bild Sammanfattning
Bakgrund
Det finns få uppgifter om den immunologiska aspekten av parasit Gasterophilus intestinalis
(Diptera, Oestridae ) larver orsakar häst gastric myiasis. Målen för denna forskning var att analysera innehållet i larvråextrakt av migrerande andra och tredje larver (L2 och L3) av G. intestinalis sälja för att karakterisera immunsvaret hos hästar protein.
Resultat
Den proteomik profil L2 och L3, undersöktes genom att använda en och tvådimensionella metoder, avslöjade en migrationsmönster specifikt för varje larvstadiet. Dessutom var Western-blottar utfördes med hästserum och med serum från Balb /c-möss som immuniserats med larvråextrakt av L2 eller L3, avslöjar en annan immunreaktion i naturligt infekterade hästar vs
. artificiellt inducerad immunreaktion hos möss. Det gäller jämförelser av immunoblot profiler demonstrerar att steget L2 är mer immunogena än det stadium L3 mest sannolikt som en effekt av den högsta enzymatisk produktion av L2 medan migrera genom de värdvävnader. Femton proteiner identifierades genom masspektrometri.
Slutsats
Detta arbete ger ytterligare information i förståelse för samspelet mellan G. intestinalis och deras värd
och genom att bidra ett nytt schema över proteomic profilen av huvud larver stadier.
bakgrund
Nio arter av Gasterophilus
(Diptera, Oestridae) har flugor beskrivits orsakar, i larvstadiet, gastrointestinal larver i equids. Medan Gasterophilus intestinalis
(De Geer, 1776) och Gasterophilus nasalis
(Linnaeus, 1758) är fördelade över hela världen och är ofta den enda arten som rapporterats i många delar av den nya världen, de återstående arterna endast rapporterats i mycket begränsad delar av Europa, Östeuropa deltog [1] och Afrika [2]. Vuxen bot flugor deponera sina ägg på värdarna hår på olika ställen beroende på art av Gasterophilus
[3]. G. pecorum
är ett undantag som honorna lägger sina ägg på gräs, blad och stjälkar av växter [1]. Infektion uppstår när ägg förs in i häst munnen djur slickar och grooming. De första larvstadiet (L1) luckor, börjar migrera och ruggning in i det andra larvstadiet (L2) i munhålan [4]. Larver av olika arter av Gasterophilus
är särskilt närvarande i en eller flera regioner i mag-tarmkanalen där den tredje larvstadiet (L3) sitter kvar på slemhinnan i ca 8-10 månader [5]. De kliniska symptom förknippade med migration och mognadsstadier larver är svåra att diagnostisera, men det har visat sig att olika arter av Gasterophilus
kan orsaka allvarliga skador under sin livscykel [6-9].
I senaste årens studier om immunologi och immunpatologi av många oestrid larver orsakar larverna har ökat på grund av deras viktiga implikationer i diagnostik och immuniseringsprogram [10]. Även immunologiska studier i huvudsak inriktad på Hypoderma
grub boskap infektion [11], och får nasal oestrosis av fårstyng
[12], den immunologi av Gasterophilus
spp. orsakas larver fått lite uppmärksamhet. Detta är också på grund av de inneboende svårigheterna i att studera immunologiska värd-parasit interaktioner vid mag-tarmslemhinnan gränssnittet. Som en konsekvens, hittills inga större immunogener har rapporterats [13]. En enda studie diskuterade utvecklingen av antikroppar för diagnos av larver av G. intestinalis
larver även specificiteten hos immunreaktion inte testades på förekomsten av samtidig häst parasitinfektion [14]. På senare tid har många proteomik baserade analyser i kombination med två-dimensionell gel-elektrofores, har erbjudit en övergripande strategi för att bättre förstå biologiska och immunologiska processer patogener och sjukdomar [15-17]. Syftet med denna studie var att karakterisera L2 och L3 proteiner av G. intestinalis Mössor och att analysera immunsvaret av hästar och immuniserade möss mot larv antigener.
Resultat
en-D-analys av larver råextraktet (LCE) av L2 och L3
Migrering av LCE2 på 1-D silver-färgade gelén visade ett specifikt mönster (Figur 1A) med 14 band, som isolerades från gelén för vidare identifiering genom masspektrometri (MS) ( Bord 1). Valet av banden var baserad på intensiteten av bandet på den silverfärgade gelén, såväl som den immuno-reaktivitet observerades efter immunblotting med hästserum (Figur 1B) eller L2-möss-serum (Figur 1C). Tre proteiner i fyra av de 14 utvalda banden gav en signifikant poäng (p < 0,05) och identifierades som aktin (Figur 1A, band 8), glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) (Figur 1A, band 9) och hemoglobin (figur 1 A, band 13 och 14). Ett annorlunda vandringsmönster observerades för LCE3 på 1-D silver-färgade gelén (figur 1D). Analogt har immunoblot utfördes med häst serum (Figur 1E) och serum från L3-möss (figur 1F). Valet av 13 band, som anges med pilar (figur 1D), baserades på samma kriterier som ovan. De isolerades för ytterligare identifiering genom MS (tabell 2). Tio proteiner av de 13 utvalda banden gav en signifikant poäng (p < 0,05) och identifierades som alfakedjan av larver serumprotein (figur 1D, band 1-4), arylphorin (figur 1D, band 6), beta-kedjan av larver serumprotein (figur 1D, band 7), hemoglobin (figur 1D, band 10-12) och murein lipoprotein (figur 1D, band 13) .table en masspektrometri identifiering av proteiner som identifierats från LCE L2.
Band ID
Protein namn
Arter
anslutningsnummer

MW (Da)
pl
Protein poäng
8
Protein liknar Actin-87E isoform 2 Review Drosophila melanogaster

AAM29410
37816
5,36
223
9
glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas
Drosophila hydei
S24630
35369
8,2
224
13
hemoglobin~~POS=TRUNC
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8,44
440
14
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
vid O96457
17912
8,44
144
fläckar uppdrag se figur 1. Proteiner som anges har identifierats med en betydande sannolikhet poäng på p < 0,05 i MSDB.
Tabell 2 masspektrometri identifiering av proteiner som identifierats från LCE L3.
Band ID

Protein namn
Arter
anslutningsnummer
MW (Da)
pl
Protein poäng
1
Larvserumprotein en alfakedja föregångare
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
92 2
Larvserumprotein 1 alfa kedjeprekursor
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
89
3
Larvernas serumprotein en alfa-kedja prekursor
Drosophila melanogaster

LSP1A_DROME
98802
5,72
98 4
Larvserumprotein en alfakedja föregångare
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
102
6
Arylphorin subenhet A4 prekursor
Calliphora vicina
ARY1_CALVI
92.282
5,59
71
7
Larvserumprotein en beta kedjeprekursor
Drosophila melanogaster
LSP1B_DROME
95.849
5,41
69
10
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8,44
247
11
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8,44
132
12
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
LPEBWM
17912
8,44
112
13
större yttermembran lipoprotein föregångare (murein-lipoprotein) katalog Pectobacterium atrosepticum
LPP_ERWCT
8396
9,36
69
fläckar uppdrag se figur 1. Proteiner som anges har identifierats med en betydande sannolikhet poäng på p < 0,05 (1, 2, 3, 4, 6, 7, 13: ExPASy databas; 10, 11, 12: MSDB).
Figur 1 en-D-analys av LCE av L2 och L3. Representativt 1-D silverfärgad gel av LCE av L2 (A) och L3 (D). Pilarna indikerar de band som valdes ut för masspektrometri. Western blot-analys av L2 inkuberades med hästserum (B) och mus-serum (C). Western blot-analys av L3 inkuberades med hästserum (E) och mus-serum (F). Proteinet identifiering genom MS presenteras i tabell 1 och 2.
2-D-analys av LCE av L2
proteinet migration av LCE av L2 på en 2-D-gel (Figur 2A) visade närvaron av proteiner längs hela pH-spektrum. Western-blottar utfördes med L2-möss-serum (figur 2B) och med hästserum (Figur 2C). Den silverfärgad gel används för att justera upptäckta proteinfläckar på båda immunoblot profiler. Ett större utbud av immunoreaktiva proteiner observerades på hästen immun profil än på L2-möss immunoblot. Cirklar indikerar 12 fläckar som ansågs som immunoreaktiv med L2-möss serum (Figur 2A, fläckar: 1, 2, 6, 8, 14-20, 25) och pilarna anger 24 punkter som ansågs som immuna reaktiv med hästserum (Figur 2A, fläckar: 1-13 och 16-26). Totalt 26 fläckar valdes ut för MS-analys (tabell 3). Bland de 26 utvalda fläckar, var 7-proteiner identifierade framgångsrikt (p < 0,05) genom MS: paramyosin (Figur 2A, fläck 1), serumalbumin (figur 2A, fläck 5), tubulin (figur 2A, fläck 9), enolas ( Figur 2A, spot 11), tropomyosin (figur 2A, spot 14), GAPDH (Figur 2A, spot 19) och hemoglobin (figur 2A, spot 20) .table 3 Masspektrometrimetoder identifiering av proteiner som identifierats från LCE av L2.
Spot ID
Protein namn
Arter
antal anslutnings

MW (Da)
pl
Protein poäng
en
Paramyosin
Drosophila melanogaster
S22028
102.277
5,5
97
5
Serum albumin föregångare
Bos taurus
ABBOS
69225
5,8
99
9
tubulin alfa-1-kedjan
Drosophila melanogaster
A26488
49.876
5,0
260
11
enolas
Oryza sativa
Q7XBE4
47.942
5,4
80
14
tropomyosin
Drosophila melanogaster
C25242
32740
4,7
78
19
glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas
Drosophila hydei
S24630
35369
8,2
100
20
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8,4
209
fläckar uppdrag se figur 2. Proteiner som anges har identifierats med en betydande sannolikhet poäng på p < 0,05 i MSDB.
Figur 2 2-D-analys av LCE L2. Silver-färgade representativa 2-D-protein karta över LCE av L2 innefattande pH-gradient från 3 till 11 med de MWs ranking 10-250 KDa (A). Den silverfärgade gelén användes för att rikta in detekterade proteinfläckar på Western-blottar utförda med serum från möss immuniserade med LCE av L2 (B) och med hästserum (C). Cirklarna indikerar de fläckar som var immunolabelled med möss serum (B; fläckar 1,2,6,8,14-19,25,26) och pilarna indikerar de fläckar som var immunolabelled med hästserum (C; fläckar 1-13 och 16 till 26). Totalt 26 platser isolerades för ytterligare MS identifiering. Proteinet identifiering genom MS presenteras i tabell 3.
2-D-analys av LCE av L3
proteomic profilen av LCE av L3 presenteras på figur 3A visar att de flesta av proteinerna är belägna i en basidic intervall mellan pH 7-11. Western-blottar utfördes med L3-möss-serum (figur 3B) och med hästserum (figur 3C). Intensiteten av immunreaktionen skiljer när LCE L3 exponeras med L3-möss serum eller med hästserum men immunoblot profilerna var likartade. Efter jämförelse av immunoblottar med silverfärgad gel, var 39 fläckar, indikerade med cirklar ut för vidare MS identifiering (tabell 4). 19 av de 39 isolerade fläckarna framgångsrikt identifierat (p < 0,05), vilket motsvarar 8 olika proteiner: filamin (Figur 3A, fläck 1), värmechockprotein (HSP-70) (figur 3A, fläck 2), serumalbumin prekursor (Figur 3A, spot 3,18-20), fosfoenolpyruvatkarboxikinas (PEPCK) (Figur 3A, fläck 8), enolas (Figur 3A, spot 22,23), fumaras (Figur 3A, fläck 1), beta-aktin ( Figur 3A, spot 27), hemoglobin (figur 3A, spot 32-39) .table 4 Masspektrometrimetoder identifiering av proteiner som identifierats från LCE L3.
Spot ID
Protein namn
Arter
anslutningsnummer
MW (Da)
pl

Protein poäng
en
Filamin en
Drosophila melanogaster
Q8T3K7
151.931
5,72
76
2
Värmechock chock~~POS=HEADCOMP 70 kDa protein 70C
Drosophila melanogaster
HSP7A_DROME
70.871
5,34
70
3
serumalbumin
Bos taurus

AAN17824
71.274
5,82
171
8
fosfoenolpyruvatkarboxikinas
Drosophila melanogaster
PPCK_DROME
71.882
6,07
79
18
Serumalbumin albumin~~POS=HEADCOMP prekursor
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
108
19
Serumalbumin albumin~~POS=HEADCOMP prekursor
Bos taurus

ALBU_BOVIN
71244
5,82
117
20
Serumalbumin albumin~~POS=HEADCOMP prekursor
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
165
22
enolas (Fragment) Review Drosophila subobscura
O44101
44548
5,92
142
23
enolas
Schistosoma mansoni
vid ENO_SCHMA
47421
6,18
163
24
fumaras
Drosophila melanogaster
Q9VTI5
51.239
8,47
111
27
Beta-aktin
Danio rerio
ACTB1_BRARE
42.082
5,3
184
32
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis

O96457
18026
8,44
95
33
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
113
34
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
131
38
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
415
39
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
410
fläckar uppdrag avses Figur 3. protein som anges har identifierats med en betydande sannolikhet poäng på p < 0,05 (2, 8, 18, 19, 20, 23, 27: ExPASy databas; 1, 3, 22, 24, 32, 33, 34, 38, 39: MSDB) Review Figur 3 2-D-analys av. den LCE L3. Silver-färgade representativa 2-D-protein karta över LCE av L3 innefattande pH-gradient från 3 till 11 med de MWs ranking 10-250 KDa (A). Den silverfärgade gelén användes för att rikta in detekterade proteinfläckar på Western-blottar utförda med serum från möss immuniserade med LCE av L3 (B) och med hästserum (C). 39 platser immunolabelled med både sera isolerades för ytterligare MS identifiering. Protein identifiering genom MS presenteras i tabell 4.
Diskussion
jämförelse av migrationsmönster för LCE2 och LCE3 både dimensionsanalys (1-D och 2-D), tyder på att larver proteinic profil är iscensätta specifik, vilket tyder på en annan sammansättning i larv metabolism och antigena egenskaper. 1-D silverfärgade geler av larvråextrakt indikerade en mycket tät koncentration av proteiner; följaktligen inriktningen av immunoreaktiva band detekteras med häst och möss kan medföra vissa skillnader. Den proteomik metod bekräftade specifikt protein profil både larvstadier och får bättre identifiering av de olika platserna.
Möss artificiellt vaccineras mot en råproteinextrakt från hela larver. Ett stort antal proteiner som normalt inte är i direkt kontakt med hästar presenterades för immunsystemet hos mössen. Till skillnad från naturlig infektion framkalla en häst immunreaktion, subkutan injektion i möss inducerar en systemisk immunreaktion flyttas till en Th1 svar från adjuvans. Denna skillnad i immunreaktion förklarar det faktum att de flesta av de L2 och L3-proteiner som reagerade med mus-sera visade en mer intensiv signal i jämförelse med reaktionen med häst sera. Eftersom livscykel G. intestinalis
sker i mag-tarmkanalen hos hästar, är det mukosala immunsystemet i kontakt med larver och därmed utsätts för utsöndrade eller utsöndrade ämnen under larv migration och utveckling [18]. Även L2 migrationsmönster från mun till mage är fortfarande oklart, kan immunreaktionen detekteras i hästar och i experimentellt immuniserade möss tyder på att larvstadiet L2 har mer antigena proteiner än larvstadiet L3, förmodligen användbara för larv enzymatisk migration [19]. Följaktligen var enolas identifierades genom MS och har tidigare redovisats som ett viktigt enzym lokaliserat på ytan av flera patogener när invaderar vävnad [20]. L2 är en scen som inducerar ett starkt immunsvar så att dess utveckling i L3 i magen kan vara en försvarsmekanism av larverna att kringgå hästen immunförsvar. Omvänt tyder det faktum att L3 förblir fäst för 8-10 månader till magväggen en hypometabolic status, eller minskade immunogena egenskaper. Detta kan förklara den svaga immunreaktion observerades i närvaro av hästserum mot L3.
Två viktiga larv proteiner, arylphorin och LSP-2 (larvserumprotein), respektive homologa med Calliphora och Drosophila melanogaster
>, identifierades i L3. I holometabolous insekter konstruktionen av vuxna vävnader under metamorfos kräver en stor mängd energi. Det är känt att före bildandet av puparium, fett kroppens celler absorbera proteiner och andra makromolekyler som har ackumulerats i hemolymfa under larvutfodringsperioden [21]. Den största delen av införlivade proteiner består av arylphorins och LSP-2 [22]. Dessutom har hemoglobin identifierades i båda larvstadier av G. intestinalis
. Denna rikliga och cirkulerande molekylen är närvarande i hög grad tracheated celler som bildar den bakre spiracular plattan och gör larverna att bättre utnyttja intermittent kontakt när luft sväljas med mat [23].
Flesta av de övriga identifierade proteiner i L2 (paramyosin , tubulin, tropomyosin, GAPDH och ett protein som liknar aktin) eller i L3 (filamin, fumaras, PEPCK, HSP-70, enolas) delas med de Drosophila
spp. tyder på att strukturella eller metaboliska homologier existerar mellan dessa arter. sälja Under denna forskning, olika tarmparasiter (anoplocephala perfoliata
, parascaris equorum
, Cyathostominae) var samtidigt närvarande med G. intestinalis
i mag -intestinal kanalen hos de slaktade hästar. Risken för korsreaktivitet har ännu inte utvärderats. Men till skillnad från vissa immunologiska studier om tarmmaskar i hästdjur [24-26], korsreaktiviteten mellan G. intestinalis sälja och gastrointestinala parasiter har ännu inte studerats.
Detta arbete ger ytterligare information i förståelsen av samspelet mellan G. intestinalis Mössor och deras värd och genom att bidra en ny ordning för proteomik profil av de viktigaste larvstadier. Därmed våra resultat visar ytterligare komplexiteten i denna värd parasit interaktion. I själva verket visar denna studie att det är nödvändigt att utveckla en tillförlitlig serologiska verktyg för att upptäcka angripna hästar, särskilt eftersom det enda sättet att upptäcka en G. intestinalis
angrepp är genom obduktion.
Identifiering av de flesta av proteinerna kommer att vara nästa steg för att definiera sin roll, deras cellulära eller vävnadslokalisering och deras potentiella antigena egenskaper.
metoder
Larv insamling och antigenberedning
Gasterophilus
spp. L2 och L3 samlades från pyloric del av magsäcken hos hästar med ursprung från två gårdar som ligger i distriktet den schweiziska Jura; Delémont: N 47 ° 21 '; E 7 ° 20 ', Schweiz. Samtidigt, var mag-tarmkanalen hos varje djur undersöktes och närvaron av P. equorum
, A. perfoliata
och Cyathostominae observerades i något fall.

• Endoskopisk stängning av magsond perforeringar med titan klipp: fyra fall report
• Enorma gastric bezoar orsakas av honungskaka, en ovanlig komplikation av hälsa faddism: ett fall report