Expresia proteínov profil Gasterophilus intestinalis larvy spôsobujú jazda na žalúdočné choroby prenášajúcich a charakterizáciu kôň imúnny reaction

proteín expresného profilu Gasterophilus intestinalis
larvy spôsobujú jazda na žalúdočné choroby prenášajúcich a charakterizáciu koní imunitné reakcie
abstraktné
pozadia
málo informácií je k dispozícii na imunologické aspektu parazitických Gasterophilus intestinalis
lariev (Diptera, Oestridae), ktorý spôsobuje jazda na žalúdočné choroby prenášajúcich. Cieľom tohto výskumu bolo analyzovať obsahu bielkovín v larválnom surových extraktov migrujúci larvy druhého a tretieho (L2, L3), G. intestinalis
k charakterizácii imunitnej odpovede koní.
Výsledky
The proteomický profil L2 a L3, vyšetroval pomocou jedného a dva rozmerné prístupy, odhalil migračné vzor špecifické pre každú larválnom štádiu. Okrem toho, Western bloty boli vykonávané s konského séra a so sérom z myší Balb /c imunizovaných larválnych surových extraktov L2 alebo L3, odhaľuje inú imunitnú reakciu v prirodzene infikovaných koní vs
. umelo vyvolaná imunitnú reakciu u myší. Porovnanie týchto imunoblotu profilov ukazujú, že fáza L2 je viac imunogénna, než je fáza L3 najväčšou pravdepodobnosťou ako účinok na najvyššiu enzymatické výroby L2 pri prechode cez hostiteľskými tkanivami. Pätnásť proteíny boli identifikované hmotnostnej spektrometrie.
Záver
Táto práca poskytuje ďalšie informácie do chápania interakcie medzi intestinalis G. stroje a ich hostiteľa a tým, že prispeje nový schéma proteomického profilu hlavného larválnom etáp.
pozadí
Deväť druhov Gasterophilus
(dvojkrídlových, Oestridae) boli muchy boli popísané spôsobujú, v larválnom štádiu, gastrointestinálne choroby prenášajúcich v koní. Kým Gasterophilus intestinalis
(De Geer, 1776) a Gasterophilus Nasalis
(Linnaeus, 1758) sú distribuované po celom svete a sú často jediný druh hlásené v mnohých častiach Nového sveta, zvyšné druhy sú hlásené len vo veľmi obmedzenej oblasti Európy, východné krajiny [1] a Afriku [2]. Dospelý topánok muchy uložiť svoje vajíčka na vlasy usporiadateľov na rôznych miestach v závislosti na druhu Gasterophilus
[3]. G. pecorum
Výnimkou je ako samičky kladú vajíčka na tráve, listov a stoniek rastlín na trh [1]. Infekcia nastáva, keď sú ikry do úst konského zvierat lízanie a grooming. Prvé štádium larvy (L1) poklopy, začne migráciu a vyzliekanie do druhého štádia larvy (L2), v ústnej dutine [4]. Larvy rôznych druhov Gasterophilus
sú špecificky prítomné v jednej alebo viacerých oblastiach gastrointestinálneho traktu, kde je tretí larválne štádium (L3) zostáva pripojená na sliznici po dobu asi 8 až 10 mesiacov [5]. Klinické príznaky spojené s migráciou a zrenia fáz lariev sa ťažko diagnostikovať, ale bolo preukázané, že rôzne druhy Gasterophilus
môžu spôsobiť veľké škody v priebehu ich životného cyklu [6-9]. V
minulých rokoch štúdie týkajúce sa imunológiu a imunopatologii mnohých oestrid choroby prenášajúcich spôsobujú larvy zvýšili kvôli ich dôležité dôsledky v diagnostike a očkovacie programy [10]. Kým imunologické štúdie boli zamerané predovšetkým na Hypoderma
dobytok grub infekcie [11], a oviec nosovej oestrosis podľa ruje ovis
[12], imunológia Gasterophilus
spp. spôsobiť choroby prenášajúcich venovaná len malá pozornosť. To je tiež kvôli spojeným ťažkostiam pri štúdiu imunologických-hostiteľskej interakcie na gastrointestinálne sliznice rozhraní. V dôsledku toho, zatiaľ neboli hlásené žiadne významné imunogén [13]. Jedna štúdia diskutovali o tvorbu protilátok pre diagnostiku choroby prenášajúcich G. intestinalis
larvy hoci špecifickosť imunitné reakcie nebol testovaný vo výskyte súbežná jazda na parazitárne infekcie [14]. Analýzy viac nedávno, mnoho proteomiky báze, v kombinácii s dvojrozmernú gélovou elektroforézou, ponúkli komplexný prístup k lepšie porozumieť biologické a imunologické procesy patogénov a chorôb [15-17]. Cieľom tejto štúdie bolo charakterizovať L2 a L3 proteíny G. intestinalis stroje a analyzovať imunitnú odpoveď koní a imunizovaných myší proti larválnym antigény.
Výsledky analýzy
1-D larválne surového extraktu (LCE) z L2 a L3
migrácie LCE2 na striebrom zafarbený gél 1-D vykazovali určitý vzorky (obrázok 1A) s 14 pásmi, ktoré boli izolované z gélu na ďalšiu identifikáciu pomocou hmotnostnej spektrometrie (MS) ( tabuľka 1). Výber zo skupín bolo založené na intenzite pásu na striebrom zafarbený gél, rovnako ako imuno-reaktivity pozorované po imunoblotu s konským sérom (obrázok 1B) alebo L2-myšou sérum (obrázok 1C). Tri proteíny 4 z 14 vybraných pásiem dal významný skóre (p menšie ako 0,05) a boli identifikované ako aktínu (obrázok 1A, pásmo 8), glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH) (obrázok 1A, skupina 9) a hemoglobínu (obrázok 1A, pásy 13 a 14). Odlišný model migrácia bola pozorovaná u LCE3 na 1-D-striebrom zafarbený gél (obrázok 1D). Analogicky, imunoblotu boli vykonávané s konským sérom (obrázok 1E) a séra L3-myší (obrázok 1F). Výber z 13 kapiel, označené šípkami (obrázok 1D), bola založená na rovnakých kritérií, ako je uvedené vyššie. Boli izolované na ďalšiu identifikáciu MS (tabuľka 2). Desať proteíny z 13 vybraných pásiem dal významný skóre (p menšie ako 0,05) a boli identifikované ako alfa reťazci lariev sérového proteínu (obrázok 1D, pásmach 1-4), arylphorin (obrázok 1D, pásová 6), beta reťazec z lariev sérového proteínu (obrázok 1D, pásová 7), hemoglobínu (obr 1D, kapiel 10-12) a mureínu lipoproteínu (obrázok 1D, pásmo 13) .Table 1 Hmotnostná spektrometria identifikácie proteínov identifikovaných z LCE L2.
Pásové ID
názov Protein
druhov,
prístupové číslo

MW (Da)
pí
Protein skóre
8
Protein podobný aktínu-87e izoforma 2
Drosophila melanogaster

AAM29410
37816
5,36
223
9
glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy
Drosophila Hyde
S24630
35369
8.2
224
13
hemoglobín
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912a
8,44
440
14
hemoglobín
Gasterophilus intestinalis

O96457
17912a
8,44
144
Spots úlohy pozri Obrázok 1. bielkovín uvedených boli identifikované s významnou pravdepodobnosťou skóre na p < 0.05 v msdb.
Tabuľka 2 Hmotnostná spektrometria identifikácie proteínov identifikovaných z LCE L3.
Pásové ID

Protein názov
druhov,
Prírastkové číslo
MW (DA)
pí:
Protein skóre
foto 1
lariev sérum proteín 1 alfa reťazec predchodcom
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
92
2
lariev sérum proteín 1 alfa reťazec prekurzor
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
89 Sims 3
larválne sérum proteínov 1 alfa prekurzor reťazca
Drosophila melanogaster

LSP1A_DROME
98802
5,72
98
4
lariev sérum proteín 1 alfa reťazec predchodcom
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
102
6
Arylphorin podjednotku A4 predchodcom
Bzučivka Všeobecná
ARY1_CALVI
92282
5,59
71
7
lariev sérum proteín beta 1 reťaz prekurzor
Drosophila melanogaster
LSP1B_DROME
95849
5,41
69
10
Hemoglobín
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912a
8,44
247
11
Hemoglobín
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912a
8,44
132
12
Hemoglobín
Gasterophilus intestinalis
LPEBWM
17912a
8,44
112
13
Major vonkajšej membrány lipoproteín prekurzor (mureínu-lipoproteín)
Pectobacterium atrosepticum
LPP_ERWCT
8396
9,36
69
Spots úlohy pozri Obrázok 1. bielkovín uvedených boli identifikované s významnou pravdepodobnosťou skóre na p < 0,05 (1, 2, 3, 4, 6, 7, 13: Expasy databázy, 10, 11, 12: msdb).
Obrázok 1 1-D analýzu LCE L2 a L3. Reprezentatívny 1-D strieborno-zafarbený gél LCE L2 (A) a L3 (D). Šípky označujú kapely, ktoré boli vybrané pre hmotnostnú spektrometriu. Western blot analýza L2 inkubovali s konského séra (B) a myšiam sére (C). Western blot analýza L3 inkubovali s konským sérom (E) a myšieho séra (F). Identifikácia proteínov MS je uvedený v tabuľke 1 a 2.
2-D analýza LCE L2
migrácie proteínu v LCE L2 na 2-D gélu (obrázok 2A) preukázala prítomnosť proteíny v priebehu celého spektra pH. Western bloty boli vykonávané s L2-myšou sérum (obrázok 2b) a konského séra (obrázok 2C). Striebro-zafarbený gél bol použitý na zarovnanie zistené proteínové škvrny na oboch imunoblotu profilov. Väčší rozsah imunitou-reaktívneho proteínu bola pozorovaná na immunoblottingu profile koní než na L2-myšou imunoblotu. Kruhy znamenajú 12 škvrny, ktoré boli považované za imuno-reaktívny s L2-myšou sérum (obr 2A, lokalít: 1, 2, 6, 8, 14-20, 25) a šípky označujú, 24 škvrny, ktoré boli považované za imunitné reaktívny s konským sérom (obrázok 2A, škvrny: 1-13 a 16-26). Celkom 26 miest bolo vybrané pre MS analýzu (tabuľka 3). Medzi 26 vybraných miestach, 7 proteíny boli úspešne identifikované (p menšie ako 0,05), MS: paramyosin (obrázok 2A, bodové 1), sérový albumín (obrázok 2A, bod 5), tubulínu (obrázok 2A, bod 9), enoláza ( obrázok 2A, na mieste 11), tropomyosin (obrázok 2A, na mieste 14), GAPDH (obrázok 2A, na mieste 19) a hemoglobínu (obrázok 2A, na mieste 20) .Table 3 hmotnostnej spektrometrie identifikácia bielkovín identifikovaných z LCE L2.
Spot ID
názov Protein
druhov,
prístupové číslo

MW (DA)
pí
Protein skóre
1
Paramyosin
Drosophila melanogaster
S22028
102277
5,5
97
5
sérum albumín predchodcom
Bos taurus
ABBOS
69225
5,8
99
9
tubulínu alfa-1 reťazec
Drosophila melanogaster
A26488
49876
5,0
260
11
enoláza
Oryza sativa
Q7XBE4
47942
5,4
80
14
tropomyosin
Drosophila melanogaster
C25242
32740
4,7
78
19
glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy
Drosophila Hyde
S24630
35369
8,2
100
20
Hemoglobín
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912a
8,4
209
Spots úlohy pozri Obrázok 2. bielkovín uvedených boli identifikované s významnou pravdepodobnosťou skóre na p < 0,05 v msdb.
Obrázok 2 2-D analýzy LCE L2. Striebro-zafarbený reprezentatívne 2-D mapa proteín LCE z L2 obsahujúce pH gradientu od 3 do 11 s MWS poradí od 10 do 250 kDa (A). Striebro-zafarbený gél bol použitý na zarovnanie zistené proteínové škvrny na Western blot vykonaných so sérom myší imunizovaných LCE L2 (B) a s konským sérom (C). Kruhy označujú miesta, ktoré boli immunolabelled s myšou sérom (B; všimne 1,2,6,8,14-19,25,26) a šípky označujú miesta, ktoré boli immunolabelled s konským sérom (C; spoty 1-13 a 16 až 26). Celkom 26 bodov boli izolované na ďalšiu identifikáciu MS. Identifikácia proteínov MS je uvedený v tabuľke 3.
2-D analýza LCE L3
The proteomických profilu LCE L3 prezentovaných na obrázku 3A ukazuje, že väčšina proteínov sa nachádza v rozmedzí basidic medzi pH 7-11. Western bloty boli vykonávané s L3-myšou sérum (obrázok 3B) a konského séra (obrázok 3C). Intenzita imunitné reakcie sa líšia, pokiaľ LCE L3 je vystavená s L3-myšou sérum alebo konského séra, ale imunoblotu profily boli podobné. Po porovnaní imunoblotu s striebrom zafarbený gél, 39 škvrny, označené kruhy boli vybrané pre ďalšiu identifikáciu MS (tabuľka 4). 19 zo 39 izolovaných miestach boli úspešne identifikované (p menšie ako 0,05), čo zodpovedá 8 rôznych proteínov: filamin (obrázok 3A, miesto 1), proteín tepelného šoku (HSP-70) (pozri obrázok 3A, bod 2), sérový albumín prekurzor (3A, spot 3,18-20), fosfoenolpyruvát karboxykinasa (PEPCK) (obrázok 3A, bod 8), enoláza (obrázok 3A, spot 22,23), fumaráza (obrázok 3A, bod 1), beta-aktínu ( 3A, na mieste 27), hemoglobín (obrázok 3A, na mieste 32-39) .Table 4 hmotnostnej spektrometrie identifikácia bielkovín identifikovaných z LCE L3.
Spot ID
názov Protein
druhov,
Prírastkové číslo
MW (DA)
pí

Protein skóre
1
filamin 1
Drosophila melanogaster
Q8T3K7
151.931
5,72
76
2
Tepelný šok 70 kDa proteín 70C
Drosophila melanogaster
HSP7A_DROME
70871
5,34
70 Sims 3
sérového albumínu
Bos taurus

AAN17824
71274
5,82
171
8
fosfoenolpyruvát karboxykinasa
Drosophila melanogaster
PPCK_DROME
71882
6,07
79
18
sérum albumín predchodcom
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
108
19
sérum albumín predchodcom
Bos taurus

ALBU_BOVIN
71244
5,82
117
20
sérum albumín predchodcom
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
165
22
enoláza (Fragment)
Drosophila subobscura
O44101
44548
5,92
142
23
enoláza
Schistosoma mansoni

ENO_SCHMA
47421
6,18
163
24
fumaráza
Drosophila melanogaster
Q9VTI5
51239
8,47
111
27
beta-aktínu
Danio rerio
ACTB1_BRARE
42082
5,3
184
32
Hemoglobín
Gasterophilus intestinalis

O96457
18026
8,44
95
33
Hemoglobín
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
113
34
hemoglobín
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
131
38
hemoglobín
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
415
39
Hemoglobín
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
410
Spots úlohy týkajú obrázok 3. bielkovín uvedených boli identifikované s významnou pravdepodobnosťou skóre na p < 0,05 (2, 8, 18, 19, 20, 23, 27: Expasy databázy, 1, 3, 22, 24, 32, 33, 34, 38, 39: msdb)
Obrázok 3 2-D analýzy. LCE L3. Striebro-zafarbený reprezentatívne 2-D mapa proteín LCE z L3 obsahujúce pH gradientu od 3 do 11 s MWS poradí od 10 do 250 kDa (A). Striebro-zafarbený gél bol použitý na zarovnanie zistené proteínové škvrny na Western blot vykonaných so sérom myší imunizovaných LCE L3 (B) a s konským sérom (C). 39 škvrny immunolabelled s oboma sér boli izolované na ďalšiu identifikáciu MS. Identifikácia proteín MS je uvedená v tabuľke 4.
Diskusia
Porovnanie migračných vzoroch LCE2 a LCE3 v oboch rozmerová analýza (1-D a 2-D), znamená to, že larválne bielkovinových profil fázy špecifické, tak navrhovať rôzne zloženie v larválnom metabolizmu a antigénne vlastnosti. Tieto 1-D strieborné postriekané gély larválnych surových extraktov je uvedené veľmi hustú koncentráciu proteínov; V dôsledku vyrovnania pásom imunitou reaktívne zistených kone a myší môže predstavovať určité rozdiely. Proteomický prístup potvrdila špecifický proteínový profil oboch larválne štádiá a nechá lepšiu identifikáciu rôznych miestach.
Myši imunizovaných proti umelo surového proteínového extraktu z celého lariev. Veľké množstvo bielkovín, ktoré sú za normálnych okolností nie je v priamom kontakte s koní boli prezentované imunitnému systému myší. Okrem toho, na rozdiel od prirodzenej infekcii vyvolať imunitnú reakciu kôň, podkožné injekcie u myší indukuje systémovú imunitnú reakciu posunutá odpoveď Th1 u adjuvans. Tento rozdiel v imunitnej reakcii vysvetľuje skutočnosť, že väčšina bielkoviny L2 a L3, ktoré reagovali s myšou sérom vykazovali intenzívnejší signál v porovnaní s reakciou s konského séra. Vzhľadom k tomu, životného cyklu G. intestinalis
sa vyskytuje v gastrointestinálnom trakte u koní, mukóznej imunitný systém je v kontakte s larvami a tak vystavené vylučovaných alebo vylučované látky v larválnom migrácii a rozvoji [18]. Hoci L2 migračné vzorce od úst k žalúdku zostáva nejasné, imunitné reakcie zistená u koní a experimentálne očkovaných myší mohlo naznačovať, že larválne štádium L2 má viac antigénne bielkoviny než larválne štádiá L3, pravdepodobne užitočné pre larválne migráciou enzymatické [19]. V súlade s tým, enoláza bol identifikovaný MS a už predtým bola označená ako dôležitý enzým lokalizovaný na povrchu rôznych patogénov, keď napádať tkaniva [20]. L2 je stupeň indukovať silnú imunitnú odpoveď hostiteľa, aby jeho vývoj do L3 v žalúdku môže byť obranný mechanizmus lariev obísť konské imunitného systému. Naopak, skutočnosť, že L3 zostane pripojená po dobu 8-10 mesiacov, žalúdočnej steny navrhuje hypometabolic stav, alebo so zníženou imunogénna vlastnosti. To môže vysvetliť slabú imunitné reakcie pozorované v prítomnosti konského séra proti L3.
Dve dôležité bielkoviny, larválne arylphorin a LSP-2 (larválne sérové ​​bielkoviny), v danom poradí, aby homológnej Calliphora Vicina stroje a Drosophila melanogaster
, boli identifikované v L3. V Holometabolous hmyzu stavba dospelých tkanivách počas metamorfózy vyžaduje veľké množstvo energie. Je známe, že pred vytvorením puparium, tukové bunky tela reabsorb proteínov a iných makromolekúl, ktoré sa nahromadili v hemolymfa počas larválneho kŕmenia obdobia [21]. Hlavná časť prítomných bielkovín sa skladá z arylphorins a LSP-2 [22]. Okrem toho, hemoglobín bol identifikovaný v oboch larválne štádiá G. intestinalis
. Táto bohatá a cirkulujúci molekula je prítomná vo vysoko tracheated buniek, ktoré tvoria zadnú spiracular dosku a umožňuje larvy k lepšiemu využívaniu prerušovaným kontaktom, keď je vzduch požití s ​​potravou [23].
Väčšina ostatných identifikovaných proteínov v L2 (paramyosin , tubulín, tropomyosin, GAPDH a proteín podobný aktínu), alebo v L3 (filamin, fumaráza, PEPCK, HSP-70, enoláza) sú zdieľané s tými, Drosophila
spp. naznačujúce, že štrukturálne alebo metabolické homológie existujú medzi týmito druhmi.
Počas tohto výskumu, rôzne črevné parazity (Anoplocephala perfoliata
, Parascaris equorum
Cyathostominae) boli prítomné súčasne s G. intestinalis
v gastro -intestinal traktu porazených koní. Riziko krížovej reaktivity stále ešte musia zhodnotiť. Ale na rozdiel od niektorých imunologických štúdií o črevných hlísty v koní [24 až 26], je skrížená reaktivita medzi G. intestinalis
a gastro-črevné parazity nebol doteraz študovaný.
Prácu poskytuje ďalšie informácie do chápania interakcia medzi G. intestinalis stroje a ich hostiteľa a tým, že prispeje nový schéma proteomického profilu hlavných larválne štádiá. Teda naše výsledky ďalej demonštrujú zložitosť tohto hostiteľa parazit interakcie. Naozaj, táto štúdia ukazuje, že je potrebné vytvoriť spoľahlivé sérologické nástroj pre detekciu zamorené koní, a to najmä preto, že jediný spôsob, ako odhaliť G. intestinalis
zamorenia podľa pitva.
Identifikácia väčšiny proteínov bude ďalším krokom k definovanie ich úlohu, bunkovú alebo tkanivovú lokalizáciu a ich potenciálne antigénne vlastnosti.
Metódy
vanička pre zber a antigénu prípravu
Gasterophilus
spp. L2 a L3 boli odobraté z pylorické časti žalúdka kone pochádzajúce z dvoch fariem sa nachádza v okrese švajčiarskeho kantónu Jura; Delémont: N 47 ° 21 '; E 7 ° 20 ', Švajčiarsko. Súčasne, gastrointestinálny trakt každého zvieraťa bola skúmaná a prítomnosť P. equorum
, A. perfoliata stroje a Cyathostominae bol pozorovaný v každom prípade.
Všetky larvy boli premyté zhromaždí v sterilnej fosfátu soľný pufer (PBS 0.1 M, pH 7,2), ktoré možno identifikovať ako G. intestinalis
na základe morfologických klávesov [1] a zmrazí sa pri teplote -20 ° C. na prípravu
larválnych surových extraktov, 10 L2 larvy zozbierané na dvoch rôznych koňa rovnaké stáda, a sedem L3 lariev zozbierané na jedného koňa pochádzajúci z druhého stáda, sa podrobí pôsobeniu ultrazvuku a homogenizované na ľade za sterilných podmienok. Homogenát sa extrahuje cez noc v 0,1 M pH 9,6 uhličitan pufru obsahujúceho 1 mM fenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) a 5 mM kyselina ethylenediamin (EDTA), tým, že ďalej pridá 1 ml /g inhibítora proteázy (Sigma-Aldrich, Buchs, Švajčiarsko) , Extrakty boli centrifugovány pri 20.000 x g počas 30 minút
(4 ° C). Supernatant obsahujúci antigény sa zhromaždia a konečný obsah proteínu stanovuje spektrometrie (metóda Bradford, BIORADE). LCE bol lyofilizovaný a skladovaný pri teplote -20 ° C.
hnedák Vzorky séra
Vzorky krvi boli odoberané na skupinu dvadsiatich kone pochádzajúce z dvoch farmách v opísanej oblasti. Hoci vzorky krvi a larválne kolekcie nemohlo byť vykonané na rovnakých zvieratách naše pozorovania uskutočnených v priebehu súbežne vykonávané epidemiologický prieskum (Roelfstra bicyklov, in prep.), Vrátane pozorovanie v teréne na živých zvieratách a na bitúnkoch, potvrdil vysokú úroveň endemicitou G. intestinalis
skôr opísané [19] Brocard v rovnakej oblasti a umožní nám predpokladať, že všetci kone použité v tejto štúdii sú zamorené G. intestinalis
. Fetálny konského séra bola použitá ako negatívna kontrola pre Western bloty. Krv sa odstredí pri 3500 x g
dobu 15 minút pri teplote miestnosti a séra boli skladované pri -20 ° C.
Imunizácia myší a vzorky séra
Balb /c myši imunizovaných LCE L2 (L2 myši), alebo s LCE L3 (L3 myšou) od G. intestinalis
. Dva gramy L3 a dva gramy L2 sa podrobí pôsobeniu ultrazvuku, homogenizuje v sterilnom PBS pufri o pH 7,2 a centrifugována pri 20.000 x g
. Supernatant sa potom emulguje v rovnakom objeme nekompletným Freundovom adjuvans (Sigma-Aldrich, Buchs, Švajčiarsko).
Dávke 100 ug proteínu /myš, v objeme 200 ul, bola injikovaný každé 2 týždne až 6 týždňov. Zvieratá boli odobratá krv sedem týždňov po prvej imunizácii. Kontrolné myši boli Inokulované kombináciou PBS a nekompletným Freundovom adjuvans nad zakaždým. Odobraté vzorky krvi sa odstredí pri 3500 x g
dobu 15 minút pri teplote miestnosti a séra uložené pri teplote -20 ° C. Všetky postupy boli schválené zodpovednou miestneho výboru pre zvieracie experimenty.
Jednorozmerné elektroforézy (1-D)
proteíny L2 (5 ug /jamka) a L3 (5 ug /jamku) boli oddelené na gradient SDS -PAGE gély (4-20%) za redukčných podmienok (2-β-mercaptoetanolu, 95 ° C po dobu 5 minút). Elektroforéza bola vykonávaná pri 80/100 V počas 30 min /2 hodiny. Jedna sada gélov bol zafarbený striebrom pre hmotnostnej spektrometrie, a druhý bol prevezený na nitrocelulózové membrány (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) pre analýzou westernovým prenosom.
Dvojrozmerná elektroforéza (2-D)
lyofilizovanej LCE vzorky boli rozpustené v 2-DE lyzačného pufra (9 M močovina, 2 M tiomočoviny, 1% dithioerythriol, 4% CHAPS, 2,5 uM EGTA a 2,5 uM EDTA). Immobiline suché prúžky pH 3-11 nelineárny, 11 cm (GE Healthcare, Uppsala, Švédsko) boli ponorené cez noc v lyzačním pufri obsahujúcom vzorka 75 ug proteínu, ďalšie 1% Pharmalyte pH 3-10 (GE Healthcare, Uppsala, Švédsko), a 0,5% modrá sodná soľ brómfenolovej modrej. IEF na Multiphor (GE Healthcare) pre 15 kV · h pri 20 ° C, po ktorom nasleduje separácia na gradient SDS-PAGE géloch (9-15%) pri konštantnom 45 V na gélu. Jedna sada gélov bol zafarbený striebrom pre MS a druhý bol prevedený na nitrocelulózové membrány (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) pre analýzou westernovým prenosom.
Western blot (WB)
Nešpecifická väzba bola blokovaná 1% polyvinylpyrolidónu v PBS-Tween po dobu 1 hodiny. Bloty boli následne inkubovali s primárnou protilátkou v PBS-Tween (cez noc pri 4 ° C, kôň sera alebo myšou Séra 1: 1000) a premyje. Imunoreaktívnych škvrny boli detekované pomocou kozej anti-myší IgG (H + L) (1: 20000, Nordic Immunology Laboratories, Tilburg, The Netherlands), alebo anti-kone IgG (1: 10000, Sigma-Aldrich, Buchs, Švajčiarsko) protilátka konjugovaná s chrenovou peroxidázou. Signály boli detekované s ECL (Enhanced chemiluminiscencie) na Hyperfilm ECL (GE Healthcare, Uppsala, Švédsko) [27]. Po zistení ECL, bloty boli následne zafarbené koloidným zlatom, aby zodpovedali viditeľné škvrny na celkovej štruktúry na striebrom zafarbený gély.
Hmotnostná spektrometria (MS)
Vybrané škvrny boli vyrezané z 2-D gélov, odfarbí , spracované proteolýzou trypsínom [28] a analyzované pomocou MALDI-TOF a MS /MS na MALDI-TOF /TOF tandemovým hmotnostným spektrometrom (ABI 4700 Proteomics Analyzer, Applied Biosystems). Kombinovaná PMF (peptid hmotnosť odtlačkov prstov) a MS /MS otázky boli vykonané s maskotom © v1.9 Database vyhľadávače [29] (Matrix Science) vložené do GPS-Explorer softvér (verzia 3.6, Applied Biosystem) na švajčiarsko prot databázy (verzia 20051206, 201594 sekvencie; 73123101 zvyšky) alebo msdb (verzia 20040703, 1501893 sekvencie, 480537664 zvyškov). Identifikácia proteínov bol považovaný za pozitívny (tabuľky 1, 2, 3 a 4), ak (i) je pravdepodobnosť báze MOWSE skóre [30], získané z oboch MS a MS /MS analýzu bol významný (tj skóre > 66 boli signifikantné pri p < 0,05 pre Expasy databázy, a dáva > 74 signifikantné pri p menšie ako 0,05 pre databázu msdb; interval spoľahlivosti > 99%, ako je uvedené podľa GPS Explorer verzie 3.6); (Ii) krytej peptidové hmotnosti boli bohaté v spektre; a (iii) teoretické molekulovej hmotnosti (MW) významných zásahov vyhovujú experimentálne pozorované hodnoty.
vyhlásenie
Poďakovanie
Táto práca bola podporená tým, SFB 571 grantovú A5 Deeg. Autori ďakujú Prof. D. Otranto a prof D.D. Colwell za ich kritické pripomienky.
Autorov pôvodné predloženej súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na autorov pôvodných predložených súbory pre obrazy. "Pôvodný súbor pre Obrázok 1 13071_2008_54_MOESM2_ESM.pdf autorského 13071_2008_54_MOESM1_ESM.pdf autorov pôvodného súboru na obrázku 2 pôvodného súboru 13071_2008_54_MOESM3_ESM.pdf autorského na obrázku 3 protichodnými záujmami
Autori vyhlasujú, že nemajú žiadne protichodné záujmy.

• Endoskopické uzavretie perforáciou žalúdočnou sondou s titánovými svorkami: správa o štyri prípad
• Obrovské žalúdočné bezoár spôsobené plástu, o neobvyklú komplikáciu zdravotného faddism: kazuistika