Baltymų raiška profilis gasterophilus intestinalis lervos sukelia arklių skrandžio myiasis ir charakterizavimas arklių imuninės reakcijos

Baltymų raiška profilis gasterophilus intestinalis
lervos sukelia arklių skrandžio myiasis ir charakterizavimas arklių imuninės reakcijos pervežimas tezės
Background
Mažai informacijos apie imunologinio aspektu parazitinių gasterophilus intestinalis
(dvisparnių, Oestridae ) lervos sukelia arklių skrandžio myiasis. Šio tyrimo tikslas buvo išanalizuoti baltymų kiekis lervų žalios ekstraktų migruojantiems antrosios ir trečiosios lervų (L2 ir L3) G. intestinalis
siekiant apibūdinti imuninį atsaką arklius.
Rezultatai
apie PROTEOMIKOS profilis L2 ir L3, tiriamas naudojant vieną ir dvimačių metodus, atskleidė migracijos modelį, būdingą kiekvienam lervų stadijoje. Be to, Vakarų dėmės buvo atliekami su arklių serumo ir serume Balb /c pelių paskiepytų su lervų žalios ekstraktų L2 arba L3, atskleisti kitą imuninę reakciją natūraliai užsikrėtusių arklių vs
. dirbtinai sukelta imuninė reakcija pelių. Iš immunoblot profilių palyginimai rodo, kad etapas L2 yra labiau imunogeniška nei scenos L3 labiausiai tikėtiną, kaip aukščiausios fermentinio gamybos L2, o migruoja per šeimininko audinių poveikis. Penkiolika baltymai buvo nustatyti masių spektrometrijos.
Išvada
šis darbas suteikia papildomos informacijos, į tarp G. intestinalis parsisiųsti ir jų priimančiosios sąveikos supratimą ir prisidėti romaną schema PROTEOMIKOS profilio pagrindinėje lervų etapai.
fone
Devyni rūšių gasterophilus
(dvisparnių, Oestridae) musės buvo aprašyta sukelia, o lervų stadijoje, virškinimo myiasis į equids. Nors gasterophilus intestinalis
(De Geer, 1776) ir gasterophilus nasalis
(Linnaeus, 1758) yra platinami visame pasaulyje ir dažnai vienintelė rūšis, apie kuriuos pranešta daugelyje Naujojo pasaulio, likusios rūšys pranešė tik labai ribotas vietovių Europoje, Rytų [1] šalių ir Afrikoje [2]. Suaugusiųjų Bot musės deponuoti savo kiaušinius ant šeimininkų plaukų skirtingose ​​vietose, priklausomai nuo gasterophilus
rūšių [3]. G. pecorum
yra išimtis, nes moterys dėti kiaušinius ant žolės, lapų ir stiebų augalų [1]. Infekcija pasireiškia, kai kiaušiniai yra įtraukta į arklių burną gyvūnų lyžis ir viliojimo. Pirmieji lervų stadijos (L1) liukai, pradeda migruoti ir šėrimosi į antrąjį lervų stadijoje (L2) burnos ertmės [4]. Lervų įvairių rūšių gasterophilus
yra konkrečiai viename ar keliuose regionuose, virškinimo trakto, kur trečia pagal lervų etapas (L3) lieka prikibusi vartoti per gleivinę, maždaug 8-10 mėnesių [5]. Klinikiniai požymiai, susiję su migracijos ir brendimo stadijų lervos yra sunku diagnozuoti, bet tai buvo įrodyta, kad skirtingų rūšių gasterophilus
gali sukelti sunkių nuostolius per jų gyvavimo ciklą [6-9].
Į per pastaruosius metus studijų, susijusių su imunologija ir immunopathology daugelio oestrid myiasis sukelia lervų padidėjo, nes jų didelę reikšmę diagnozuojant ir imunizacijos programas [10]. Nors imunologiniai tyrimai daugiausia dėmesio skiriama hipoderma
galvijų grub infekcijos [11], avių nosies oestrosis iki rujos abortus
[12], iš gasterophilus
spp imunologijos. sukelia myiasis gavo mažai dėmesio. Tai taip pat dėl ​​to, kad yra nepaprastai sunku mokytis imunologinių parazitams-šeimininko sąveikos tuo virškinimo trakto dalies gleivinę sąsaja. Kaip pasekmė, iki šiol nebuvo nustatyta jokių didelių Imunogenai [13]. Vienas tyrimas aptarė antikūnų už myiasis diagnozę G. intestinalis
lervų nors imuninės reakcijos specifiškumą nebuvo išbandyta kartu arklių parazitinės infekcijos [14] atsiradimo. Visai neseniai, daugeliui proteomiką pagrindu analizė, kartu su dvimatis gelio elektroforezės, pasiūlė visapusišką požiūrį, siekiant geriau suprasti biologinius ir imunologinius procesus patogenų ir ligų [15-17]. Šio tyrimo tikslas buvo apibūdinti L2 ir L3 baltymus G. intestinalis parsisiųsti ir analizuoti imuninį atsaką arklių ir imunizuoto peles nuo lervų antigenus.
Rezultatai
1-D analizės lervų žalios ekstraktu (LCE) L2 ir L3
migracija LCE2 dėl 1-d sidabro tamsintas gelio parodė konkretų modelį (1a paveikslas) su 14 juostų, kurios buvo išskirtas iš gelio tolesniam identifikavimui masių spektrometrijos (MS) ( 1 lentelė). Iš juostų pasirinkimas buvo pagrįstas juostos dėl sidabro nudažomi gelio intensyvumo, taip pat imuno-reaktyvumo, pastebėta po imunoblotingo su arklių serumo (1B pav) arba L2-pelių kraujo serume (1C pav). Trys baltymai 4 iš 14 atrinktų juostų davė didelį skirtumą (p < 0,05) ir buvo nustatyta, kad aktino (1a pav band 8), gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) (1A pav, juosta 9) ir hemoglobino (1A pav juostos 13 ir 14). Kitoks migracijos modelis buvo pastebėtas už LCE3 dėl 1-D sidabro tamsintas gelio (1d pav.) Analogiškai, immunoblots buvo atliekami su arklio serumu (1E pav) ir serume L3-pelėmis (1F pav.) 13 juostų pasirinkimas, nurodė su rodyklėmis (1d pav), buvo pagrįstas tais pačiais kriterijais, kaip nurodyta pirmiau. Jie buvo izoliuotas toliau nustatyti pagal MS (2 lentelė). Dešimt baltymai iš 13 atrinktų juostų davė didelį skirtumą (p < 0,05) ir buvo nustatyta, kad alfa grandinėje lervų baltymų serume (pav 1D, juostų 1-4), arylphorin (1d figūra, band 6), beta grandinės lervų baltymų serume (1d figūra, band 7), hemoglobino (pav 1D, juostos 10-12) ir murein lipoproteinų (pav 1D, juostiniai 13) .table 1 Masių spektrometrija identifikavimo baltymų nustatytas nuo L2 LCE.
Band tapatybę patvirtinantis
Baltymai vardas
Rūšys

prisijungimas skaičius

MW galios (da)
pi
Baltymai rezultatas
8
Baltymai panašus į Actin-87e izoformos 2
Drosophila melanogaster

AAM29410
37.816
5.36
223
9
gliceraldehid-3-fosfato dehidrogenazės
Drosophila hydei
S24630
35369
8.2
224
13
hemoglobino
gasterophilus intestinalis
O96457
17.912
8.44
440
14
hemoglobinas
gasterophilus intestinalis

O96457
17.912
8.44
144
dėmės užduotys skaitykite 1 pav buvo tapatinamas su gerokai tikimybės rezultatas p <išvardyti baltymai; 0.05 MSDB.
2 lentelė Masių spektrometrija identifikavimas baltymų nustatytas nuo L3 LCE
Band "ID,
.
Baltymai vardas
Rūšys
prisijungimas skaičius

MW (da)

Pi


Protein rezultatą

1
lervų serumo baltymų 1 alfa grandinės pirmtakas
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98.802
5.72
92
2
lervų serumo baltymų 1 alfa grandinės pirmtakas
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98.802
5.72
89
3
lervų serumo baltymų 1 alfa grandinės pirmtakas pervežimas Drosophila melanogaster

LSP1A_DROME
98.802 5,72 98 4
lervų serumo baltymų 1 alfa grandinės pirmtakas
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98.802
5,72 <
Br> 102
6
Arylphorin subvieneto, A4 pirmtakas
Calliphora vicina
ARY1_CALVI
92282 5,59 71
7
lervų serumo baltymų 1 beta grandinės pirmtakas
Drosophila melanogaster
LSP1B_DROME
95.849
5.41
69
10
Hemoglobinas
gasterophilus intestinalis
O96457
17.912
8.44
247 11
Hemoglobinas
gasterophilus intestinalis
O96457
17.912
8.44
132
12
hemoglobino
gasterophilus intestinalis
LPEBWM
17.912
8.44
112 majoras išorinės membranos lipoproteinų pirmtakas (Murein-lipoproteinų)
Pectobacterium atrosepticum
13
LPP_ERWCT
8396
9.36 pervežimas 69
dėmės užduotys skaitykite 1 pav buvo tapatinamas su gerokai tikimybės rezultatas p <išvardyti baltymai; 0.05 (1, 2, 3, 4, 6, 7, 13: Expasy duomenų bazė; 10, 11, 12: MSDB).
Pav 1 1-D analizė rodo, kad L2 ir L3 LCE. Atstovas 1-D sidabro-nudažomi gelis iš LCE L2 (A) ir L3 (D). Rodyklės rodo juostas, kurios buvo pasirinktos masių spektrometrijos. Western Blot analizė L2 inkubuojamos su arklių serumo (B) ir pelės serumo (C). Western Blot analizė L3 inkubuojamos su arklių serumo (E) ir pelės serumo (F). Baltymų identifikavimas IS pateikti 1 lentelėje ir 2.
2-D analizė L2 LCE
baltymų išsiskyrimą L2 LCE dėl 2-D gelio (2A pav) parodė, kad buvimą baltymai visoje pH spektru. Vakarų dėmės buvo atliktas L2-pelių kraujo serume (2B pav) ir su arklių serumo (2C pav). Sidabro tamsintas gelis buvo naudojamas siekiant suderinti aptikti baltymų dėmės ant abiejų immunoblot profilius. Didesnis asortimentas imuninė reaktyvusis baltymų buvo pastebėtas ant žirgo immunoblot profilyje nei ant L2-pelėmis immunoblot. Apskritimai rodo 12 taškus, kurie buvo laikomi imuninės reaktyvusis L2-pelėmis serume (2a pav, vietos: 1, 2, 6, 8, 14-20, 25) ir rodyklės rodo 24 taškus, kurie buvo laikomi imuninės reaktyvus su arklio serumu (2A pav vietos: 1-13 ir 16-26). Kaip 26 dėmės, kad bendras buvo atrinkti MS analizę (3 lentelė). Tarp 26 pasirinktų dėmės, 7 baltymai buvo sėkmingai nustatyti (p < 0,05) pagal MS: paramyosin (2a pav, vietoje 1), serumo albumino (pav 2A, vieta 5), ​​tubulino (pav 2A, vieta 9), enolase ( 2A pav, vietoje 11), tropomioziną (pav 2A, vietoje 14), GAPDH (2A pav, vietoje 19) ir hemoglobino (2A pav, vietoje 20) .table 3 masių spektroskopijos nustatymo, baltymų nustatytas nuo L2 LCE.
vietoje tapatybę patvirtinantis
Baltymai vardas
Rūšys
prisijungimas skaičius

MW (da)
pi
Baltymai rezultatas
1
Paramyosin
Drosophila melanogaster
S22028
102.277
5,5
97
5
serumas albuminas pirmtakas
Bos taurus
ABBOS
69.225
5,8
99
9
tubulino alfa-1 grandinės
Drosophila melanogaster
A26488
49876
5,0
260
11
Enolase
Oryza sativa
Q7XBE4
47.942
5,4
80
14
tropomioziną
Drosophila melanogaster
C25242
32740
4,7
78
19
gliceraldehid-3-fosfato dehidrogenazės
Drosophila hydei
S24630
35.369
8,2
100
20
hemoglobino
gasterophilus intestinalis

O96457
17.912
8,4
209
dėmės užduotys kreiptis į 2 pav buvo tapatinamas su gerokai tikimybės rezultatas p <išvardyti baltymai; 0.05 MSDB.
2 paveikslas 2-D analizę L2 LCE. Sidabro-nudažomi atstovas 2-D baltymas žemėlapis L2, apimanti pH gradientas nuo 3 iki 11 su MWS reitingo nuo 10 iki 250 kDa (A) LCE. Sidabro-nudažomi gelis buvo naudojamas siekiant suderinti aptikti baltymų dėmės ant kuri atliekama kartu su serumu pelių imunizuotų su L2 (B) LCE Vakarų dėmės ir su arklių serumo (C). Apskritimai rodo dėmės, kurios buvo immunolabelled su pelėmis serume (B; pamatė 1,2,6,8,14-19,25,26) ir rodyklės rodo dėmės, kurios buvo immunolabelled su arklio serumu (C; pamatė 1-13 ir 16-26). Iš 26 vietų iš viso buvo izoliuotas toliau MS identifikuoti. Baltymų identifikavimas MS pateiktas 3 lentelėje
2-D analizė L3 LCE Viesbutis The PROTEOMIKOS profilio L3 LCE pateikiama paveiksle 3A rodo, kad dauguma baltymų įsikūrę basidic diapazone pH nuo 7-11. Vakarų dėmės buvo atliktas su L3-pelių kraujo serume (3B pav) ir su arklių serumo (Fig.3C). Imuninės reakcijos intensyvumas skiriasi, kai L3 LCE yra veikiama, L3-pelių kraujo serume arba su arklių serumo bet immunoblot buvo panašus. Po palyginimą immunoblots su sidabru tamsintas geliu, 39 vietų, kurias ratą nurodyti atrinkti tolesniam MS identifikavimo (4 lentelė). 19 iš 39 izoliuotų dėmės buvo sėkmingai nustatyti (p < 0.05), atitinkančiai 8 skirtingų baltymų: filamin (3a pav, vietoje 1), šilumos šoko baltymas (HSP-70) (3A pav, vieta 2), serumo albuminas pirmtakas (3A pav, vietoje 3,18-20), fosfoenolpiruvato carboxykinase (PEPCK) (3A pav, vietoje 8), enolase (3A pav, vietoje 22,23), fumarase (pav 3A, vietoje 1), beta aktino ( 3A pav, vietoje 27), hemoglobino (3A pav, vietoje 32-39) .table 4 masių spektroskopijos Identifications baltymų nustatytas nuo L3.
LCE vietoje tapatybę patvirtinantis
Baltymai vardas
Rūšys

prisijungimas skaičius

MW (da)
pi

Baltymai rezultatas
1
Filamin 1
Drosophila melanogaster
Q8T3K7
151.931
5.72
76
2
Šiluminio šoko 70 kDa baltymas 70C
Drosophila melanogaster
HSP7A_DROME
70871
5.34
70 3
serumo albuminas
Bos taurus

AAN17824
71.274
5.82
171
8
fosfoenolpiruvato carboxykinase
Drosophila melanogaster
PPCK_DROME
71.882
6.07
79
18
serumas albuminas pirmtakas
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71.244 serumas albuminas pirmtakas
Bos taurus
5.82
108
19

ALBU_BOVIN
71244
5.82
117
20
serumas albuminas pirmtakas
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71.244
5.82
165
22
Enolase (fragmentas)
Drosophila subobscura
O44101
44.548
5.92
142
23
Enolase
Schistosoma mansoni

ENO_SCHMA
47421
6.18
163
24
Fumarase
Drosophila melanogaster
Q9VTI5
51.239
8.47
111
27
Beta aktino
Danio rerio
ACTB1_BRARE
42.082
5,3
184
32
Hemoglobinas
gasterophilus intestinalis

O96457
18026
8,44 95 33
Hemoglobinas
gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8.44
113
34
hemoglobino
gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8.44
131
38
hemoglobinas
gasterophilus intestinalis
O96457
18.026
8.44
415
39
Hemoglobinas
gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8.44
410
dėmės užduotys skaitykite 3. pav Baltymai sąrašu buvo tapatinamas su gerokai tikimybės rezultatas p < 0.05 (2, 8, 18, 19, 20, 23, 27: Expasy duomenų bazė; 1, 3, 22, 24, 32, 33, 34, 38, 39: MSDB)
3 paveikslas 2-D analizę. iš L3 LCE. Sidabro-nudažomi atstovas 2-D baltymas žemėlapis L3, apimanti pH gradientas nuo 3 iki 11 su MWS reitingo nuo 10 iki 250 kDa (A) LCE. Sidabro-nudažomi gelis buvo naudojamas siekiant suderinti aptikti baltymų dėmės ant kuri atliekama kartu su serumu pelių imunizuotų su L3 (B) LCE Vakarų dėmės ir su arklių serumo (C). 39 taškų immunolabelled tiek serumo buvo izoliuoti toliau MS identifikuoti. Baltymų identifikavimo IS pateikiama 4 lentelėje
Diskusijos
migracijos modelius ir LCE2 ir LCE3 abiejose matmenų analizė (1-D ir 2-D) Palyginimui, rodo, kad lervų baltyminės profilis etape specifinė, todėl rodo kitą sudėtį lervų metabolizmo ir antigeno savybių. 1-D sidabro tamsintas geliai ir lervų žalios ekstraktų nurodė labai tankus koncentracijos baltymų; Todėl aptiktų arklių iš imuninė reaktyvusis juostų ir pelių suderinimas gali kelti kai kurių skirtumų. PROTEOMIKOS požiūris patvirtino specifinio baltymo profilį abiejų lervų ir leido geriau identifikuoti įvairių dėmių.
Pelės buvo dirbtinai imunizuoti nuo žalios baltymų ekstraktas iš visos lervos. Daug baltymų grupė, kuri yra paprastai ne tiesiogiai liečiasi su arklių buvo pateiktas imuninei sistemai pelių. Be to, skirtingai nuo natūralios infekcijos sukelti arklių imuninę reakciją, poodinė injekcija pelėms sukelia sisteminis imuninės reakcijos perkeltas į Th1 atsakymą, adjuvantu. Šis skirtumas imuninės reakcijos paaiškina tai, kad dauguma iš L2 ir L3 baltymų, kuri reagavo su pelių kraujo serume parodė intensyvesnį signalą, kai, palyginti su reakcijos su arklių serumais. Nuo G. intestinalis gyvavimo ciklo
įvyksta skrandžio-žarnyno trakto arklių, gleivinės imuninė sistema yra liečiasi su lervų ir todėl jie yra šalinamas arba išskiriami medžiagų per lervų migracijos ir vystymosi [18]. Nors L2 migracijos modeliai iš lūpų į skrandį lieka neaišku, imuninė reakcija aptikta arklių ir eksperimentiškai paskiepytų pelių gali reikšti, jog lervų stadijos L2 turi daugiau antigeninėmis baltymų nei lervų stadijos L3, tikriausiai naudingų lervų fermentais migracijos [19]. Todėl enolase nustatė, MS ir anksčiau buvo pranešta kaip svarbus fermentas lokalizuota ant kelių patogenų paviršiaus, kai užplūsta audinius [20]. L2 yra scena, sukelianti stiprų šeimininko imuninio atsako, kad jo plėtra į L3 skrandyje gali būti gynybos mechanizmas lervų apeiti arklys imuninę apsaugą. Priešingai, tai, kad L3 lieka pridedamas 8-10 mėnesių skrandžio sienelės siūlo hypometabolic statusą arba sumažintas imunogeninių savybių. Tai gali paaiškinti silpna imuninė reakcija į arklio serumu prieš L3 buvimą.
Du svarbius lervos baltymų, arylphorin ir LSP-2 (lervų serumo baltymų), atitinkamai homologiškas Calliphora vicina parsisiųsti ir Drosophila melanogaster
nebuvo nustatyta L3. Be holometabolous vabzdžių suaugusių audinių statybos metamorfozės metu reikia daug energijos. Ji yra žinoma, kad prieš formavimo puparium, riebalų kūno ląstelės reabsorb baltymų ir kitų makromolekulių, susikaupusius į hemolimfa per lervų šėrimo laikotarpiu [21]. Pagrindinis frakcija įsteigtų baltymų sudaro arylphorins ir LSP-2 [22]. Be to, hemoglobino buvo nustatytas abiejų lervų G. intestinalis
. Tai gausi ir cirkuliuojančių molekulė būna labai tracheated ląstelių formavimo užpakalinės spiracular plokštelę ir leidžia lervos geriau naudoti su pertraukomis kontakto, kai oras yra prarijo su maistu [23].
Dauguma kitų nustatytų baltymų L2 (paramyosin , tubulino, tropomioziną, GAPDH ir baltymas panašus į aktino) arba L3 (filamin, fumarase, PEPCK, HSP-70, enolase) dalijamasi su tų Drosophila
spp. rodančių, kad struktūrinės ar metabolinėmis homologija egzistuoja tarp šių rūšių.
Šio tyrimo metu, įvairių žarnyno parazitai (Anoplocephala perfoliata
, parascaris equorum
, Cyathostominae) buvo vienu metu metu su G. intestinalis
skrandžio -intestinal takų paskerstų arklių. Kryžminio reaktyvumo rizika dar reikia įvertinti. Tačiau skirtingai nuo kai kurių imunologinių tyrimų apie žarnyno helmintų į equids [24-26], kryžminio reaktyvumo tarp G. intestinalis parsisiųsti ir virškinimo trakto parazitų dar nebuvo tirta.
Šis darbas suteikia papildomos informacijos, į supratimą tarp G. intestinalis sąveika parsisiųsti ir jų šeimininkė ir prisidėdama romaną schema PROTEOMIKOS profilio pagrindinių lervų. Taigi mūsų Rezultatai taip pat rodo, kad šioje priimančiojoje-parazitas sąveikos sudėtingumą. Iš tiesų, šis tyrimas atskleidžia, kad būtina sukurti patikimą serologinis įrankis aptikti užkrėsti arklius, ypač dėl to, kad vienintelis būdas aptikti G. intestinalis
užkrėtimo IS skrodimą.
Dauguma baltymų nustatymą bus kitas žingsnis apibrėžti savo vaidmenį, savo ląstelinė arba audinio lokalizacija ir jų galimą antigeninėmis savybėmis.
metodai
lervų rinkimo ir antigeno paruošimas
gasterophilus
spp. L2 ir L3 buvo renkami iš prievarčio dalis, kurių kilmės šalis iš dviejų esančių ūkių Šveicarijos Jura rajono arklių skrandžio; Delémont: N 47 ° 21 '; El 7 ° 20 ', Šveicarija. Tuo pačiu metu, virškinimo trakto kiekvieno gyvūno buvo išnagrinėtas ir buvo pastebėta, bet kuriuo atveju P. equorum
, A. perfoliata
ir Cyathostominae buvimas.
Visi lervos surenkamos buvo plaunami steriliu fosfato fiziologinio tirpalo buferiu (PBS 0,1 M, pH 7,2), įvardijama kaip G. intestinalis
dėl morfologijos [1] raktų pagrindu ir užšaldyti -20 ° C temperatūroje.
Rašant lervų neapdirbti ekstraktai, 10 L2 lervų derlius ant dviejų skirtingų arklių tos pačios bandos ir septynis L3 lervų išaugintos, pagamintos iš antrosios bandos vieną žirgą, buvo Sunaikintos Ultragarsas ir homogenizuoti ant ledo steriliomis sąlygomis. Homogenatas buvo ekstrahuojamas per naktį 0,1 M pH 9,6 karbonatas buferis, kuriame yra 1 mM fenilmetilsulfonilfluoridą fluorid (PMSF) ir 5 mM ethylenediamin tetraacto rūgšties (EDTA), toliau pridedant 1 ml /gr apie proteazės inhibitoriaus (Sigma-Aldrich, Buchs, Šveicarija) , Ekstraktai centrifuguojamas 20'000 × g
30 minučių (4 ° C). Supernatantas, kurių sudėtyje yra antigenus buvo surinkti ir galutinis baltymų kiekis nustatomas pagal spektrometrija (Bradford metodas, BioRad). LCE buvo liofilizuotas ir laikomas -20 ° C temperatūroje.
Arklio serumo mėginiai
Kraujo mėginiai buvo paimti nuo kilmės iš dviejų ūkių pirmiau aprašytoje vietoje dvidešimties arklių grupė. Nors kraujo mėginiai ir lervų kolekcija negalėjo būti padaryta tų pačių gyvūnų mūsų pastabas per tuo pačiu metu atlikto epidemiologinio tyrimo (Roelfstra et al, į prep.), Įskaitant lauko pastabose dėl gyvų gyvūnų ir skerdyklų, patvirtino aukšto lygio endemiškumas G. intestinalis
anksčiau aprašyti [19] BROCARD toje pačioje srityje ir leidžia mums daryti prielaidą, kad visi šiame tyrime arkliai yra užkrėstos G. intestinalis
. Vaisiaus arklys serume buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė Vakarų dėmės. Kraujas centrifuguojamas 3500 × g
15 minučių kambario temperatūroje ir serumai buvo laikomi -20 ° C temperatūroje.
Imunizavimas pelių ir serumo mėginiai
BALB /c pelių buvo imunizuoti LCE L2 (L2 pelėms) arba LCE L3 (L3 pelių) G. intestinalis
. Du gramai L3 ir du gramai L2 buvo Sunaikintos Ultragarsas, homogenizuoti steriliame PBS buferio pH 7,2 ir centrifuguojamas 20'000 × g
. tada paviršinis buvo emulguojama lygiomis tūrio Freundo neišsami Adjuvantas (Sigma-Aldrich, Buchsas, Šveicarija).
100 mikrogramų baltymo /pelė dozę, A 200 įxL apimties, buvo švirkščiamas į raumenis, kas 2 savaites per 6 savaičių. Gyvūnai buvo nuleistas kraujas septynias savaites po pirmosios imunizacijos. Kontrolės pelėms buvo pasėta su LPS ir Freundo neišsami Adjuvantas kartu aukščiau kiekvieną kartą. Kraujo mėginius buvo centrifuguojamas 3500 × g
15 minučių kambario temperatūroje ir serumas laikomi -20 ° C temperatūroje. Visos procedūros buvo patvirtintos atsakingo vietos komitetas Gyvūnų Eksperimentuodamas.
Vienmatės elektroforezė (1-D)
L2 baltymus (5 g /gerai) ir L3 (5 g /gerai) buvo atskirta nuo gradiento SDL -PAGE geliai (4-20%) pagal redukcinės sąlygos (2-β-merkaptoetanolio, 95 ° C temperatūroje 5 min.) Elektroforezės buvo atlikta 80/100 V už 30 min /2 val. Vienas rinkinys gelių buvo tamsintas su sidabro masių spektrometrijos, o antrasis buvo perkeliamas ant nitroceliuliozės membranos ( "GE Healthcare", Uppsala, · vedija) už Vakarų blot analizė.
Dvimatis elektroforezė (2-D),
liofilizuoto LCE mėginiai buvo ištirpinami 2-DE lizės buferiniame tirpale (9 M karbamido, 2 M tiokarbamido, 1% dithioerythriol, 4% CHAPS, 2,5 mkm EGTA, ir 2,5 mkm EDTA). Immobiline sausi juostelės pH 3-11 ne linijinis, 11 cm (GE Healthcare, Upsala, Švedija) buvo panardintas naktį lizės buferiniame tirpale, kurio sudėtyje yra 75 mikrogramų baltymo mėginys, papildoma 1% Pharmalyte pH 3-10 (GE Healthcare ", Uppsala, · vedija) ir 0,5% bromfenolio mėlyna. Šlapimo nelaikymo epizodų dažnis ant Multiphor (GE Healthcare) 15 kV · h 20 ° C buvo po atskyrimo nuo gradiento SDS-PAGE gelyje (9-15%) pokyčiai Palyginamosiomis 45 V vienam geliu. Vienas rinkinys geliai buvo tamsintas su sidabro MS, o antrasis buvo perkeliamas ant nitroceliuliozės membranos ( "GE Healthcare", Uppsala, · vedija) už Vakarų blot analizė.
Vakarų dėmė analizė (PB)
nespecifinį buvo užblokuotas su 1% polivinilpirolidoną PBS-Tween už 1 valandą. Dėmės vėliau buvo inkubuojamos su pirminiais antikūnais PBS-Tween (naktį 4 ° C temperatūroje; arklių Sera arba pelių kraujo serume 1: 1000) ir perplautas. Į imunoreaktyvių dėmės buvo aptikta naudojant ožką anti-pelės IgG (H + L) (1: 20000, Šiaurės Imunologijos laboratorijos, Tilburg, Olandija), arba anti-arklys IgG (1: 10000, Sigma-Aldrich, Buchsas, Šveicarija) antikūno konjuguoto su krienų peroksidazės. Signalai buvo aptikta su EST (sustiprintas cheminės liuminescencijos) dėl Hyperfilm EST (GE Healthcare, Uppsala, Švedija) [27]. Po ECL aptikimu, dėmės vėliau buvo tamsintas su koloidiniu aukso tam, kad atitiktų matomų dėmelių prie bendro modelio ant sidabro tamsintas geliai.
Masių spektrometrija (MS)
Pasirinkti dėmės buvo pašalintų iš 2-D geliai, destained , tvarkomi proteolizė su tripsino [28] ir analizuojami MALDI-TOF ir MS /MS ant MALDI-TOF /TOF tandemas masės spektrometru (ABI 4700 Proteomika analizatorius, Applied Biosystems). Kombinuotas PMF (peptidas masė pirštų atspaudų) ir MS /MS užklausos buvo padaryta su MASCOT © Duomenų bazės paieškos sistema v1.9 [29] (Matrica mokslas) integruotas į GPS Explorer programine įranga (3.6, Taikomosios Biosistem versija) dėl Swiss- prot duomenų bazė (versija 20.051.206; 201594 sekas; 73123101 liekanos) arba MSDB (versija 20.040.703; 1501893 sekas; 480537664 liekanos). Baltymų identifikavimas buvo laikomas teigiamas (1, 2, 3 ir lentelės 4) jeigu (i) tikimybė pagrindu MOWSE rezultatas [30] gauti ir iš MS ir MS /MS analizę buvo reikšmingas (ty balai > 66 buvo reikšmingi, kai p < 0,05 Expasy duomenų bazėje, ir balai > 74 reikšminga, kai p < 0,05 MSDB duomenų bazę; pasikliautinasis intervalas > 99%, kaip nurodyta GPS Explorer versija 3.6); (Ii) suderintos peptidų mases buvo gausu spektro; ir (iii) teoriniai molekulinės masės (MW) reikšmingų hitai tilptų eksperimentinius nustatytos vertės.
deklaracijos
Padėka
šis darbas parėmė SFB 571 dotacijos A5 DEEG. Autoriai dėkoja prof D. Otranto ir prof d.d. Colwell savo kritines pastabas.
Autorių originalios pateikti failai vaizdų
Žemiau išvardintos nuorodos į autorių originalių pateiktų failų vaizdų. 13071_2008_54_MOESM1_ESM.pdf Autorių originalus failas 1 pav 13071_2008_54_MOESM2_ESM.pdf Autorių originalaus failo 2 pav 13071_2008_54_MOESM3_ESM.pdf Autorių originalaus failo 3 pav konkuruojančių interesų Viesbutis The autoriai deklaruoja, kad jie neturi jokių konkuruojančių interesų.

• Endoskopinė uždarymas skrandžio vamzdžių perforacijos su titano klipus: keturių atveju report
• Didžiulis skrandžio bezoarinis sukelia korys, neįprastas komplikacija sveikatos faddism: byla report