perfil de expresión de proteínas de las larvas de Gasterophilus intestinalis causando miasis gástrica caballo y caracterización del perfil del caballo inmunológico expresión de la proteína de reaction

intestinalis Gasterophilus
larvas causan miasis caballo gástrica y caracterización de caballo reacción inmune
Resumen Antecedentes
información sobre Little está disponible en el aspecto inmunológico de intestinalis Gasterophilus parasitarias
larvas (Diptera, Oestridae) causando miasis gástrica caballo. Los objetivos de esta investigación fueron analizar el contenido de proteína de los extractos crudos de larvas de la segunda y tercera larvas migran (L2 y L3) de G. intestinalis
con el fin de caracterizar la respuesta inmune de los caballos.
Resultados
El perfil proteómico de L2 y L3, investigó mediante el uso de una y dos enfoques dimensionales, reveló un patrón de migración específica para cada etapa larval. Por otra parte, transferencias de Western se realizaron con sueros de caballo y con sueros de ratones Balb /c inmunizados con los extractos crudos de larvas de L2 o L3, revelando una reacción inmune diferente en caballos infectados de forma natural vs
. inducida artificialmente reacción inmune en ratones. Las comparaciones de los perfiles de inmunotransferencia demuestran que el L2 etapa es más inmunogénica que la L3 etapa más probable como un efecto de la producción enzimática más alta de L2 al migrar a través de los tejidos del huésped. Quince proteínas se identificaron mediante espectrometría de masas.
Conclusión
Este trabajo proporciona más información sobre la comprensión de la interacción entre G. intestinalis
y su anfitrión y aportando un novedoso esquema del perfil proteómico de la principal de las larvas Antecedentes etapas.

Nueve especies de Gasterophilus gratis (Diptera, Oestridae) moscas se han descrito haciendo que, en la etapa larval, miasis gastrointestinal en equinos. Mientras Gasterophilus intestinalis gratis (De Geer, 1776) y Gasterophilus nasales gratis (Linnaeus, 1758) se distribuyen en todo el mundo y con frecuencia son las únicas especies reportadas en muchas partes del Nuevo Mundo, las especies restantes se presentan sólo en muy limitada áreas de Europa, Países del Este [1] y África [2]. moscas bot adultos depositan sus huevos en el cabello de los anfitriones en diferentes lugares dependiendo de las especies de Gasterophilus
[3]. G. pecorum
es una excepción, ya que las hembras ponen sus huevos en la hierba, hojas y tallos de las plantas [1]. La infección se produce cuando los huevos se introducen en la boca del caballo por lamer los animales y aseo personal. La primera fase larvaria (L1) escotillas, se inicia la migración y la muda en la segunda fase larvaria (L2) en la cavidad oral [4]. Las larvas de diferentes especies de Gasterophilus
son específicamente presente en una o más regiones del tracto gastrointestinal, donde la tercera etapa larval (L3) permanece unido a la mucosa durante aproximadamente 8 a 10 meses [5]. Los signos clínicos asociados con las fases de migración y maduración de las larvas son difíciles de diagnosticar, pero se ha demostrado que diferentes especies de Gasterophilus
pueden causar daños graves durante su ciclo de vida [6-9]. En el
últimos años los estudios relativos a la inmunología y la inmunopatología de muchos miasis causando larvas oestrid han aumentado debido a sus importantes implicaciones en el diagnóstico y en los programas de vacunación [10]. Mientras que los estudios inmunológicos se centraron principalmente en Hypoderma
infección ganado el prisionero [11], y oestrosis nasal ovejas por el estro ovis
[12], la inmunología de Gasterophilus
spp. miasis causada recibido poca atención. Esto también se debe a las dificultades inherentes al estudio de las interacciones huésped-parásito inmunológicos en la interfase mucosa gastrointestinal. Como consecuencia de ello, hasta el momento no inmunógenos principales se han reportado [13]. Un único estudio examinó el desarrollo de anticuerpos para el diagnóstico de miasis por G. intestinalis
larvas aunque la especificidad de la reacción inmune no ha sido probado en la ocurrencia de caballo concomitante infección parasitaria [14]. Los análisis más recientemente, basados ​​en proteómica muchos, junto con dos dimensiones electroforesis en gel, han ofrecido un enfoque integral para entender mejor los procesos biológicos e inmunológicos de los agentes patógenos y enfermedades [15-17]. El objetivo de este estudio fue caracterizar las proteínas L2 y L3 de G. intestinalis
y analizar la respuesta inmune de los caballos y de los ratones inmunizados contra antígenos de larvas.
Análisis: Resultados de la 1-D del extracto crudo de larvas (LCE) de L2 y L3
Migración de la lce2 en el gel teñido con plata 1-D mostró un patrón específico (Figura 1A) con 14 bandas que se aislaron a partir del gel para su posterior identificación por espectrometría de masas (MS) ( Tabla 1). La selección de las bandas se basa en la intensidad de la banda en el gel teñido con plata, así como la inmuno-reactividad observada después de inmunotransferencia con suero de caballo (Figura 1B) o suero L2-ratones (Figura 1C). Tres proteínas en 4 de las 14 bandas seleccionadas dieron una puntuación significativa (p < 0,05) y se identificaron como actina (Figura 1A, banda 8), deshidrogenasa de gliceraldehído 3-fosfato (GAPDH) (Figura 1A, banda 9) y la hemoglobina (Figura 1A, las bandas de 13 y 14). Un patrón de migración diferente se observó para el LCE3 en el gel teñido con plata-1-D (Figura 1D). Análogamente, las inmunotransferencias se realizaron con sueros de caballo (Figura 1E) y los sueros de L3-ratones (Figura 1F). La selección de 13 bandas, se indica con las flechas (Figura 1D), se basó en los mismos criterios que el anterior. Fueron aislados para su posterior identificación por MS (Tabla 2). Diez proteínas de las 13 bandas seleccionadas dieron una puntuación significativa (p < 0,05) y se identificaron como la cadena alfa de la proteína de suero de larvas (Figura 1D, bandas 1-4), arylphorin (Figura 1D, la banda 6), la cadena beta de proteína de suero de larvas (Figura 1D, la banda 7), hemoglobina (Figura 1D, las bandas 10-12) y las lipoproteínas de mureína (Figura 1D, la banda 13) .Tabla 1 masa de identificación espectrometría de las proteínas identificadas a partir de la LCE de la L2.
Banda ID
nombre de la proteína
Especies
número de Acceso

MW (Da) guía empresas pI
puntuación de proteína
8
proteína similar a la actina-87E isoforma 2
Drosophila melanogaster

AAM29410
37816
5,36
223 página 9
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
Drosophila hydei
S24630
35369
8.2
224 página 13
hemoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
17912
8,44
440 página 14
hemoglobina
intestinalis Gasterophilus

O96457
17912
8,44
144
Spots asignaciones se refieren a la figura 1. Las proteínas enumeradas han sido identificados con una puntuación significativa en la probabilidad p < 0,05 en msdb.
Tabla 2 Masa de identificación espectrometría de las proteínas identificadas a partir de la LCE de L3.
Banda ID
nombre de la proteína
Especies
número de Acceso

MW (Da) guía empresas pI
puntuación proteína

1 | sérica de las larvas proteína precursora 1 cadena alfa
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
92
2 de proteínas de suero de larvas 1 precursor de la cadena alfa
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
89 página 3
proteína de suero precursor de la cadena alfa 1 larval
Drosophila melanogaster

LSP1A_DROME
98802
5,72
98
4 de proteína de suero de la cadena alfa 1 larval precursor
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
102 página 6
arylphorin subunidad A4 precursor
Calliphora vicina
ARY1_CALVI
92282
5,59
71 página 7
sérica de las larvas de proteína beta 1 precursor de la cadena
Drosophila melanogaster
LSP1B_DROME
95.849
5,41
69
10
hemoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
17912
8,44
247 página 11
hemoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
17912
8,44
132 página 12
hemoglobina
intestinalis Gasterophilus
LPEBWM
17912
8,44
112 página 13
precursor principal de la membrana externa de lipoproteínas (mureína-lipoproteína)
Pectobacterium atrosepticum
LPP_ERWCT
8396
9,36
69
Spots asignaciones se refieren a la figura 1. Las proteínas enumeradas han sido identificados con una puntuación significativa en la probabilidad p < 0,05 (1, 2, 3, 4, 6, 7, 13: base de datos de Expasy; 10, 11, 12: BDMS).
Figura 1 análisis 1-D de la LCE de L2 y L3. 1-D gel teñido con plata representante de LCE, de L2 (A) y L3 (D). Las flechas indican las bandas que fueron seleccionados para la espectrometría de masas. El análisis de transferencia Western de L2 se incubaron con suero de caballo (B) y suero de ratón (C). El análisis de transferencia Western de L3 incubó con suero de caballo (E) y suero de ratón (F). La identificación de proteínas por MS se presenta en la Tabla 1 y 2.
análisis 2-D de la LCE de L2 México La migración de proteína de la LCE de L2 en un 2-D gel (Figura 2A) mostró la presencia de proteínas a lo largo del espectro de pH. Se realizaron transferencias Western con L2-ratones suero (Figura 2B) y con suero de caballo (Figura 2C). El gel teñido con plata se utiliza para alinear manchas de proteínas detectadas en ambos perfiles de inmunotransferencia. Se observó una mayor gama de proteínas inmuno-reactiva en el perfil de inmunotransferencia de caballos que en el inmunoblot L2-ratones. Los círculos indican 12 manchas que fueron considerados como inmuno-reactivos con L2-ratones suero (Figura 2A, manchas: 1, 2, 6, 8, 14-20, 25) y las flechas indican las 24 manchas que fueron considerados como reactivo inmunológico con suero de caballo (Figura 2A, manchas: 1-13 y 16-26). Se seleccionaron un total de 26 puntos para MS análisis (Tabla 3). Entre los 26 puntos seleccionados, 7 proteínas se identificaron con éxito (p < 0,05) por MS: paramiosina (Figura 2A, punto 1), albúmina de suero (Figura 2A, punto 5), tubulina (Figura 2A, punto 9), enolasa ( la Figura 2A, detectar 11), tropomiosina (Figura 2A, detectar 14), GAPDH (Figura 2A, el clavo 19) y la hemoglobina (Figura 2A, detectar 20) .Tabla 3 identificaciones de espectrometría de masas de las proteínas identificadas a partir de la LCE de L2.
Punto ID
nombre de la proteína
Especies
número de Acceso

MW (Da) guía empresas pI
puntuación de proteína
1 | paramiosina
Drosophila melanogaster
S22028
102277
5.5
97 página 5
albúmina de suero precursor
Bos taurus
Abbos
69225
5,8
99 página 9
tubulina alfa-1 cadena
Drosophila melanogaster
A26488
49876
5.0
260 página 11
enolasa
Oryza sativa
Q7XBE4
47942
5.4
80 página 14
tropomiosina
Drosophila melanogaster
C25242
32740
4,7
78 página 19
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
Drosophila hydei
S24630
35369
8.2
100
20
hemoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
17912
8.4
209
Spots asignaciones se refieren a la figura 2. Las proteínas enumeradas han sido identificados con una puntuación significativa en la probabilidad p < 0,05 en msdb.
Figura 2 análisis 2-D de la LCE de la L2. representante 2-D mapa proteína de plata-manchado de la LCE de L2 que comprende gradiente de pH 3-11 con los MWs rango de 10 a 250 kDa (A). El gel teñido con plata se utiliza para alinear manchas de proteínas detectadas en las transferencias Western realizadas con suero de ratones inmunizados con el LCE de L2 (B) y con suero de caballo (C). Los círculos indican los puntos que fueron immunolabelled con los ratones suero (B; manchas 1,2,6,8,14-19,25,26) y las flechas indican los puntos que fueron immunolabelled con suero de caballo (C; manchas 1-13 y 16 a 26). Un total de 26 puntos fueron aisladas para su posterior identificación MS. La identificación de proteínas por MS se presenta en la Tabla 3. Análisis FODA 2-D de la LCE de L3 Francia El perfil proteómico de la LCE de L3 presenta en la Figura 3A muestra que la mayoría de las proteínas se encuentran en un rango basidic entre pH 7-11. Se realizaron transferencias Western con suero de ratones L3-(Figura 3B) y con suero de caballo (Figura 3C). La intensidad de la reacción inmune difiere cuando el LCE de L3 se expone con suero L3-ratones o con suero de caballo pero los perfiles de inmunotransferencia fueron similares. Después de la comparación de las inmunotransferencias con el gel teñido con plata, se seleccionaron 39 puntos, indicados por círculos para su posterior identificación MS (Tabla 4). 19 de los 39 puntos aislados se identificaron con éxito (p < 0,05), lo que corresponde a 8 proteínas diferentes: filamin (Figura 3A, punto 1), proteína de choque térmico (Figura 3A, punto 2), la albúmina sérica (HSP-70) precursor (Figura 3A, detectar 3,18-20), fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) (Figura 3A, punto 8), enolasa (Figura 3A, el clavo 22,23), fumarasa (Figura 3A, punto 1), la beta-actina ( Figura 3A, detectar 27), hemoglobina (Figura 3A, el clavo 32-39) identificaciones de espectrometría de masas .Tabla 4 de las proteínas identificadas a partir de la LCE de L3.
Punto ID
nombre de la proteína
Especies
número de Acceso

MW (Da) guía empresas pI

proteína puntuación
1 | 1 | Filamina Drosophila melanogaster
Q8T3K7
151.931
5,72
76 página 2
El choque térmico de 70 kDa proteína 70C
Drosophila melanogaster
HSP7A_DROME
70871
5,34
70 página 3
albúmina sérica
Bos taurus

AAN17824
71274
5,82
171 página 8
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa
Drosophila melanogaster
PPCK_DROME
71882
6,07
79
18
albúmina de suero precursor
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
108 página 19
albúmina de suero precursor
Bos taurus

ALBU_BOVIN
71244
5,82
117
20
albúmina de suero precursor
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
165
22
enolasa (Fragmento)
Drosophila subobscura
O44101
44548
5,92
142
23
enolasa
Schistosoma mansoni

ENO_SCHMA
47421
6.18
163
24
fumarasa
Drosophila melanogaster
Q9VTI5
51239
8,47
111
27
Beta-actina
Danio rerio
ACTB1_BRARE
42082
5.3
184
32
hemoglobina
intestinalis Gasterophilus

O96457
18026
8,44
95
33
hemoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
18026
8,44
113
34
hemoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
18026
8,44
131
38
hemoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
18026
8,44
415
39
hemoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
18026
8,44
410
Spots asignaciones se refieren a Figura 3. proteínas enumeradas se han identificado con una puntuación significativa en la probabilidad p < 0,05 (2, 8, 18, 19, 20, 23, 27: base de datos de Expasy; 1, 3, 22, 24, 32, 33, 34, 38, 39: datos MSDB): perfil del análisis de la Figura 3-D de 2. la LCE de L3. representante 2-D mapa proteína de plata-manchado de la LCE de L3 que comprende gradiente de pH 3-11 con los MWs rango de 10 a 250 kDa (A). El gel teñido con plata se utiliza para alinear manchas de proteínas detectadas en las transferencias Western realizadas con suero de ratones inmunizados con el LCE de L3 (B) y con suero de caballo (C). 39 puntos immunolabelled con ambos sueros fueron aisladas para su posterior identificación MS. La identificación de proteínas por MS se presenta en la Tabla 4. Discusión

La comparación de los patrones de migración de la lce2 y LCE3 tanto en el análisis dimensional (1-D y 2-D), indica que el perfil proteico de las larvas es etapa específica, lo que sugiere una composición diferente en el metabolismo de las larvas y propiedades antigénicas. Los 1-D geles teñidos con plata de los extractos crudos de larvas indicaron una concentración muy densa de proteínas; por consiguiente, la alineación de las bandas inmunorreactivas detectadas por caballo y ratones podría presentar algunas diferencias. El enfoque proteómico confirmó el perfil de proteínas específica de las dos etapas de larva y permitió una mejor identificación de los diferentes puntos.
Se inmunizaron ratones artificialmente en contra de un extracto de proteína crudo a partir de larvas conjunto. Un gran número de proteínas que normalmente no están directamente en contacto con los caballos se presenta al sistema inmune de los ratones. Además, a diferencia de la infección natural ocasionar una reacción inmune caballo, la inyección subcutánea en ratones induce una reacción inmune sistémica cambió a una respuesta Th1 por el adyuvante. Esta diferencia en la reacción inmune explica el hecho de que la mayoría de las proteínas L2 y L3 que reaccionaron con los sueros de los ratones mostraron una señal más intensa en comparación con la reacción con sueros de caballo. Dado que el ciclo de vida de G. intestinalis
se produce en el tracto gastro-intestinal de los caballos, el sistema inmune de la mucosa está en contacto con las larvas y por lo tanto expuesto a sustancias excretadas o secretadas durante la migración de las larvas y el desarrollo [18]. Aunque los patrones de migración L2 desde la boca hasta el estómago sigue siendo poco clara, la reacción inmune detectada en los caballos y en los ratones inmunizados experimentalmente podría sugerir que el estado de larva L2 posee más proteínas antigénicas que la etapa larval L3, probablemente útiles para la migración de las larvas enzimática [19]. En consecuencia, la enolasa se identificó por MS y previamente se ha informado que una enzima importante localizada en la superficie de varios patógenos al invadir tejido [20]. L2 es una etapa que induce una fuerte respuesta inmune del huésped de modo que su desarrollo en L3 en el estómago puede ser un mecanismo de defensa de las larvas para eludir las defensas inmunes del caballo. A la inversa, el hecho de que L3 permanece unido durante 8-10 meses a la pared del estómago sugiere un estado hipometabólico, o propiedades inmunogénicas reducidos. Esto puede explicar la reacción inmune débil observada en presencia de suero de caballo contra el L3.
Dos proteínas de larvas importantes, arylphorin y LSP-2 (proteína de suero de larvas), respectivamente homólogas a Calliphora vicina
y Drosophila melanogaster
, fueron identificados en el L3. En los insectos holometabolous la construcción de tejidos adultos durante metamorfosis requiere una gran cantidad de energía. Se sabe que antes de la formación de la pupa, las células de grasa corporal reabsorben proteínas y otras macromoléculas que se han acumulado en la hemolinfa durante el período de alimentación de las larvas [21]. La fracción mayor de las proteínas incorporadas consiste en arilforinas y LSP-2 [22]. Además, la hemoglobina se identificó en dos fases larvarias de G. intestinalis
. Esta molécula abundante y que circula está presente en las células altamente tracheated formación de la placa posterior y espiracular permite que las larvas de hacer un mejor uso de contacto intermitente cuando el aire se ingiere con los alimentos [23].
La mayor parte de las otras proteínas identificadas en L2 (paramiosina , tubulina, tropomiosina, GAPDH y una proteína similar a la actina) o en L3 (filamina, fumarasa, PEPCK, HSP-70, enolasa) se comparten con las de Drosophila
spp. lo que sugiere que existen homologías estructurales o metabólicas entre estas especies.
Durante esta investigación, diferentes parásitos intestinales (Anoplocephala perfoliata
, Parascaris equorum
, Cyathostominae) estaban presentes simultáneamente con G. intestinalis
en el tracto gastro tracto -intestinal de los caballos sacrificados. El riesgo de reactividad cruzada Aún está pendiente de evaluación. Pero a diferencia de algunos estudios inmunológicos sobre los helmintos intestinales en équidos [24-26], la reactividad cruzada entre G. intestinalis Opiniones y parásitos gastrointestinales aún no ha sido estudiada.
Este trabajo proporciona información adicional en la comprensión de la interacción entre G. intestinalis
y su anfitrión y contribuyendo un novedoso esquema del perfil proteómico de las principales etapas larvales. Así, nuestros resultados demuestran una vez más la complejidad de esta interacción huésped-parásito. De hecho, este estudio pone de manifiesto la necesidad de desarrollar una herramienta serológica fiable para detectar caballos infestados, sobre todo porque el único medio para detectar una infestación de G. intestinalis
es mediante la necropsia. México La identificación de la mayoría de las proteínas será el siguiente paso para definir su papel, su localización celular o tisular y sus propiedades antigénicas potenciales.
Métodos cOLECCIÓN y el antígeno de la preparación de las larvas
Gasterophilus
spp. L2 y L3 se obtuvieron de la porción pilórica del estómago de los caballos procedentes de dos fincas ubicadas en el Distrito de Jura suizo; Delémont: N 47 ° 21 '; E 7 ° 20 ', Suiza. Al mismo tiempo, el tracto gastro-intestinal de cada animal se examinó y se observó la presencia de P. equorum
, A. perfoliata
y Cyathostominae en cualquier caso.
Todas las larvas recogidas se lavaron en un fosfato estéril tampón de solución salina (PBS 0,1 M, pH 7,2), identificado como G. intestinalis
sobre la base de claves morfológicas [1] y se congeló a -20 ° C.
Para la preparación de los extractos crudos de larvas, 10 larvas L2 cosechado en dos caballos diferentes de un mismo rebaño, y siete larvas L3 cosechado en un caballo procedente de la segunda manada, se sonicaron y se homogeneizaron en hielo en condiciones estériles. El homogenado se extrajo durante la noche en un pH 0,1 M 9,6 tampón de carbonato que contiene 1 mM fluorid de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y 5 mM de ácido ethylenediamin tetraacético (EDTA) mediante la adición de más de 1 ml /gr de un inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) . Los extractos se centrifugaron a 20.000 × g durante 30 minutos
(4 ° C). Se recogió el sobrenadante que contiene los antígenos y el contenido final de proteína se determina por espectrometría (método de Bradford, BioRad). LCE se liofilizó y se almacenó a -20 ° C. Se tomaron muestras de suero de caballo

muestras de sangre en un grupo de veinte caballos procedentes de las dos granjas en la zona descrita anteriormente. A pesar de las muestras de sangre y recogida de larvas no podrían hacerse en los mismos animales nuestras observaciones hechas durante una encuesta epidemiológica realizada de forma simultánea (Roelfstra et al, en prep.), Incluyendo observaciones de campo de los animales vivos y en los mataderos, confirmado el alto nivel de endemicidad de G. intestinalis
descrito previamente por Brocard [19] en la misma zona y nos permiten suponer que todos los caballos utilizados en este estudio están infestadas por G. intestinalis
. suero de caballo fetal se utilizó como control negativo para las transferencias de Western. La sangre se centrifugó a 3.500 × g
durante 15 minutos a temperatura ambiente y el suero se almacenaron a -20 ° C.
Inmunización de ratones y muestras de suero
ratones Balb /c fueron inmunizados con LCE de L2 (ratones L2) o con LCE, de L3 (ratones L3) de G. intestinalis
. Dos gramos de L3 y dos gramos de L2 se sonicaron, se homogeneizó en un tampón PBS pH 7,2 estéril y se centrifugó a 20.000 × g
. El sobrenadante se emulsionó en un volumen igual de adyuvante incompleto de Freund (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza).
Una dosis de 100 mg de proteína /ratón, en un volumen de 200 l, se inyectó por vía intramuscular cada 2 semanas a través de 6 semanas. Los animales se sangraron siete semanas después de la primera inmunización. Los ratones de control se inocularon con una combinación de adyuvante incompleto de Freund y PBS cada vez más arriba. tomaron muestras de sangre se centrifuga a 3500 × g
durante 15 minutos a temperatura ambiente y sueros almacenados a -20 ° C. Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité local responsable de la experimentación con animales.
Una electroforesis bidimensional (1-D) Francia El proteínas de L2 (5 mg /pocillo) y L3 (5 mg /pocillo) se separaron en SDS gradiente geles -Page (4-20%) en condiciones reductoras (2-β-mercaptoetanol, 95 ° C durante 5 min). La electroforesis se realizó en 80/100 V durante 30 min /2 hrs. Un conjunto de los geles se tiñeron con plata para la espectrometría de masas, y el segundo fue transferido a membranas de nitrocelulosa (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) para el análisis de Western blot.
Electroforesis bidimensional (2-D)
liofilizada LCE muestras se solubilizaron en 2-dE tampón de lisis (9 M urea, tiourea 2 M, 1% ditioeritriol, 4% de CHAPS, 2,5 M EGTA y 2,5 mM EDTA). Immobiline tiras secas de pH 3-11 no lineal, 11 cm (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) se sumergieron durante la noche en tampón de lisis que contiene 75 g de proteína de la muestra, Pharmalyte 1% adicional de pH 3-10 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia), y 0,5% de azul de bromofenol. IEF en un Multiphor (GE Healthcare) para 15 kV · h a 20 ° C fue seguido por separación en geles de SDS-PAGE en gradiente (9-15%) en constante 45 V por gel. Un conjunto de geles se tiñeron con plata para la EM y la segunda se transfirió a membranas de nitrocelulosa (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) para el análisis de Western blot. La unión
Western blot (WB)
no específica fue bloqueada con 1% de polivinilpirrolidona en PBS-Tween durante 1 hora. Las transferencias se incubaron a continuación con anticuerpo primario en PBS-Tween (durante la noche a 4 ° C; sueros de caballo o suero de los ratones 1: 1000) y se lavaron. Las manchas inmunorreactivas se detectaron utilizando un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H + L) (1: 20.000, Nordic Inmunología Laboratories, Tilburg, Países Bajos) o un anti-IgG de caballo (1: 10.000, Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante. Se detectaron señales con ECL (quimioluminiscencia mejorada) en Hyperfilm ECL (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) [27]. Después de la detección ECL, las manchas de transferencia se tiñeron posteriormente con oro coloidal con el fin de coincidir con los puntos visibles a patrón general en geles teñidos con plata.
Espectrometría de masas (MS)
puntos seleccionados se escindieron de los geles 2-D, destained , procesado por proteolisis con tripsina [28] y se analizaron por MALDI-TOF y MS /MS en un /TOF espectrómetro de masas en tándem MALDI-TOF (ABI 4700 Proteómica Analyzer, Applied Biosystems). PMF combinado (péptido masa de huellas digitales) y MS /MS se realizaron consultas con la mascota © motor de búsqueda de base de datos v1.9 [29] (Matriz de Ciencias), incluido sobre GPS-explorador de software (versión 3.6, Applied Biosystems) en el Swiss- Prot base de datos (versión 20051206, 201594 secuencias; 73123101 residuos) o datos mSDB (versión 20.040.703; 1501893 secuencias; 480537664 residuos). Identificación de proteínas se consideró positiva (cuadros 1, 2, 3 y 4) si (i) la MOWSE puntuación basada en la probabilidad [30] obtenidos tanto de MS y MS /MS análisis fue significativa (es decir, las puntuaciones > 66 eran significativas a p < 0,05 para la base de datos Expasy, y anota > 74 significativas a p < 0,05 para la base de datos mSDB; intervalo de confianza > 99% según lo dado por el explorador GPS, versión 3.6); (Ii) las masas de péptidos emparejados eran abundantes en el espectro; y (iii) los pesos moleculares teóricos (MW) de los éxitos significativos se ajustan a los valores observados experimentales.
Declaraciones
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por SFB 571 subvención A5 Deeg. Los autores agradecen al Prof. D. Otranto y el Prof. D. D. Colwell por sus comentarios críticos.
Los autores originales presentados archivos de imágenes
A continuación se presentan los enlaces a los autores originales presentados archivos de imágenes. 'archivo original para la figura 1 13071_2008_54_MOESM2_ESM.pdf autores 13071_2008_54_MOESM1_ESM.pdf Autores archivo original de la figura 2 13071_2008_54_MOESM3_ESM.pdf archivo original de los autores para la figura 3 Conflicto de intereses México La autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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