Protein uttrykk profilen til magebrems intestinalis larvene forårsaker hest mage larver og karakterisering av hest immun reaction

protein uttrykk profilen til magebrems intestinalis
larvene som forårsaker hest mage larver og karakterisering av hest immunreaksjon
Abstract
Bakgrunn
Lite informasjon er tilgjengelig på den immunologiske aspekter av parasittiske magebrems intestinalis
(Diptera, Oestridae) larvene forårsaker hest mage larver. Målene for denne forskningen var å analysere proteininnholdet av larver råolje ekstrakter av trekkende andre og tredje larver (L2 og L3) av G. intestinalis
for å karakterisere immunrespons av hester.
Resultater
Den proteomikk profilen til L2 og L3, undersøkt ved hjelp av ett og to dimensjonale tilnærminger, avslørte en vandringsmønster spesifikk for hver larvestadiet. Videre ble Western blot utført med hest sera og med sera fra Balb /c mus immunisert med larve grove ekstrakter av L2 eller L3, avslører en annen immunreaksjon i naturlig infiserte hester vs
. kunstig indusert immunreaksjon hos mus. Sammenlikninger av immunoavtrykket profiler viser at fasen L2 er mer immunogene enn de fasen L3 mest sannsynlig som en effekt av den høyeste enzymatisk produksjon av L2 mens migrering gjennom vertsvev. Femten proteiner ble identifisert ved massespektrometri.
Konklusjon
Dette arbeidet gir ytterligere informasjon i forståelse av samspillet mellom G. intestinalis
og deres vertskap og ved å bidra en roman ordning av proteomikk profilen til hovedlarve stadier.
bakgrunns
Ni arter av magebrems plakater (Diptera, Oestridae) har fluer blitt beskrevet som forårsaker, i larvestadiet, gastrointestinal larver i equids. Mens magebrems intestinalis plakater (De Geer, 1776) og magebrems nasalis product: (Linnaeus, 1758) er distribuert over hele verden og er ofte den eneste arten som er rapportert i mange deler av den nye verden, er de resterende artene bare rapportert i svært begrenset deler av Europa, østlige land [1] og Afrika [2]. Voksen bot fluer innskudd eggene sine på vertenes hår på forskjellige steder avhengig av arten av magebrems product: [3]. G. pecorum
er et unntak som hunnene legger eggene sine på gress, blader og stengler av planter [1]. Infeksjon oppstår når eggene er introdusert i hesten munn av dyret slikker og grooming. De første larvestadiet (L1) luker, begynner å migrere og skallskifte i det andre larvestadiet (L2) i munnhulen [4]. Larver av forskjellige arter av magebrems
er spesielt til stede i en eller flere områder av mage-tarmkanalen hvor den tredje larvestadiet (L3) forblir festet til slimhinnen i omtrent 8-10 måneder [5]. De kliniske tegn forbundet med migrasjons og modningsfasen av larvene er vanskelige å diagnostisere, men det har vist seg at forskjellige arter av magebrems
kan forårsake alvorlige skader i løpet av deres livssyklus [6-9].
På siste årenes studier om immunologi og immunpatologi av mange oestrid larver forårsaker larver har økt på grunn av sine viktige implikasjoner i diagnostikk og i vaksinasjonsprogrammer [10]. Mens immunologiske studier ble i hovedsak fokusert på Hypoderma
storfe grub infeksjon [11], og sauer nasal oestrosis av brunst ovis product: [12], immunologi av magebrems
spp. forårsaket larver fått liten oppmerksomhet. Det er også på grunn av de iboende vanskeligheter med å studere immunologiske vert-parasitt interaksjoner på den gastrointestinale mukosa grensesnittet. Som en konsekvens av dette, så langt ingen store immunogener er blitt rapportert [13]. En enkelt studie diskutert utvikling av antistoffer for diagnose av larver av G. intestinalis
larver selv om spesifisiteten av immunreaksjonen ikke ble testet i forekomsten av samtidig hest parasittinfeksjon [14]. Flere nylig, mange proteomikk-baserte analyser, kombinert med to-dimensjonal gel-elektroforese, har tilbudt en helhetlig tilnærming for å bedre forstå biologiske og immunologiske prosesser av patogener og sykdommer [15-17]. Målet med denne studien var å karakter L2 og L3 proteiner av G. intestinalis Hotell og å analysere immunresponsen av hester og immunisert mus mot larver antigener.
Resultater
1-D analyse av larve rå ekstrakt (LCE) L2 og L3
migrering lce2 på 1-D sølv-farget gel viste et bestemt mønster (figur 1A) med 14 band som ble isolert fra gelen for videre identifisering av massespektrometri (MS) ( tabell 1). Utvelgelsen av båndene var basert på intensiteten av båndet på sølvfarget gel, så vel som immuno-reaktivitet observert etter immunblotting med hesteserum (figur 1B) eller L2-mus serum (figur 1C). Tre proteiner i 4 av de 14 valgte båndene ga en signifikant poengsum (p 0,05), og ble identifisert som aktin (figur 1A, bånd 8), glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) (figur 1A, bånd 9) og hemoglobin (figur 1A, båndene 13 og 14). Et annet migrasjonsmønster ble observert for LCE3 på en D-sølv-farget gel (figur 1D). Analogt immunoblot ble utført med hesteserum (figur 1E) og sera fra L3-mus (figur 1F). Utvalget av 13 band, indikert med piler (figur 1D), var basert på de samme kriteriene som ovenfor. De ble isolert for videre identifisering av MS (tabell 2). Ti proteiner ut av de 13 valgte båndene ga en signifikant poengsum (p 0,05), og ble identifisert som alfakjeden av larveserumprotein (figur 1D, bånd 1-4), arylphorin (figur 1D, bånd 6), betakjede av larve serum protein (figur 1D, bandet 7), hemoglobin (figur 1D, band 10-12) og murein lipoprotein (figur 1D, bandet 13) .table en Massespektrometri identifisering av proteiner identifisert fra LCE av L2.
Band ID
Protein navn
Arter
Tiltredelse antall

MW (Da)
pI
Protein poengsum
8
Protein lik Actin-87e isoform 2
Drosophila melanogaster

AAM29410
37816
5,36
223
9
glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase
Drosophila hydei
S24630
35369
8,2
224
13
Hemoglobin
magebrems intestinalis
O96457
17912
8.44
440
14
Hemoglobin
magebrems intestinalis

O96457
17912
8.44
144
Spots oppdrag se Figur 1. Proteiner er nevnt er identifisert med en betydelig sannsynlighet poengsum på p < 0,05 i msdb.
Tabell 2 Massespektrometri identifisering av proteiner identifisert fra LCE av L3.
Band ID

Protein navn
Arter
Tiltredelse antall

MW (Da)
pI
Protein poengsum

1 Larve serum protein en alfa kjede forløper
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
92
2
Larve serum protein 1 alfakjeden forløper
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
89
3
Larve serum protein en alfa kjede forløper
Drosophila melanogaster

LSP1A_DROME
98802
5,72
98
4
Larve serum protein en alfa kjede forløper
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
102
6
Arylphorin underenhet A4 forløper
Calliphora vicina
ARY1_CALVI
92282
5,59
71
7
Larve serum protein en beta kjeden forløper
Drosophila melanogaster
LSP1B_DROME
95849
5,41
69
10
Hemoglobin
magebrems intestinalis
O96457
17912
8.44
247
11
Hemoglobin
magebrems intestinalis
O96457
17912
8.44
132
12
Hemoglobin
magebrems intestinalis
LPEBWM
17912
8.44
112
13
Major ytre membran lipoprotein forløper (Murein-lipoprotein)
Pectobacterium atrosepticum
LPP_ERWCT
8396
9,36
69
Spots oppdrag se Figur 1. Proteiner er nevnt er identifisert med en betydelig sannsynlighet poengsum på p < 0,05 (1, 2, 3, 4, 6, 7, 13: Expasy databasen, 10, 11, 12: msdb).
Figur 1 1-D analyse av LCE av L2 og L3. Representative 1-D sølv-farget gel av LCE av L2 (A) og L3 (D). Pilene viser båndene som ble valgt for massespektrometri. Western blot-analyse av L2 inkubert med hesteserum (B) og museserum (C). Western blot-analyse av L3 inkubert med hesteserum (E) og museserum (F). Proteinet identifikasjon av MS er presentert i tabell 1 og 2.
2-D analyse av LCE L2
protein migrering av LCE L2 på en 2-D-gel (figur 2A) viste tilstedeværelse av proteiner langs hele pH-spektrum. Western blot ble utført med L2-mus serum (figur 2B) og med hesteserum (figur 2C). Den sølvfarget gel ble brukt til å justere oppdaget protein flekker på begge Immunoblotanalyse profiler. Et større utvalg av immunreaktive proteiner ble observert på hesten immunoblot profil enn på den L2-mus immunblot. Sirklene viser 12 stedene som ble vurdert som immunreaktive med L2-mus serum (Figur 2A, flekker: 1, 2, 6, 8, 14-20, 25) og pilene indikerer 24 stedene som ble vurdert som immun reaktivt med hesteserum (figur 2A, flekker: 1-13 og 16-26). I alt 26 flekker valgt ut for MS-analyse (tabell 3). Blant de 26 utvalgte stedene, ble 7-proteiner hell identifisert (p < 0,05) ved MS: paramyosin (figur 2A, spot 1), serum albumin (figur 2A, spot 5), tubulin (figur 2A, spot 9), enolase ( Figur 2A, spot 11), tropomyosin (figur 2A, spot 14), GAPDH (figur 2A, spot 19) og hemoglobin (figur 2A, spot 20) .table 3 massespektrometrisk identifikasjoner av proteiner identifisert fra LCE av L2.
Spot ID
Protein navn
Arter
Tiltredelse antall

MW (Da)
pI
Protein poengsum
en
Paramyosin
Drosophila melanogaster
S22028
102277
5,5
97
5
Serum albumin forløper
Bos taurus
ABBOS
69225
5,8
99
9
Tubulin alfa-1-kjeden
Drosophila melanogaster
A26488
49876
5.0
260
11
enolase
Oryza sativa
Q7XBE4
47942
5,4
80
14
Tropomyosin
Drosophila melanogaster
C25242
32740
4,7
78
19
glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase
Drosophila hydei
S24630
35369
8,2
100
20
Hemoglobin
magebrems intestinalis
O96457
17912
8,4
209
Spots oppdrag se Figur 2. Proteiner er nevnt er identifisert med en betydelig sannsynlighet poengsum på p < 0,05 i msdb.
Figur 2 2-D analyse av LCE av L2. Sølv-farget representative 2-D protein kart over LCE av L2 bestående pH gradient 3-11 med MWS rangering 10-250 kd (A). Den sølvfarget gel ble anvendt til å justere detekterte proteinflekker på Western blot utført med serum fra mus immunisert med det LCE av L2 (B) og med hesteserum (C). Sirklene viser stedene som ble immunolabelled med mus serum (B; ble 1,2,6,8,14-19,25,26) og pilene viser stedene som ble immunolabelled med hesteserum (C; ble 1-13 og 16-26). Totalt 26 plasser ble isolert for ytterligere MS identifikasjon. Proteinet identifikasjon av MS er presentert i tabell 3.
2-D analyse av LCE L3
proteomikk profil av LCE L3 presentert på figur 3A viser at mesteparten av proteinene er plassert i en rekke basidic mellom pH 7-11. Western blot ble utført med L3-mus serum (figur 3B) og med hesteserum (figur 3C). Intensiteten av immunreaksjonen er forskjellig når det LCE av L3 er eksponert med L3-museserum eller med hesteserum, men immunoavtrykket profiler var lignende. Etter sammenligning av immunoblot med sølvfarget gel, ble 39 flekker, angitt ved sirkler valgt for ytterligere MS identifikasjon (tabell 4). 19 av de 39 isolerte flekker var tilfredsstillende identifisert (p 0,05), svarende til 8 forskjellige proteiner: filamin (figur 3A, lenger 1), varmesjokkprotein (HSP-70) (figur 3A, lenger 2), serumalbumin forløper (figur 3A, spot 3,18-20), fosfoenolpyruvat carboxykinase (PEPCK) (figur 3A, spot 8), enolase (figur 3A, spot 22,23), fumarase (figur 3A, spot 1), beta-aktin ( Figur 3A, spot 27), hemoglobin (figur 3A, spot 32-39) .table 4 massespektrometrisk identifikasjoner av proteiner identifisert fra LCE av L3.
Spot ID
Protein navn
Arter
Tiltredelse antall

MW (Da)
pI

Protein poengsum
en
Filamin en
Drosophila melanogaster
Q8T3K7
151931
5,72
76
2
Heat shock 70 kDa protein 70C
Drosophila melanogaster
HSP7A_DROME 70871
5,34
70
3
serumalbumin
Bos taurus

AAN17824
71274
5.82
171
8
fosfoenolpyruvat carboxykinase
Drosophila melanogaster
PPCK_DROME
71882
6.07
79
18
Serum albumin forløper
Bos taurus
ALBU_BOVIN 71244
5.82
108
19
Serum albumin forløper
Bos taurus

ALBU_BOVIN
71244
5.82
117
20
Serum albumin forløper
Bos taurus
ALBU_BOVIN 71244
5.82
165
22
enolase (fragment)
Drosophila subobscura
O44101
44548
5.92
142
23
enolase
Schistosoma mansoni

ENO_SCHMA
47421
6.18
163
24
Fumarase
Drosophila melanogaster
Q9VTI5
51239
8.47
111
27
Beta-aktin
Danio rerio
ACTB1_BRARE
42082
5,3
184
32
Hemoglobin
magebrems intestinalis

O96457
18026
8.44
95
33
Hemoglobin
magebrems intestinalis
O96457
18026
8.44
113
34
Hemoglobin
magebrems intestinalis
O96457
18026
8.44
131
38
Hemoglobin
magebrems intestinalis
O96457
18026
8.44
415
39
Hemoglobin
magebrems intestinalis
O96457
18026
8.44
410
Spots oppdrag referere til figur 3. Proteiner er oppført, er identifisert med en betydelig sannsynlighet poengsum på p < 0,05 (2, 8, 18, 19, 20, 23, 27: Expasy databasen, 1, 3, 22, 24, 32, 33, 34, 38, 39: msdb)
Figur 3 2-D-analyse av. den LCE av L3. Sølv-farget representative 2-D protein kart over LCE av L3 bestående pH gradient 3-11 med MWS rangering 10-250 kd (A). Den sølvfarget gel ble anvendt til å justere detekterte proteinflekker på Western blot utført med serum fra mus immunisert med det LCE av L3 (B) og med hesteserum (C). 39 flekker immunolabelled med både sera ble isolert for ytterligere MS identifikasjon. Proteinet identifikasjon av MS er presentert i tabell 4.
Diskusjon
sammenligning av vandringsmønstrene til lce2 og LCE3 i begge dimensjonsanalyse (1-D, 2-D), indikerer at larve proteintoksin profilen er iscenesette bestemt, og dermed tyder på en annen sammensetning i larve metabolisme og antigene egenskaper. De 1-D-sølv-farget geler av larve råekstrakter indikerte en meget tett konsentrasjon av proteiner; følgelig justeringen av immunreaktive band oppdaget av hest og mus kan utgjøre noen forskjeller. Den proteomikk tilnærmingen bekreftet spesifikt protein profilen til både larvestadier og tillot bedre identifisering av de forskjellige stedene.
Mus ble kunstig vaksineres mot en råprotein utdrag fra hele larver. Et stort antall proteiner som normalt ikke er direkte i kontakt med hester ble presentert for immunsystemet av musene. Videre, i motsetning til naturlig infeksjon utløsning av en hest immunreaksjon, subkutan injeksjon i mus induserer en systemisk immunreaksjon forskjøvet til en Th1 reaksjon av adjuvant. Denne forskjellen i immunreaksjon forklarer det faktum at det meste av L2 og L3 proteiner som reagerte med musesera viste et mer intenst signal sammenlignet med reaksjonen med hestesera. Siden livssyklusen til G. intestinalis
forekommer i mage-tarmkanalen hos hester, er det mukosale immunsystemet i kontakt med larver og dermed utsatt for utskilte eller utskilte stoffer i løpet av larve migrasjon og utvikling [18]. Selv L2 vandringsmønster fra munnen til magen er fortsatt uklart, kan immunreaksjon påvist i hester og eksperimentelt immuniserte mus tyder på at larvestadiet L2 besitter mer antigene proteiner enn larvestadiet L3, sannsynligvis nyttige for larve enzymatisk migrasjon [19]. Følgelig enolase ble identifisert ved MS og har tidligere blitt rapportert som et viktig enzym lokalisert på overflaten av flere patogener når invadere vev [20]. L2 er en scene å indusere en sterk vertens immunrespons, slik at utviklingen i L3 i magen kan være en forsvarsmekanisme for larvene å omgå hesten immunforsvaret. Omvendt, det faktum at L3 forblir festet i 8-10 måneder til veggen i magesekken antyder en hypometabolic status, eller redusert immunogene egenskaper. Dette kan forklare den svake immunreaksjon observeres i nærvær av hesteserum mot L3
. To viktige larve proteiner, arylphorin og LSP-2 (larveserumprotein), henholdsvis homologe til Calliphora vicina
og Drosophila melanogaster
, ble identifisert i den L3. I holometabolous insekter konstruksjonen av voksent vev under metamorfose krever en stor mengde energi. Det er kjent at før dannelsen av puparium, fett kroppens celler absorberer proteiner og andre makromolekyler som har akkumulert i den hemolymfe under larveforingsperioden [21]. Hovedfraksjonen av inkorporert protein består av arylphorins og LSP-2 [22]. I tillegg ble hemoglobin identifisert i begge larvestadier av G. intestinalis
. Dette rikelig og sirkulerende molekylet er til stede i svært tracheated celler som danner den bakre spiracular plate og lar larvene å gjøre bedre bruk av intermitterende kontakt når luft svelges med mat [23].
De fleste av de andre identifiserte proteiner i L2 (paramyosin , tubulin, tropomyosin, GAPDH og et protein som ligner aktin) eller i L3 (filamin, fumarase, PEPCK, HSP-70, enolase) deles med de av Drosophila
spp. som tyder på at strukturelle eller metabolske homologies eksisterer mellom disse artene.
løpet av denne forskningen, ulike tarmparasitter (Anoplocephala perfoliata
, Parascaris equorum
, Cyathostominae) var til stede samtidig med G. intestinalis
i mage -intestinal kanalen av slaktet hester. Risikoen for kryssreaktivitet har fortsatt å bli evaluert. Men i motsetning til enkelte immunologiske studier om tarm helminths i equids [24-26], kryssreaksjon mellom G. intestinalis Kjøpe og mage-tarmparasitter er ennå ikke undersøkt.
Dette arbeidet gir ytterligere informasjon i forståelsen av samspillet mellom G. intestinalis
og deres vertskap og ved å bidra en roman ordning av proteomikk-profil av de viktigste larvestadier. Således våre resultater viser videre kompleksiteten av denne vert-parasitt-interaksjon. Faktisk er denne studien viser nødvendigheten av å utvikle et pålitelig verktøy for å oppdage serologisk infisert hester, spesielt fordi de eneste midler for å detektere en G. intestinalis
infestasjon er ved obduksjon.
Identifikasjon av mesteparten av proteinene vil bli neste trinn å definere sin rolle, deres mobil eller vev lokalisering og deres potensielle antigene egenskaper.
Metoder
larvenes innsamling og antigen forberedelse
magebrems
spp. L2 og L3 var samlet inn fra pyloriske del av magen av hester stammer fra to gårder i distriktet den sveitsiske Jura; Delémont: N 47 ° 21 '; E 7 ° 20 ', Sveits. Samtidig ble mage-tarmkanalen til hvert dyr undersøkt og tilstedeværelsen av P. equorum
, A. perfoliata
og Cyathostominae ble observert i alle fall.
Alle larvene oppsamlet ble vasket i en steril fosfat -saltvannsbuffer (PBS 0,1 M, pH 7,2), identifisert som G. intestinalis
på grunnlag av morfologiske nøkler [1] og frosset ved -20 ° C.
for fremstilling av de larve råekstrakter, 10 L2 larver høstes på to forskjellige hester av en samme flokk, og sju L3 larver høstet på en hest som stammer fra andre flokken, ble ultralydbehandlet og homogenisert på is under sterile forhold. Homogenatet ble ekstrahert over natten i en 0,1 M pH 9,6 karbonat-buffer inneholdende 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid fluoridsaltet (PMSF) og 5 mM ethylenediamin tetraeddiksyre (EDTA) ved ytterligere tilsetning av 1 ml /gr av en protease-inhibitor (Sigma-Aldrich, Buchs, Sveits) . Ekstraktene ble sentrifugert ved 20'000 x g
i 30 minutter (4 ° C). Supernatanten inneholdende de antigenene ble oppsamlet og den endelige proteininnholdet bestemt ved spektroskopi (Bradford-metoden, BioRad). LCE ble lyofilisert og lagret ved -20 ° C hesteserum prøver
blodprøver.
Ble tatt på en gruppe på tyve hester som stammer fra de to gårder i det ovenfor beskrevne området. Selv om blodprøver og larve samling ikke kunne gjøres på de samme dyrene våre observasjoner gjort under en samtidig utført epidemiologisk undersøkelse (Roelfstra et al, in prep.), Herunder feltobservasjoner på levende dyr og i slakterier, bekreftet den høye endemicity av G. intestinalis
tidligere beskrevet av Brocard [19] i det samme området, og tillater oss å anta at alle hester som brukes i denne studien er infisert av G. intestinalis
. Fosterhesteserum ble brukt som en negativ kontroll for de vestlige blotter. Blodet ble sentrifugert ved 3500 x g
i 15 minutter ved romtemperatur og serumet ble lagret ved -20 ° C Immunisering av mus.
Og serumprøver
Balb /c-mus ble immunisert med LCE L2 (L2 mus) eller med LCE av L3 (L3 mus) fra G. intestinalis
. To gram L3 og to gram L2 ble sonikert, homogenisert i en steril PBS-buffer pH 7,2 og sentrifugert ved 20'000 x g
. Supernatanten ble deretter emulgert i like stort volum av Freunds ufullstendige adjuvans (Sigma-Aldrich, Buchs, Sveits)., En dose på 100 ug protein /mus i et volum på 200 ul ble injisert intramuskulært hver 2 uker via 6 uker. Dyrene ble tappet for blod syv uker etter den første immunisering. Kontrollmus ble inokulert med en kombinasjon av PBS og Freund ufullstendige adjuvans hver gang ovenfor. Samplet blod ble sentrifugert ved 3500 x g
i 15 minutter ved romtemperatur og sera lagret ved -20 ° C. Alle prosedyrer ble godkjent av den ansvarlige lokale komiteen på dyre eksperimenter.
En dimensjonal elektroforese (1-D)
Proteinene av L2 (5 mikrogram /brønn) og L3 (5 mikrogram /brønn) ble separert på gradient SDS siders geler (4-20%) under reduserende betingelser (2-β-merkaptoetanol, 95 ° C i 5 minutter). Elektroforese ble utført ved 80/100 V i 30 min /2 timer. Ett sett av gelene ble farget med sølv for massespektrometri, og den andre ble overført på nitrocellulosemembraner (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) for Western blot analyse.
Todimensjonal elektroforese (2-D)
Lyofilisert LCE prøvene ble oppløst i 2-DE lysebuffer (9 M urea, 2 M tiourea, 1% dithioerythriol, 4% CHAPS, 2,5 mM EGTA og 2,5 mM EDTA). Immobiline tørre strimler pH 3-11 ikke lineær, 11 cm (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) ble nedsenket over natten i lyseringsbuffer som inneholder 75 mikrogram protein prøven, ytterligere 1% Pharma pH 3-10 (GE Healthcare, Uppsala, Sverige), og 0,5% bromfenol blå. IEF på en Multiphor (GE Healthcare) for 15 kV · timer ved 20 ° C ble etterfulgt av separering på gradient SDS-PAGE-geler (9-15%) ved konstant 45 V pr gel. Ett sett av geler ble farget med sølv for MS og den andre ble overført på nitrocellulosemembraner (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) for Western blot-analyse.
Western blot analyse (WB)
Ikke-spesifikk binding ble blokkert med 1% polyvinylpyrrolidon i PBS-Tween i 1 time. Blottene ble deretter inkubert med primært antistoff i PBS-Tween (over natten ved 4 ° C, hesteserum eller musesera 1: 1000) og vasket. De immunoreaktive flekker ble påvist ved anvendelse av et geite-anti-mus IgG (H + L) (1: 20000, Nordic Immunology Laboratories, Tilburg, Nederland) eller et anti-hest IgG (1: 10000, Sigma-Aldrich, Buchs, Sveits) antistoff konjugert med pepperrot peroksidase. Signaler ble påvist med ECL (forbedret chemiluminescence) på Hyper ECL (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) [27]. Etter ECL deteksjon ble blotter deretter farget med kolloidalt gull for å matche de synlige flekker til generelle mønsteret på sølv-farget gels
. Massespektrometri (MS)
Utvalgte flekker ble kuttet ut fra 2-D gels, avfarget , behandles ved proteolyse med trypsin [28] og analysert ved hjelp av MALDI-TOF og MS /MS på en MALDI-TOF /TOF tandem-massespektrometer (ABI 4700 Proteomics Analyzer, Applied Biosystems). Kombinert PMF (peptid masse fingeravtrykk) og MS /MS-spørringer ble gjort med MASCOT © Database søkemotor v1.9 [29] (Matrix Science) innebygd i GPS-Explorer programvare (versjon 3.6, Applied Biosystems) på sveitsisk- Prot database (versjon 20051206, 201594 sekvenser, 73123101 rester) eller msdb (versjon 20040703, 1501893 sekvenser, 480537664 rester). Proteinidentifikasjon ble betraktet som positive (tabell 1, 2, 3 og 4) hvis (i) er sannsynligheten baserte MOWSE poengsum [30] oppnådd fra både MS og MS /MS-analyse var betydelig (dvs. Stillingen > 66 var signifikant ved p <0,05 for Expasy database, og scorer > 74 signifikant ved p < 0,05 for msdb database; konfidensintervall > 99% som gis av GPS explorer, versjon 3.6); (Ii) de samsvarende peptid-massene var rikelig i spekteret; og (iii) de teoretiske molekylvekt (MW) av de betydelige treff passe de eksperimentelle observerte verdier.
Erklæringer
Takk
Dette arbeidet ble støttet av SFB 571 stipend A5 Deeg. Forfatterne er takknemlige for Prof. D. Otranto og Prof. D.D. Colwell for sine kritiske kommentarer.
Forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes originale innsendte filer for bilder. 13071_2008_54_MOESM1_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 1 13071_2008_54_MOESM2_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 2 13071_2008_54_MOESM3_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 3 konkurrerende interesser
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser.

• Endoskopisk nedleggelse av mage tube perforeringer med titan klipp: en fire-kasuistikk
• Stor mage bezoar forårsaket av honeycomb, en uvanlig komplikasjon av helse faddism: en kasuistikk