Ekspresija proteina profil Gasterophilus intestinalis ličinki uzrokuje konj želuca napasnih i karakterizaciju konj immune reaction

ekspresije proteina profil Gasterophilus intestinalis pregled ličinke izazivaju konj želuca napasnih i karakterizaciju konja immune reakcije
apstraktne pregled pozadine
malo informacija je dostupan na imunološki aspekt parazitskih Gasterophilus intestinalis
(Diptera, Oestridae) ličinke uzrokuje konj želučane napasnih. Ciljevi ovog istraživanja bili su analizirati sadržaj proteina od ličinki ekstrakta sirove iz prelazi drugog i trećeg larvi (L2 i L3) od G. intestinalis pregled kako bi se okarakterizirali imunološki odgovor konja. Pregled Rezultati
proteomski profil L2 i L3, istražuje pomoću jednog i dvodimenzionalnih pristupe, otkrila je uzorak migracije specifične za svakog stadija. Nadalje, Western hibridizacija su provedene s konjskim serumom i serumu BALB /c miševa imuniziranih s larvnog ekstrakti krutog L2 ili L3, otkriva različite imunološke reakcije na prirodno zaraženih konja vs
. umjetno izazvano imunološku reakciju kod miševa. Usporedbe imunoblot profila pokazuju da u fazi L2 je djelotvorniji od stepenastog L3 najvjerojatniji kao učinak enzimatske najvišeg proizvodnju L2 dok prelazi preko tkiva domaćina. Petnaest proteini su identificirani masenom spektrometrijom. Pregled Zaključak pregled Ovaj rad pruža dodatne informacije u razumijevanju interakcije između G. intestinalis
i njihov domaćin i pridonoseći novi shemu proteomskog profila glavne ličinki faze. pregled pozadini pregled Devet vrsta Gasterophilus pregled (Diptera, Oestridae) muhe su opisani uzrok, u larve, gastrointestinalni napasnih u ekvida. Dok Gasterophilus intestinalis Netlogu (De Geer, 1776) i Gasterophilus nasalis pregled (Linnaeus, 1758) su distribuirani diljem svijeta, a često su jedina vrsta zabilježene u mnogim dijelovima Novog svijeta, preostale vrste iskazuju samo u vrlo ograničenom područja Europe, istočne zemlje [1] i Afrike. [2] Adult Bot muhe položiti svoja jaja na kosi domaćina na različitim mjestima, ovisno o vrsti Gasterophilus pregled [3]. G. pecorum pregled je iznimka, kao ženke polažu jaja na travu, lišće i stabljike biljaka [1]. Infekcija nastaje kada se jaja uvode u konjskim ustima od životinja lizanje i dotjerivanje. Prvi stadija (L1) grotla, počinje migracije i presvlačenja na drugu stadija (L2) u usnoj šupljini [4]. Ličinke različitih vrsta Gasterophilus pregled se specifično na jednom ili više područjima gastrointestinalnog sustava, gdje je treći stadija (L3) ostaje vezana na sluznicu oko 8-10 [5] mjeseci. Klinički znakovi povezani s migracijama i sazrijevanja faze ličinke su teško dijagnosticirati, no pokazalo se da su različite vrste Gasterophilus pregled može uzrokovati ozbiljne štete tijekom njihovog životnog ciklusa [6-9].
U posljednjih godina istraživanja koji se odnose na and Immunopathology mnogih oestrid napasnih uzrokuju ličinke su se povećale zbog njihovih važnih implikacija u dijagnostici i imunizacija programa [10]. Dok imunoloških istraživanja su uglavnom usmjerena na Hypoderma pregled stoke grub infekcije [11], i ovce nosne oestrosis by estrusa ovis Netlogu [12], Immunology of Gasterophilus pregled spp. izazvao napasnih dobila malo pažnje. To je i zbog neizbježnih poteškoća u proučavanju imunološke host-parazit interakcije na gastrointestinalne sluznice sučelja. Kao posljedica toga, za sada nema većih imunogena je opisano [13]. Jedna studija razgovarali o razvoju antitijela za dijagnozu napasnih G. intestinalis
ličinke, iako je Specifičnost imunosne reakcije nije testiran na pojavu istodobna konja parazitske infekcije [14]. U novije vrijeme, mnogi proteomika na bazi analize, u kombinaciji s dvodimenzionalne gel-elektroforeza, ponudio sveobuhvatan pristup kako bi se bolje razumjeti biološke i imunološke procese patogena i bolesti [15-17]. Cilj ovog istraživanja bio je okarakterizirati L2 i L3 proteine ​​G. intestinalis pregled i analizu imunološki odgovor konja i miševi imunizirani protiv ličinki antigene. Pregled Rezultati
1-D analizu ekstrakta ličinki sirove (LCE) od L2 i L3 je pregled migracije od LCE2 na 1-D srebrno obojenog gela pokazala određeni uzorak (Slika 1A), sa 14 trakama koje su izolirani iz gela za daljnje identifikacije masenom spektrometrijom (MS) ( tablica 1). Izbor vrpci na temelju intenziteta vrpce na srebrnom obojenog gela, kao i imuno-reaktivnost može uočiti nakon imunoblota sa konjskog seruma (Slika 1B) ili L2-serumu miševa (Slika 1C). Tri proteina kod 4 od 14 odabranih pojasevima dao značajan rezultat (p < 0.05) i identificirani kao aktina (Slika 1A, pojas 8), gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) (Slika 1A, sastav 9) i hemoglobin (Slika 1A, trake 13 i 14). Drugačiji migracija slika je zabilježena za LCE3 na 1-D srebrno obojenog gela (Slika 1D). Analogno, imunoblot provodi se s konjskim serumom (Slika 1E) i seruma L3-miševa (Slika 1F). Izbor od 13 bendova, označene sa strelicama (Slika 1D), bio je zasnovan na istim kriterijima kao što je gore. Bili su izolirani za daljnje identifikacije MS (Tablica 2). Deset proteina od 13 odabranih bendova dao značajan rezultat (p < 0,05), a identificirani su kao alfa lanac ličinki serum proteina (Slika 1D, bendova 1-4), arylphorin (Slika 1D, band 6), beta lanca od ličinki serum proteina (slika 1D, band 7), hemoglobin (Slika 1D, bendova 10-12) i murein lipoproteina (Slika 1D, bend 13) .table 1 Masena spektrometrija identifikacije proteina identificiranih iz LCE L2. pregled band ID-
ime Protein
vrsta
broj Pristupanje pregled
MW (da)
pl
Protein ocjena
8 pregled protein sličan Actin-87e izoforme 2 pregled, Drosophila melanogaster pregled pregled AAM29410 pregled, 37.816 pregled 5,36 pregled 223 pregled devet pregled gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze pregled Drosophila hydei
S24630
35369
8.2
224 pregled 13 pregled hemoglobin pregled Gasterophilus intestinalis
O96457
17.912
8.44 pregled 440 pregled 14 pregled hemoglobin pregled Gasterophilus intestinalis
pregled O96457
17.912
8.44 pregled 144 pregled Mjesta zadaci odnose se na slici 1. Proteini navedene su identificirani sa značajnim rezultatom vjerojatnosti za p < 0.05 u MSDB. Pregled Tablica 2. Masena spektrometrija identifikacija proteina identificiranih iz LCE od L3. Pregled Band ID pregled pregled ime Protein
vrsta
pristupni broj

MW (DA)
pl

Protein rezultat
pregled 1 pregled larvi serum proteina 1 alfa lanac prethodnik pregled Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98.802
5,72 pregled 92
2 pregled, larvi serum proteina 1 alfa lanac prethodnik pregled Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98.802
5,72 pregled 89 pregled 3 pregled ličinki proteina u serumu jedan alfa lanac prethodnik
Drosophila melanogaster pregled
LSP1A_DROME pregled 98.802
5,72 pregled 98
4 pregled larvi proteina u serumu jedan alfa lanac prethodnik pregled Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98.802 pregled 5,72
102 pregled 6 pregled Arylphorin podjedinica A4 prethodnik pregled Calliphora VICINA
ARY1_CALVI
92.282
5,59 pregled 71 pregled 7 pregled larvi serum proteina 1 beta lanac prethodnik pregled Drosophila melanogaster
LSP1B_DROME
95.849
5,41 pregled 69 pregled, 10 pregled Hemoglobin pregled Gasterophilus intestinalis
O96457 pregled 17.912 pregled 8.44 pregled 247 pregled 11 pregled Hemoglobin pregled Gasterophilus intestinalis
O96457
17.912
8.44 pregled 132 pregled 12 pregled Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
LPEBWM
17.912
8.44 pregled 112 pregled 13 pregled Major vanjska membrana lipoproteina prekursor (Murein-lipoprotein) pregled Pectobacterium atrosepticum
LPP_ERWCT
8396 pregled 9,36
69 pregled Mjesta zadaci odnose se na slici 1. Proteini navedene su identificirani sa značajnim rezultatom vjerojatnosti za p < 0,05 (1, 2, 3, 4, 6, 7, 13: Expasy baze, 10, 11, 12: MSDB).
Slika 1 1 D analizu LCE L2 i L3. Predstavnik 1-D srebrno-obojeni gel LCE L2 (A) i L3 (D). Strelice označavaju bendova koji su odabrani za masene spektrometrije. Western blot analiza L2 inkubira s konjskog seruma (B) i mišji serum (C). Western blot analiza L3 inkubira s konjskog seruma (E) i mišjeg seruma (F). Identifikacija protein MS prikazana je u tablici 1 i 2. pregled 2-D analiza LCE L2
migraciju proteina od LCE L2 na 2-D gelu (Slika 2A), pokazala prisutnost proteini duž cijelog pH spektra. Western hibridizacija su provedene s L2-serumu miševa (Slika 2B) i konjskog seruma (Slika 2C). Gel srebro umrljan je korišten uskladiti uočene proteinske mrlje na obje imunoblot profila. Veći raspon imuno-reaktivnog proteina zabilježena je na konju imunoblot profilu nego na L2-miševa imunoblot. Krugovi 12 točaka koje su smatraju imunoreaktivnom s L2-serumu miševa (slika 2a, mrlje: 1, 2, 6, 8, 14-20, 25) i strelice označavaju 24 točaka koje su smatraju imunološki reaktivni s konjskog seruma (slika 2A, točke: 1-13 i 16-26). Ukupno 26 točaka su odabrani za MS analizom (Tablica 3). Među 26 odabranih mjestima, 7 proteini su uspješno prepoznaje (p < 0.05) MS: paramyosin (Slika 2A, točke 1), serumski albumin (Slika 2A, točka 5) tubulina (Slika 2A, točka 9), enolaze ( Slika 2A, uočiti 11), tropomyosin (slika 2A, uočiti 14), GAPDH (slika 2A, mjesto 19) i hemoglobin (slika 2A, uočiti 20) .table 3 masene spektrometrije identifikacija proteina identificiranih iz LCE L2.
ID mjesta
ime Protein
vrsta
pristupni broj pregled
MW (DA)
pl
Protein ocjena
1 pregled Paramyosin pregled Drosophila melanogaster
S22028
102.277 pregled 5.5 pregled 97 pregled 5 pregled serum albumin prethodnik pregled Bos taurus
ABBOS
69.225 pregled 5.8 pregled, 99 pregled, 9
tubulina alfa-1 lanac pregled Drosophila melanogaster
A26488
49876 pregled 5.0 pregled 260 pregled 11
enolaza pregled Oryza sativa
Q7XBE4 pregled, 47.942 pregled 5.4 pregled, 80 pregled, 14 pregled Tropomyosin pregled Drosophila melanogaster
C25242
32.740 pregled 4.7 pregled 78 pregled 19
gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze pregled Drosophila hydei
S24630
35.369 pregled 8.2 pregled 100 pregled 20
hemoglobina pregled Gasterophilus intestinalis
O96457 pregled 17.912 pregled 8.4 pregled 209 pregled Mjesta zadaci odnose se na slici 2. Proteini navedene su identificirani sa značajnim rezultatom vjerojatnosti za p < 0.05 u MSDB.
Slika 2 2-D analizu LCE L2. Silver umrljan reprezentativni 2-D protein karta od LCE od L2 koja sadrži gradijent pH od 3 do 11 sa MWs rang od 10 do 250 kDa (A). Gel srebro umrljan je korišten uskladiti uočene proteinske mrlje na Western blot izvode s serumu miševa imuniziranih s LCE L2 (b) i sa konjskom serumu (C). Krugovi ukazuju na mjesta koja su immunolabelled s serumu miševa (B, vidio 1,2,6,8,14-19,25,26) i strelice označavaju točke koje su immunolabelled s konjskom serumu (C; vidio 1-13 i 16-26). Ukupno 26 točaka izolirane su za daljnje MS identifikaciju. Identifikacija proteina od MS-a prikazan je u tablici 3. pregled 2-D analiza LCE od L3
proteomskog profila LCE od L3 prikazan je na slici 3A pokazuje da je većina proteina nalazi u basidic rasponu između pH 7-11. Western hibridizacija su provedene s L3-serumu miševa (Slika 3B) i konjskog seruma (Slika 3C). Intenzitet imunoreakcija razlikuje kada LCE od L 3 je izložen s L3-serumu miševa ili konjskog seruma, ali imunoblot profili su slični. Nakon usporedbe imunobugačenja sa srebrno obojenog gela, 39 spotova koje ukazuje krugovi su odabrani za daljnju identifikaciju MS (Tablica 4). 19 od 39 izoliranih mrlja uspješno su identificirane (p 0,05), što odgovara 8 različitih proteina: filamin (slika 3A, spot 1), protein toplinskog šoka (hsp 70) (Slika 3A, točka 2), serumski albumin prekursor (slika 3A, mjesto 3,18-20), fosfataze karboksikinaze (PEPCK) (Slika 3A, točka 8), enolaza (slika 3A, mjesto 22,23), fumarase (slika 3A, točka 1), beta-aktin ( Slika 3A, uočiti 27), hemoglobin (slika 3A, mjesto 32-39) .table 4 masene spektrometrije identifikacije proteina identificiranih iz LCE od L3. pregled ID mjesta
ime Protein
vrsta
pristupni broj

MW (DA)
pl

Protein ocjena
1 pregled Filamin 1 pregled Drosophila melanogaster
Q8T3K7 pregled 151.931
5,72 pregled 76 pregled 2
Toplinski šok 70 kDa protein 70C pregled Drosophila melanogaster
HSP7A_DROME
70.871
5,34 pregled 70 pregled 3
serumski albumin pregled Bos taurus pregled
AAN17824 pregled 71.274
5,82 pregled 171 pregled osam pregled fosfoenolpiruvat karboksikinaze pregled Drosophila melanogaster
PPCK_DROME
71.882
6,07 pregled 79
18 pregled, serum albumin prethodnik pregled Bos taurus
ALBU_BOVIN
71.244
5,82 pregled 108 pregled 19 pregled, serum albumin prethodnik pregled Bos taurus pregled pregled ALBU_BOVIN
71244
5,82 pregled 117 pregled 20 pregled, serum albumin prethodnik pregled Bos taurus
ALBU_BOVIN
71.244
5,82 pregled 165 pregled, 22 pregled enolaza (Ulomak) pregled Drosophila subobscura
O44101
44.548
5.92 pregled 142 pregled 23 pregled enolaza pregled Schistosoma mansoni
pregled ENO_SCHMA
47.421
6.18 pregled 163 pregled 24 pregled Fumarase pregled Drosophila melanogaster
Q9VTI5
51.239
8.47 pregled 111
27 pregled Beta-aktin pregled Danio rerio
ACTB1_BRARE
42.082 pregled 5.3 pregled 184 pregled 32 pregled Hemoglobin pregled Gasterophilus intestinalis pregled
O96457 pregled 18.026
8.44 pregled 95 pregled, 33 pregled Hemoglobin pregled Gasterophilus intestinalis
O96457
18.026
8.44 pregled 113
34 pregled hemoglobin pregled Gasterophilus intestinalis
O96457
18.026
8.44 pregled 131 pregled 38 pregled hemoglobin pregled Gasterophilus intestinalis
O96457
18.026 pregled 8.44 pregled 415 pregled 39 pregled Hemoglobin pregled Gasterophilus intestinalis
O96457
18.026
8.44 pregled 410 pregled Mjesta zadaci odnose se na Slika 3. Proteini popisane su identificirani sa značajnim rezultatom vjerojatnosti pri p < 0,05 (2, 8, 18, 19, 20, 23, 27: Expasy baza podataka, 1, 3, 22, 24, 32, 33, 34, 38, 39: MSDB)
Slika 3 2-D analizu. LCE od L3. Silver umrljan reprezentativni 2-D protein karta od LCE od L3 koja sadrži gradijent pH od 3 do 11 sa MWs rang od 10 do 250 kDa (A). Gel srebro umrljan je korišten uskladiti uočene proteinske mrlje na Western blot izvode s serumu miševa imuniziranih s LCE od L3 (b) i sa konjskom serumu (C). 39 spotova immunolabelled s serumu su izolirani za daljnje MS identifikaciju. Identifikacija proteina od MS-a prikazan je u tablici 4. pregled Rasprava pregled usporedbe migracijskih obrazaca na LCE2 i LCE3 u oba dimenzionalne analize (1-D i 2-D), ukazuje na to da ličinki proteinske profil fazi specifičan, što upućuje na drugačiji sastav u ličinki metabolizam i antigenske osobine. 1-D srebrno obojenog gela ekstrakata ličinačkom sirove pokazala vrlo gusta koncentracija proteina; time i usklađivanje imuno-reaktivni bendova otkrivenih konja i miševa može predstaviti neke razlike. Proteomic pristup potvrdio je određeni profil proteina oba ličinki i dopustio bolje prepoznavanje različitih mjesta.
Miševi su umjetno cijepljeni protiv ekstraktom sirovih proteina iz cijelog ličinki. Veliki broj proteina koji obično nisu u direktnom kontaktu sa konja su predstavljeni imunom sustavu miševa. Nadalje, za razliku od prirodne infekcije izazivanja konja imunološku reakciju, potkožnom injekcijom kod miševa inducira sistemski imuni reakcija usmjerena na Th1 odgovora pomoćnog sredstva. Ova razlika u imunološku reakciju objašnjava činjenicu da je većina od L2 i L3 proteina koji reagiraju s miševima serumi pokazuju intenzivniji signala u usporedbi s reakcijom s konjskom serumu. Od ciklusa G. intestinalis pregled događa u gastrointestinalnom traktu konja je mukozni imuni sustav je u kontaktu s larvi i tako izložen izlučuju ili izlučenih tvari tijekom ličinki migracija i razvoja [18]. Iako L2 migracije obrasce od usta do želuca ostaje nejasno, imuna reakcija otkrivena u konja i eksperimentalno imuniziranih miševa može predložiti da larve L2 posjeduje više antigenske proteine ​​od larve L3, vjerojatno korisna za ličinki enzimskog migracije [19]. S tim u skladu, enolaze je identificiran pomoću MS i koja je prijavljena kao važan enzim lokaliziran na površini više patogena kada napada tkiva [20]. L2 je pozornica izazivanje snažan odgovor imunog sustava domaćina tako da je njegov razvoj u L3 u želucu može biti obrambeni mehanizam ličinki zaobići konja imuni obranu. S druge strane, činjenica da se L3 ostane vezana za 8-10 mjeseci stijenke želuca sugerira hypometabolic status, ili smanjenje imunogene osobine. To se može objasniti slab imunološki reakcije promatrane u prisutnosti konjskog seruma protiv L3. Pregled, dva važna larve proteine, arylphorin i KL-2 (larvi serum protein), odnosno homologni za Calliphora VICINA
i Drosophila melanogaster
identificirani su u L3. U holometabolous insekata izgradnja tkivima odraslih tijekom metamorfoze zahtijeva veliku količinu energije. Poznato je da se prije formiranja puparium, mast stanice tijela reapsorpcije proteine ​​i druge makromolekule koje su stvorene u haemolymph u ličinki hranjenja razdoblja [21]. Najveći dio ugrađenih proteina sastoji se od arylphorins i LSP-2 [22]. Osim toga, hemoglobin je identificiran u oba ličinki G. intestinalis Netlogu. Ova bogata i kruži molekula je prisutan u vrlo tracheated stanica formira stražnji spiracular ploču i omogućuje ličinke kako bi mogao bolje koristiti isprekidanog kontakta, kada se zrak proguta s hranom [23].
Većina ostalih identificiranih proteina u L2 (paramyosin , tubulin, tropomyosin, GAPDH i protein sličan aktin) ili u L3 (filamin, fumarase, PEPCK, HSP-70, enolaza) dijeli se s onima Drosophila pregled spp. upućuje na to da strukturni ili metaboličkih homologije postoje između ovih vrsta.
Tijekom ovog istraživanja, različiti crijevni paraziti (Anoplocephala perfoliata pregled, Parascaris equorum pregled, Cyathostominae) bili su istodobno prisutne G. intestinalis
u gastro -intestinal trakt od zaklanih konja. Rizik od unakrsne reaktivnosti još uvijek se ocjenjuju. Ali za razliku od nekih imunoloških studija o crijevnim helminta u ekvida [24-26], cross-reaktivnost između G. intestinalis pregled i gastrointestinalne parazite još nije studirao.
Ovaj rad pruža dodatne informacije u razumijevanju interakcija G. intestinalis
i domaćin i doprinoseći novu shemu proteomskog profila glavnih ličinki. Tako su naši rezultati dalje pokazuju složenost ove domaćina parazit interakcije. Doista, ovo istraživanje upozorava da je potrebno da se razvije pouzdanu serološko alat za otkrivanje zaražene konje, osobito zato što je jedini način za otkrivanje G. intestinalis pregled zaraza je po autopsije.
Identifikaciju većine proteina će biti sljedeći korak je definirati svoju ulogu, svoj stanični ili tkiva lokalizaciju i njihove potencijalne antigena svojstva.
Metode
pripremu ličinki prikupljanja i antigena
Gasterophilus pregled spp. L2 i L3 su prikupljeni iz pyloric dijela trbuha konja koji potječu iz dvaju gospodarstava nalazi se u okrugu Švicarske Jura; Delémont: N 47 ° 21 '; E 7 ° 20 ', Švicarska. Istovremeno, gastro-intestinalni trakt od svake životinje ispitana i prisustvo P. equorum
, A. perfoliata
i Cyathostominae zabilježen je u svakom slučaju.
Sve larve prikupi se isperu sterilnom fosfata slanom puferu (PBS 0.1 M, pH 7.2), identificirane kao G. intestinalis
temeljem morfoloških ključeva [1] i zamrznuti na -20 ° C.
Za pripravu ekstrakata larvnog nepročišćenih, 10 L2 ličinke dobivenih na dva različita konji istog stada, te sedam L3 larvi ubranih na jednog konja, koja potječe iz drugog stada, se podvrgavaju ultrazvuku i homogenizirano na ledu u sterilnim uvjetima. Homogenat je ekstrahiran preko noći u 0,1 M pH 9,6 karbonatnom puferu koji sadrži 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF) i 5 mM ethylenediamin tetraoctenu kiselinu (EDTA), daljnjim dodavanjem 1 ml /gramu inhibitora proteaze (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) , Ekstrakti su centrifugirani na priređeni 20000 × g tijekom 30 minuta
(4 ° C). Supernatant koji sadrži antigene je sakupljena i konačni sadržaj proteina određuje spektrometrije (Bradford metodom, BioRad). LCE je liofilizirana i pohranjeni na -20 ° C. Pregled, konj uzorcima seruma
Uzorci krvi uzeti su na skupini od dvadeset konja koji potječu iz dviju farmi u gore opisanom području. Iako su uzorci krvi i ličinki skup ne može biti na istim životinjama naša promatranja napravljene tijekom istovremeno obavlja epidemiološkoj procjeni (Roelfstra et al, u prep.), Uključujući i terenskih opažanja o živim životinjama iu klaonicama, potvrdio je visoku razinu endemicity od G. intestinalis pregled prethodno opisani Brocard [19] u istom prostoru i omogućiti nam da pretpostavljamo da su svi konji koji se koriste u ovom istraživanju napadnuta od G. intestinalis Netlogu. Seruma konjskog seruma je korištena kao negativna kontrola za Western blot. Krv se centrifugira na 3500 × g
15 minuta na sobnoj temperaturi, a serumi su čuvani na -20 ° C. Pregled Imunizacija miševa i uzoraka seruma
Balb /c miševi su imunizirani s LCE L2 (L2 miševi) ili s LCE od L3 (L3 miševa) iz G. intestinalis Netlogu. Dva grama L3 i dva grama L2 su sonificirane, homogenizirano je u sterilnom PBS puferu pH 7,2 i centrifugirana na priređeni 20000 × g pregled. Supernatant se zatim emulgira u jednakom volumenu Freundovim nepotpunim adjuvantom (Sigma-Aldrich, Buchs, Švicarska).
Doza od 100 ug proteina /miš, u volumenu od 200 ul, injicira se po intramuskularno svaka 2 tjedna do 6 tjedana. Životinjama je uzimana krv sedam tjedana nakon prve imunizacije. Kontrolni miševi su inokulirani s kombinacijom PBS i Freundovim nepotpunim adjuvantom svaki put gore. Uzorkovana krv se centrifugira na 3500 × g
tijekom 15 minuta na sobnoj temperaturi i seruma pohranjeni su na -20 ° C. Svi postupci su odobreni od strane nadležnog mjesnog odbora na životinjama eksperimentiranja.
Jednodimenzionalnih elektroforeze (1-D)
proteinima L2 (5 ug /) i L3 (5 ug /) su odvojeni na gradijentu SDS -PAGE gelovi (4-20%) u reducirajućim uvjetima (2-β-merkaptoetanola, 95 ° C tijekom 5 min). Elektroforeza je provedena na 80/100 V za 30 min /2 sata. Jedan set gelova je označena sa srebrom za masenu spektrometriju, a drugi je prebačen na nitroceluloze membranama (GE Healthcare, Uppsala, Švedska) za Western blot analize. Pregled, dvodimenzionalna elektroforeza (2-D) pregled, liofilizirane LCE uzorci su otopljen u 2-DE lizirajućeg pufera (9 M uree, 2M tioureje, 1% dithioerythriol, 4% CHAPS, 2.5 uM EGTA i 2.5 uM EDTA). Immobiline suhe trake pH 3-11 nelinearno, 11 cm (GE Healthcare, Uppsala, Švedska) uronjeni su preko noći u puferu za lizu koji sadrži uzorak proteina 75 ug, dodatnih 1% Pharmalyte pH 3-10 (GE Healthcare, Uppsala, Švedska) i 0,5% bromfenol plava. IEF na Multiphor (GE Healthcare) 15 kV · h na 20 ° C nakon čega slijedi odvajanje na gradijent SDS-PAGE gela (9-15%) na konstantnoj 45 V po gelu. Jedan set gelova je označena sa srebrom za MS, a druga je prebačen na nitroceluloze membranama (GE Healthcare, Uppsala, Švedska) za Western blot analize. Pregled, Western blot analiza (WB) pregled, nespecifično vezanje blokirano je 1% polivinilpirolidona u PBS-Tween kroz 1 sat. Blotovi su zatim inkubirane s primarnim protutijelom u PBS-Tween (preko noći na 4 ° C, konj serumima ili serum miševa 1: 1000) i ispere. Imunoreaktivni mrlje su detektirane kozjim anti-IgG-a (H + L) (1: 20000, nordijsko Immunology Laboratories, Tilburg, Nizozemska) ili anti-konja IgG (1: 10000, Sigma-Aldrich, Buchs, Švicarska) protutijelo konjugirano s peroksidazom iz hrena. Signali su otkrivena s ECL (hemiluminiscencija) na Hyperfilm ECL (GE Healthcare, Uppsala, Švedska) [27]. Nakon otkrivanja ECL, a mrlje su naknadno obojeni koloidno zlato kako bi se utakmica vidljive mrlje na ukupni uzorak na srebro-obojeni gel. Pregled Masena spektrometrija (MS) pregled Izabrani mrlje izdvojeni su iz 2-D gelovi, obezbojena , obrađuje proteolize sa tripsin [28] i analizirani pomoću MALDI-TOF i MS /MS na MALDI-TOF /TOF tandem masenom spektrometru (ABI 4700 Proteomika Analyzer, Applied Biosystems). Kombinirani PMF (peptid masa otisak prsta) i MS /MS postavljala su učinili s maskotom © v1.9 baze podataka pretraživač [29] (Matrix Science) ugrađen u GPS-Explorer (verzija 3.6 Applied Biosystem) na Švicarske Prot baze podataka (verzija 20051206; 201594 sekvence; 73123101 ostataka) ili MSDB (verzija 20040703, 1501893 sekvence, 480537664 ostataka). Identifikacija proteina se smatra pozitivnim (Tablice 1, 2, 3 i 4) ako (i) vjerojatnost bazi MOWSE ocjena [30] koji je dobiven iz oba MS i MS /MS analize bio je značajan (tj rezultati su > 66 bili su značajni pri p <0.05 za Expasy bazi podataka, te mnogi > 74 značajni pri p < 0,05 za MSDB baze podataka, interval pouzdanosti 99% kao što je navedeno od strane GPS Explorer, verzija 3.6); (Ii) podudaraju peptida mase su u izobilju u spektru; i (iii) da su teoretski molekularne težine (MW) značajnih hitova stane eksperimentalne promatrane vrijednosti. pregled Izjave pregled Zahvale
Ovaj rad je podržan od strane SFB 571 grant A5 Deeg. Autori su zahvalni prof D. Otranto i prof d.d. Colwell za svoje kritične komentare.
Autora originalne dostavljeni datoteke za slike
Ispod su linkovi na autora originalnih dostavljenih datoteka za slike. 13071_2008_54_MOESM1_ESM.pdf autora izvorna datoteka za Slika 1 13071_2008_54_MOESM2_ESM.pdf autorskim izvorne datoteke za sliku 2 13071_2008_54_MOESM3_ESM.pdf autorskim izvorne datoteke na Slici 3 suprotstavljenih interesa
Autori izjavljuju da nemaju konkurentne interese. Pregled

• Endoskopska zatvaranje perforacije želučane cijevi sa titan isječaka: Izvješće četiri slučaja
• Ogroman želuca bezoar uzrokovane saću, neobična komplikacija zdravstvenog faddism: slučaj report