Proteiinin ilmentyminen profiilia Gasterophilus intestinalis toukat aiheuttavat hevosen mahalaukun toukat ja luonnehdinta hevosen immuuni reaction

proteiiniekspressiota profiilia Gasterophilus intestinalis
toukat aiheuttavat hevosen mahalaukun toukat ja luonnehdinta hevosen immuunireaktion
tiivistelmä
tausta
vähän tietoa on saatavilla immunologinen näkökohta loisten Gasterophilus intestinalis
(Diptera, Oestridae) toukat aiheuttavat hevonen mahalaukun toukat. Tavoitteet Tämän tutkimuksen oli analysoida proteiinipitoisuus toukkien raakauutteista vaeltavat toisen ja kolmannen toukkia (L2 ja L3) G. intestinalis
jotta luonnehtimaan immuunivasteen hevosia.
Tulokset
Euroopan proteomic profiilia L2 ja L3, tutkitaan käyttämällä yhtä ja kaksiulotteisia lähestymistapoja paljasti vaelluskäyttäytyminen kullekin toukka. Lisäksi Western blotit suoritettiin hevosen seerumia ja seerumeista Balb /c-hiiriä immunisoidaan toukka raakauutteista L2 tai L3, paljastaen eri immuunireaktion luonnollisesti tartunnan hevoset vs
. keinotekoisesti immuunireaktion hiirissä. Vertailut immunoblottaustietojen profiilien osoittavat, että vaihe L2 on enemmän immunogeeninen kuin vaiheessa L3 todennäköisin kuin vaikutus korkeimman entsymaattisen tuotannon L2 taas vaeltavat läpi isännän kudoksiin. Viisitoista proteiinit tunnistettiin massaspektrometrillä.
Johtopäätös
työ antaa lisätietoa osaksi käsitys vuorovaikutuksen G. intestinalis
ja niiden isäntä ja tukemalla uutta järjestelmää on proteomic profiilin tärkeimmistä toukka vaiheissa.
Tausta
Yhdeksän lajien Gasterophilus
(Diptera, Oestridae) kärpäsiä on kuvattu aiheuttaa, että toukka, ruoansulatuskanavan toukat vuonna hevoseläimille. Vaikka Gasterophilus intestinalis
(De Geer, 1776) ja Gasterophilus nasalis
(Linnaeus, 1758) myydään maailmanlaajuisesti ja ne ovat usein ainoa laji raportoitu monissa osissa New World, loput lajit vain ilmoitettu hyvin rajallinen Euroopan alueita, idän maat [1] ja Afrikka [2]. Aikuisten bot kärpäsiä tallettavat munat isäntien hiukset eri paikoissa riippuen lajista Gasterophilus
[3]. G. pecorum
on poikkeus kuin naaraat munivat ruohoa, lehdet ja varret kasveja [1]. Infektio syntyy, kun munat tuodaan horse suuhun eläimen köniinsä ja hoitotuotteita. Ensimmäinen toukka (L1) luukut, alkaa siirtymässä ja sulkasadon toiseen toukka (L2) suuontelon [4]. Toukat eri lajien Gasterophilus
ovat erityisesti läsnä yhdellä tai useammalla alueella maha-suolikanavan, jossa kolmannen toukka (L3) on kiinni limakalvon noin 8-10 kuukautta [5]. Kliiniset oireet liittyvät maahanmuutto- ja kypsyminen vaiheissa toukat ovat vaikea diagnosoida, mutta on osoitettu, että eri lajien Gasterophilus
voi aiheuttaa vakavia vahinkoja elinkaarensa aikana [6-9].
Vuonna viime vuosina tutkimukset koskevat immunologian ja immunopatologia monien oestrid toukat aiheuttavat toukat ovat lisänneet koska niiden merkittäviä vaikutuksia diagnostiikassa ja rokotusohjelmia [10]. Vaikka immunologisia tutkimuksia lähinnä Hypoderma
karjan grub infektio [11], ja lampaat nenän oestrosis tekijänä lampaannenäsaivartaja
[12], immunologian Gasterophilus
spp. aiheutti toukat kiinnitetty vain vähän huomiota. Tämä johtuu myös hankalaa tutkimalla immunologisen isäntä-loinen vuorovaikutuksiin ruoansulatuskanavan limakalvolla käyttöliittymä. Näin ollen, toistaiseksi ei ole suuria immunogeenejä, on raportoitu [13]. Yksittäinen tutkimus keskusteltu kehittämistä vasta diagnosoimiseksi toukat G. intestinalis
toukat vaikka spesifisyys immuunireaktion ei testattu esiintymisen samanaikaisen hevonen loisinfektio [14]. Viime aikoina monet proteomiikkaa perustuvia analyyseja yhdistettynä kaksiulotteinen geeli-elektroforeesi, ovat tarjonneet kattavan lähestymistavan paremmin ymmärtää biologisia ja immunologisia prosesseja taudinaiheuttajien ja tautien [15-17]. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia luonnehtia L2 ja L3 proteiineja G. intestinalis
ja analysoida immuunivasteen hevosten ja immunisoitujen hiirten vastaan ​​toukkien antigeenejä.
Tulokset
1-D analyysi toukka raakaa uutetta (LCE) L2 ja L3
Migration on LCE2 on 1-D hopeavärjätyssä geeli osoitti tietty kuvio (kuvio 1A) ja 14 bändejä, jotka eristettiin geelistä edelleen tunnistamisen massaspektrometrialla (MS) ( Pöytä 1). Valinta bändejä perustui Juovan intensiteetti on hopeavärjättiin geeli, sekä Immuunireaktiivisuuden jälkeen havaittiin immunoblottauksella hevosen seerumia (kuvio 1 B) tai L2-hiirten seerumin (kuvio 1 C). Kolme proteiinien 4 ulos 14 taajuusalueet antoi merkittävän pisteet (p < 0,05) ja tunnistettiin aktiini (kuva 1A, band 8), glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) (kuvio 1A, band 9) ja hemoglobiini (kuvio 1A, nauhat 13 ja 14). Eri muuttoliike malli havaittiin varten LCE3 on 1-D hopea-värjätyn geelin (kuvio 1 D). Vastaavasti immunobloteilla suoritettiin hevosen seerumia (kuvio 1 E) ja sera L3-hiirten (kuvio 1 F). Valinta 13 bändejä, nuolilla (kuvio 1 D), perustui samat kriteerit kuin edellä. Ne eristettiin edelleen tunnistamiseen MS (taulukko 2). Kymmenen proteiineja ulos 13 taajuusalueet antoi merkittävän pisteet (p < 0,05) ja tunnistettiin alfa-ketjun toukkien seerumin proteiinin (kuvio 1D, nauhat 1-4), arylphorin (kuvio 1D, band 6), beeta-ketju toukkien seerumin proteiinin (kuvio 1D, band 7), hemoglobiini (kuvio 1D, nauhat 10-12) ja mureiini- lipoproteiinin (kuvio 1D, band 13) .table 1 Massaspektrometria tunnistaminen proteiinien tunnistettiin päässä LCE L2.
Band ID
Protein nimi
Laji
Liittymisnumero

MW (Da)
pl
Protein pisteet
8
Protein samanlainen Actin-87e isoformia 2
banaanikärpänen

AAM29410
37816
5,36
223
9
glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi
Drosophila hydei
S24630
35369
8,2
224
13
Hemoglobiini
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8,44
440
14
Hemoglobiini
Gasterophilus intestinalis

O96457
17912
8,44
144
paikkoja toimeksiantoja katso kuva 1. proteiinit lueteltu on havaittu suuri todennäköisyys maalin p < 0,05 msdb.
Taulukko 2 Massaspektrometria tunnistaminen proteiinien tunnistettiin päässä LCE L3.
Band ID

proteiini nimi
Laji
Liittymisnumero

MW (Da)
pl
Protein pisteet

1
Toukkien seerumiproteiiniin 1 alfaketjulle esiaste
banaanikärpänen
LSP1A_DROME
98802
5,72
92
2
Toukkien seerumiproteiiniin 1 alfa-ketjun esiaste
banaanikärpänen
LSP1A_DROME
98802
5,72
89
3
Toukkien seerumiproteiiniin 1 alfaketjulle esiaste
banaanikärpänen

LSP1A_DROME
98802
5,72
98
4
Toukkien seerumiproteiiniin 1 alfaketjulle esiaste
banaanikärpänen
LSP1A_DROME
98802
5,72
102
6
Arylphorin alayksikköä A4 edeltäjä
Calliphora vicina
ARY1_CALVI
92282
5,59
71
7
Toukkien seerumiproteiiniin 1 beta ketju esiaste
banaanikärpänen
LSP1B_DROME
95849
5,41
69
10
Hemoglobiini
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8,44
247
11
Hemoglobiini
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8,44
132
12
Hemoglobiini
Gasterophilus intestinalis
LPEBWM
17912
8,44
112
13
Major ulkokalvon lipoproteiini esiaste (mureiini--lipoproteiini) B Pectobacterium atrosepticum
LPP_ERWCT
8396
9,36
69
paikkoja toimeksiantoja katso kuva 1. proteiinit lueteltu on havaittu suuri todennäköisyys maalin p < 0,05 (1, 2, 3, 4, 6, 7, 13: Expasy tietokanta, 10, 11, 12: msdb).
Kuva 1 1-D analyysi LCE L2 ja L3. Tyypillinen 1-D hopeavärjätyn geelin LCE L2 (A) ja L3 (D). Nuolet osoittavat bändejä, jotka valittiin massaspektrometriaa. Western blot-analyysi L2 inkuboitiin hevosen seerumia (B) ja hiiren seerumia (C). Western blot-analyysi L3 inkuboitiin hevosen seerumia (E) ja hiiren seerumia (F). Proteiinin tunnistus MS on esitetty taulukossa 1 ja 2.
2-D analyysi LCE L2
proteiinin migraatio LCE L2 on 2-D-geelillä (kuvio 2A) osoitti, että läsnä on proteiinit pitkin pH taajuuksia. Western blotit suoritettiin L2-hiirillä seerumia (kuvio 2B) ja hevosen seerumilla (kuvio 2C). Hopea-värjätyn geelin käytettiin yhdenmukaistaa havaittu proteiinitäplien molemmilla immunoblot profiileja. Suurempi valikoima immunologiseen reaktiivisen proteiineihin havaittiin hevosen immunoblot profiilin kuin L2-hiiret immunoblottaus. Ympyrät ilmaisevat 12 kohtia, jotka katsottiin immuno-reaktiivinen L2-hiirillä seerumia (kuvio 2A, paikkoja: 1, 2, 6, 8, 14-20, 25) ja nuolet osoittavat 24 kohtia, jotka katsottiin immuunijärjestelmän kanssa reaktiivisia hevosen seerumia (Kuvio 2A, paikkoja: 1-13 ja 16-26). Yhteensä 26 kohdetta valittiin MS-analyysiä (taulukko 3). Niistä 26 on valittu paikkoja, 7 proteiinit onnistuneesti tunnistaa (p < 0,05) MS: paramyosin (kuvio 2A, spot 1), seerumin albumiini (kuvio 2A, spot 5), tubuliinin (kuvio 2A, spot 9), enolaasi ( kuviossa 2A paikalla 11), tropomyosin (kuvio 2A, spot 14), GAPDH (kuvio 2A, paikalla 19) ja hemoglobiini (kuvio 2A, spot 20) .table 3 Massaspektrometrinen tunnistettujen proteiinien tunnistettiin päässä LCE L2.
Spot ID
Protein nimi
Laji
Liittymisnumero

MW (Da)
pl
Protein pisteet
1
Paramyosin
banaanikärpänen
S22028
102277
5,5
97
5
seerumialbumiini edeltäjä
Bos taurus
ABBOS
69225
5,8
99
9
Tubulin alfa-1-ketjun
banaanikärpänen
A26488
49876
5,0
260
11
enolaasin
Oryza sativa
Q7XBE4
47942
5,4
80
14
Tropomyosin
banaanikärpänen
C25242
32740
4,7
78
19
Glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin
Drosophila hydei
S24630
35369
8,2
100
20
Hemoglobiini
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8,4
209
paikkoja toimeksiantoja katso kuva 2. proteiinit lueteltu on havaittu suuri todennäköisyys maalin p < 0,05 msdb.
Kuva 2 2-D analyysi LCE L2. Hopeavärjätyssä edustava 2-D-proteiinin kartta LCE L2 käsittää pH-gradientti 3-11 kanssa MW: ranking 10-250 kD (A). Hopea-värjätyn geelin käytettiin yhdenmukaistaa havaittu proteiinia läiskät Western blotit suoritettiin seerumin immunisoitujen hiirten kanssa LCE L2 (B) ja hevosen seerumilla (C). Ympyrät osoittavat täplät, jotka olivat immunolabelled hiirillä seerumin (B; huomasi 1,2,6,8,14-19,25,26) ja nuolet osoittavat paikkoja, jotka olivat immunolabelled hevosen seerumia (C; huomasi 1-13 ja 16-26). Kaikkiaan 26 täplät eristettiin edelleen MS tunnistamiseen. Proteiini tunnistus MS on esitetty taulukossa 3.
2-D analyysi LCE L3
proteomic profiili LCE L3 esitetty kuvassa 3A osoittaa, että useimmat proteiinit sijaitsevat basidic alueella välillä pH 7-11. Western blotit suoritettiin L3-hiirillä seerumia (kuvio 3B) ja hevosen seerumilla (kuvio 3C). Intensiteetti immuunireaktion eroaa, kun LCE L3 valotetaan L3-hiirillä seerumin tai hevosen seerumia, mutta immunoblot olivat samanlaisia. Sen jälkeen, kun vertailu immunoblot kanssa hopea-värjätyn geelin, 39 paikkoja, merkitty ympyröillä valittiin edelleen, MS-tunnistaminen (taulukko 4). 19 ulos 39 tiemme onnistuneesti tunnistaa (p < 0,05), mikä vastaa 8 eri proteiinia: filamiini (kuvio 3A, spot 1), lämpösokkiproteiinin (HSP-70) (kuvio 3A, spot 2), seerumialbumiini esiaste (kuvio 3A, spot 3,18-20), fosfoenolipyruvaattikarboksikinaasi (PEPCK) (kuvio 3A, spot 8), enolaasin (kuvio 3A, spot 22,23), fumarase (kuvio 3A, spot 1), beeta-aktiini ( Kuva 3A, spot 27), hemoglobiini (kuvio 3A, spot 32-39) .table 4 Massaspektrometrinen tunnistettujen proteiinien tunnistettiin päässä LCE L3.
Spot ID
Protein nimi
Laji
Liittymisnumero

MW (Da)
pl

Protein pisteet
1
filamiini 1
banaanikärpänen
Q8T3K7
151931
5,72
76
2
Lämpöshokki 70 kDa proteiini 70C
banaanikärpänen
HSP7A_DROME
70871
5,34
70
3
seerumialbumiinia
Bos taurus

AAN17824
71274
5,82
171
8
fosfoenolipyruvaattikarboksikinaasi
banaanikärpänen
PPCK_DROME
71882
6,07
79
18
seerumialbumiinia edeltäjä
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
108
19
seerumialbumiinia edeltäjä
Bos taurus

ALBU_BOVIN
71244
5,82
117
20
seerumialbumiinia edeltäjä
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
165
22
enolaasi (fragmentti) B Drosophila subobscura
O44101
44548
5,92
142
23
enolaasin
Halkiomadot mansoni

ENO_SCHMA
47421
6,18
163
24
Fumarase
banaanikärpänen
Q9VTI5
51239
8,47
111
27
Beta-aktiini
Danio rerio
ACTB1_BRARE
42082
5,3
184
32
Hemoglobiini
Gasterophilus intestinalis

O96457
18026
8,44
95
33
Hemoglobiini
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
113
34
Hemoglobiini
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
131
38
Hemoglobiini
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
415
39
Hemoglobiini
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
410
paikkoja toimeksiantoja viittaavat Kuva 3. proteiinit luetteloitu ole havaittu merkittävää todennäköisyydellä maalin p < 0,05 (2, 8, 18, 19, 20, 23, 27: Expasy tietokanta, 1, 3, 22, 24, 32, 33, 34, 38, 39: msdb).
Kuvioon 3 2-D analyysi LCE L3. Hopeavärjätyssä edustava 2-D-proteiinin kartta LCE L3 käsittää pH-gradientti 3-11 kanssa MW: ranking 10-250 kD (A). Hopea-värjätyn geelin käytettiin mukauttamaan havaitaan proteiinin läiskät Western blotit suoritettiin seerumin immunisoitujen hiirten kanssa LCE L3 (B) ja hevosen seerumilla (C). 39 täplät immunolabelled sekä seerumit eristettiin edelleen MS tunnistamiseen. Proteiini tunnistus MS on esitetty taulukossa 4.
Keskustelu
vertailu muuttovirtoja LCE2 ja LCE3 sekä kolmiulotteinen analyysi (1-D ja 2-D), osoittaa, että toukka proteiinimolekyylien profiili on vaihespesifisellä, mikä viittaa erilaisen koostumuksen toukkien aineenvaihduntaa ja antigeeniset ominaisuudet. 1-D hopeavärjätyssä geelejä toukka raakauutteet osoitti hyvin tiheä pitoisuus proteiinit; joten linjaus immunologiseen reaktiivinen bändit havaittiin hevosella ja hiiret saattavat aiheuttaa joitakin eroja. Proteomiikan lähestymistapa vahvisti erityisen valkuaisaineen profiilia sekä toukka-asteet ja annettiin parempi tunnistaminen eri paikoista.
Hiiret keinotekoisesti vastaan ​​immunisoitujen raakavalkuaisen ote koko toukkia. Suuri määrä proteiineja, jotka eivät yleensä ole suoraan hevosen kanssa esitettiin immuunijärjestelmän hiirissä. Lisäksi toisin kuin luonnollisen infektion nostattamaan hevonen immuunireaktion, ihon alle hiiriin indusoi systeemistä immuunireaktion siirtynyt Th1 vastausta adjuvanttia. Tämä ero immuunireaktion selittää sen, että suurin osa L2 ja L3 proteiineja, jotka reagoivat hiirien seerumit osoittivat voimakkaampi signaali verrattuna reaktio hevosen seerumia. Koska elinkaaren G. intestinalis
esiintyy maha-suolikanavan hevosten, limakalvon immuunijärjestelmä on kosketuksissa toukat ja siten altistunut erittyvän tai erittyy aineet aikana toukkien muuttoliikettä ja kehitystä [18]. Vaikka L2 muuttoliike suusta vatsaan jää epäselväksi, immuunireaktion havaittu hevosten ja kokeellisesti immunisoiduissa hiirissä voisi päätellä, että toukka L2 hallussaan enemmän antigeeniproteiinien kuin toukka L3, luultavasti hyödyllinen toukka entsymaattiseen muuttoliike [19]. Näin ollen, enolaasi identifioitiin MS: n ja on aikaisemmin raportoitu olevan tärkeä entsyymin paikallista pinnalla useiden patogeenien tunkeutuessaan kudokseen [20]. L2 on vaihe aiheuttamaan vahvan isännän immuunivasteen niin, että sen kehitystä L3 mahassa saattaa olla puolustusmekanismi toukkien ohittaa hevosen immuunipuolustusta. Toisaalta, se seikka, että L3 on kiinni ja 8-10 kuukautta vatsan seinämän ehdottaa hypometabolinen tilan tai vähentää immunogeenisia ominaisuuksia. Tämä voi selittää heikko immuunireaktion havaittu, kun läsnä on hevosen seerumia vastaan ​​L3.
Kaksi tärkeää toukkien proteiineja, arylphorin ja LSP-2 (toukka seerumin proteiini), vastaavasti, jotka ovat homologisia Calliphora vicina
ja Drosophila melanogaster
, tunnistettiin L3. Vuonna holometabolous hyönteiset rakentaminen aikuisen kudoksissa aikana muodonmuutos vaatii suuren määrän energiaa. On tunnettua, että ennen muodostamista puparium, rasvaa kehon solut reabsorb proteiinien ja muiden makromolekyylien, jotka ovat kertyneet hemolymfan aikana toukan syömiseen aikana [21]. Tärkeimmät osa sisällytetty proteiinien koostuu arylphorins ja LSP-2 [22]. Lisäksi hemoglobiini tunnistettiin molemmissa toukka G. intestinalis
. Tämä runsas ja kiertävä molekyyli on läsnä erittäin tracheated muodostavat solut posterior spiracular levyn ja mahdollistaa toukat hyödyntämään paremmin kosketus ajoittaista, kun ilma on nieltävä ruoan [23].
Useimmat muut tunnistettu proteiinien L2 (paramyosin , tubuliinin, tropomyosin, GAPDH ja proteiinin samanlainen aktiini) tai L3 (filamiini, fumarase, PEPCK, HSP-70, enolaasi) jaetaan kuin Drosophila
spp. viittaa siihen, että rakenteelliset tai metabolisen homologioista olemassa näiden lajien.
aikana tutkimuksen, eri suoliston loiset (Anoplocephala perfoliata
, Parascaris equorum
, Cyathostominae) olivat samanaikaisesti läsnä G. intestinalis
maha -intestinal suolikanavan teurastettujen hevosten. Riski ristireaktiivisuus on vielä arvioitava. Mutta toisin kuin jotkut immunologisia tutkimuksia suoliston loismatoja in hevoseläimille [24-26], rajat reaktiivisuus välillä G. intestinalis
ja ruuansulatuselimistön loiset ei ole vielä tutkittu.
Työ antaa lisätietoa osaksi ymmärtämistä vuorovaikutus G. intestinalis
ja niiden isäntä ja tukemalla uutta järjestelmää on proteomic profiilin tärkeimmät toukkavaiheet. Täten tuloksemme osoittavat lisäksi monimutkaisuuden isäntä-loinen vuorovaikutus. Itse asiassa, tämä tutkimus osoittaa, että on tarpeen kehittää luotettava serologinen työkalu havaitsemaan saastuneen hevosia, erityisesti siksi, että ainoa keino havaita G. intestinalis
tartuntoja tapahtuu ruumiinavaus.
Tunnistaminen useimpien proteiinien on seuraava vaihe määritellä niiden rooli, niiden solu- tai kudos lokalisointi ja niiden mahdolliset antigeeniset ominaisuudet. Tool menetelmät
Toukkien keräys ja antigeenin valmistelu
Gasterophilus
spp. L2 ja L3 kerättiin mahanportin osasta mahan hevosten peräisin kahdesta sijaitsevien maatilojen District Sveitsin Jura; Delémont: N 47 ° 21 '; E 7 ° 20 ', Sveitsi. Samalla, maha-suolikanavan kunkin eläimen tutkittiin ja läsnäolo P. equorum
, A. perfoliata
ja Cyathostominae havaittu missään tapauksessa.
Kaikki toukat kerättiin pestiin steriilissä fosfaatti suolaliuosta (PBS 0,1 M, pH 7,2), jotka on nimetty G. intestinalis
perusteella morfologiset avaimet [1], ja jäädytettiin -20 ° C: ssa.
varten valmistamiseksi toukkien raakauutteet, 10 L2 toukat korjataan kahdella eri hevosta on samassa laumassa ja seitsemän L3 toukkia korjatut yksi hevonen peräisin toisesta karjasta, sonikoitiin ja homogenisoitiin jäissä steriileissä olosuhteissa. Homogenaatti uutettiin yön yli 0,1 M pH-arvon 9,6 karbonaattia, joka sisälsi 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia fluorid (PMSF) ja 5 mM ethylenediamin tetraetikkahappoa (EDTA) lisäämällä siihen 1 ml /g, joka proteaasi-inhibiittorin (Sigma-Aldrich, Buchs, Sveitsi) . Uutteet sentrifugoitiin 20.000 x g
30 minuuttia (4 ° C). Supernatantti, joka sisältää antigeenejä kerättiin ja lopullinen proteiinipitoisuus määritettiin spektrometria (Bradfordin menetelmällä, BioRad). LCE lyofilisoitiin ja varastoitiin -20 ° C: ssa.
Hevonen seeruminäytteet
Verinäytteet otettiin ryhmä kahdenkymmenen hevosten peräisin kahden tilan edellä kuvattua aluetta. Vaikka verinäytteitä ja toukkien kokoelma ei voitu tehdä samoille eläimille meidän tehtyjen havaintojen aikana suoritetaan samanaikaisesti epidemiologinen tutkimus (Roelfstra et ai, in prep.), Mukaan lukien kenttähavainnot elävien eläinten ja teurastamoissa, vahvisti korkean endemisöityminen of G. intestinalis
aikaisemmin kuvannut Brocard [19] kanssa samalla alueella ja antavat meille mahdollisuuden olettaa, että kaikki hevoset käytettiin tässä tutkimuksessa on saastuttamia G. intestinalis
. Sikiön hevosen seerumia käytettiin negatiivisena kontrollina Western blotit. Veri sentrifugoitiin 3500 x g
15 minuuttia huoneen lämpötilassa ja seerumit säilytettiin -20 ° C: ssa.
Hiirien immunisointi ja seeruminäytteitä
Balb /c-hiiret immunisoitiin LCE L2 (L2 hiiret) tai LCE L3 (L3 hiiriä) alkaen G. intestinalis
. Kaksi grammaa L3 ja kaksi grammaa L2 sonikoitiin, homogenoitiin steriilissä PBS-puskurissa, pH 7,2 ja sentrifugoitiin 20'000 × g
. Sitten supernatantti emulgoitiin yhtä suureen tilavuuteen Freundin epätäydellinen adjuvantti (Sigma-Aldrich, Buchs, Sveitsi).
Annos 100 ug proteiinia /hiiri, on 200 ui, injektoitiin lihakseen 2 viikon välein läpi 6 viikkoa. Eläimistä otettiin verta seitsemän viikon kuluttua ensimmäisen immunisaation osalta. Kontrollihiiret rokotettiin yhdistelmä PBS: llä ja Freundin epätäydellinen adjuvantti joka kerta edellä. Otokseen verta sentrifugoitiin 3500 x g
15 minuuttia huoneen lämpötilassa ja seerumit säilytetään -20 ° C: ssa. Kaikki toimenpiteet hyväksyttiin paikallisen vastaavan komitean eläinkokeista.
Yksiulotteiset elektroforeesilla (1-D)
proteiinit L2 (5 ug /kuoppa) ja L3 (5 ug /kuoppa) erotettiin kaltevuus SDS -sivu geelit (4-20%) pelkistävissä olosuhteissa (2-β-merkaptoetanolia, 95 ° C 5 min). Elektroforeesi suoritettiin 80/100 V 30 min /2 tuntia. Yhdet geelien värjättiin hopealla varten massaspektrometriaa, ja toinen siirrettiin nitroselluloosakalvoille (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi) Western blot -analyysiin.
Kaksiulotteinen elektroforeesi (2-D) B Lyofilisoitu LCE näytteet liukoisiksi 2-DE lyysipuskuria (9 M ureaa, 2 M tioureaa, 1% dithioerythriol, 4% CHAPS, 2,5 uM EGTA, ja 2,5 uM EDTA). Immobiline- kuiva nauhat pH 3-11 epälineaariset, 11 cm (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi) upotettiin yöksi lyysipuskuriin joka sisälsi 75 ug proteiinia näyte, lisäksi 1% Pharmalyte pH 3-10 (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi), ja 0,5% bromifenolisinistä. IEF on Multiphor (GE Healthcare) ja 15 kV: · h 20 ° C: ssa ja sen jälkeen erottamalla kaltevuus SDS-PAGE-geeleillä (9-15%) on vakio 45 V geeliä kohti. Yhdet geelit värjättiin hopealla MS ja toinen siirrettiin nitroselluloosakalvoille (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi) Western blot -analyysiin.
Western blot-analyysi (WB) B Epäspesifinen sitoutuminen blokattiin 1% polyvinyylipyrrolidonia PBS-Tween: ssa 1 tunti. Blotteja jälkeen sitä inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen PBS-Tween (yön yli 4 ° C: ssa, hevosen seerumia tai hiirillä sera 1: 1000) ja pestiin. Immunoreaktiivisia täplät havaittiin käyttäen vuohen anti-hiiri-IgG (H + L) (1: 20000, Nordic Immunology Laboratories, Tilburg, Hollanti) tai anti-hevonen-IgG (1: 10000, Sigma-Aldrich, Buchs, Sveitsi) vasta-aine konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin. Signaalit havaittiin ECL (tehostettu kemiluminesenssi) päälle Hyperfilm ECL (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi) [27]. Sen jälkeen ECL havaitseminen, blotit jälkeen värjättiin kolloidikultaan jotta ne vastaavat näkyviä paikkoja yleisen mallin hopeavärjätyssä geelejä.
Massaspektrometria (MS) B Valitut täplät leikattiin 2-D geelit, väri poistettiin , käsitellään proteolyysiä trypsiinillä [28] ja analysoitiin MALDI-TOF ja MS /MS MALDI-TOF /TOF tandem massaspektrometriä (ABI 4700 Proteomiikka Analyzer, Applied Biosystems). Yhdistetty PMF (peptidi massa sormenjälki) ja MS /MS kyselyt tehtiin kanssa MASCOT © Tietokanta hakukone v1.9 [29] (Matrix Science) upotettu GPS-Explorer ohjelmisto (versio 3.6, Applied Biosystem) on Swiss- Prot-tietokannan (versio 20051206, 201594 sekvenssejä; 73123101 tähteet) tai msdb (versio 20040703, 1501893 sekvenssejä; 480537664 tähdettä). Proteiini tunnistaminen katsottiin positiiviseksi (taulukot 1, 2, 3 ja 4) jos (i) todennäköisyys perustuva MOWSE pisteet [30] saatujen sekä MS ja MS /MS-analyysi oli merkitsevä (eli tulokset > 66 oli merkitsevä p < 0,05 Expasy tietokantaan, ja tulokset > 74 merkitsevä p < 0,05 msdb tietokannan; luottamusväli > 99% kuten antama GPS tutkimusmatkailija, versio 3.6); (Ii) sovitetun peptidi massat esiintyi runsaasti spektrin; ja (iii) teoreettinen molekyylipaino (MW) on merkittäviä osumia sopivat kokeellisen havaittujen arvojen.
julistukset
Kiitokset
työtä tukivat SFB 571 apurahan A5 Deeg. Kirjoittajat ovat kiitollisia professori D. Otranto ja Prof. D. D. Colwell heidän kriittisiä kommentteja.
Kirjoittajien alkuperäinen toimitti asiakirjat kuville
Alla linkkejä kirjoittajien alkuperäiset toimitti asiakirjat kuville. 13071_2008_54_MOESM1_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 1 13071_2008_54_MOESM2_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 2 13071_2008_54_MOESM3_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 3 Kilpailevat edut
Kirjoittajat ilmoittavat, että heillä ei ole kilpailevia intressejä.

• Endoskooppinen sulkeminen mahaletkun perforointien titaani lkm: neljän tapausselostus
• Valtava mahalaukun bezoar aiheuttama hunajakenno, epätavallinen komplikaatio terveys faddism: tapausselostus