Proteine ​​profilo di espressione di Gasterophilus intestinalis larve causando cavallo myiasis gastrica e caratterizzazione del profilo di cavallo immunitario espressione reaction

Proteina del intestinalis Gasterophilus
larve causano cavallo myiasis gastrica e la caratterizzazione di cavallo reazione immunitaria
Abstract
sfondo
Poche informazioni è disponibile l'aspetto immunologico dei parassiti Gasterophilus intestinalis
larve (Ditteri, Oestridae) causando cavallo miasi gastrico. Gli obiettivi di questa ricerca sono stati per analizzare il contenuto di proteine ​​di estratti grezzi larvali della migrazione secondo e terzo larve (L2 e L3) di G. intestinalis
al fine di caratterizzare la risposta immunitaria dei cavalli.
Risultati
Il profilo proteomica di L2 e L3, indagato utilizzando uno e due approcci dimensionali, ha rivelato un modello di migrazione specifica per ogni stadio larvale. Inoltre, Western blot sono stati eseguiti con sieri di cavalli e con i sieri di topi Balb /c immunizzati con gli estratti grezzi larvali di L2 o L3, rivelando una reazione immunitaria diverso nei cavalli naturalmente infetti vs
. artificialmente indotta reazione immunitaria in topi. I confronti dei profili immunoblot dimostrano che la L2 fase è più immunogeniche rispetto L3 fase più probabilmente per effetto della maggiore produzione enzimatica di L2 durante la migrazione attraverso i tessuti dell'ospite. Quindici le proteine ​​sono state identificate mediante spettrometria di massa.
Conclusione
Questo lavoro fornisce ulteriori informazioni nella comprensione dell'interazione tra G. intestinalis
e il loro ospite e contribuendo un romanzo schema del profilo di proteomica del larvale principale stadi.
Sfondo
nove specie di Gasterophilus
(Ditteri, Oestridae) mosche sono state descritte provocando, allo stadio larvale, miasi gastrointestinale in equidi. Mentre Gasterophilus intestinalis
(De Geer, 1776) e Gasterophilus nasalis
(Linnaeus, 1758) sono distribuiti in tutto il mondo e sono spesso l'unica specie segnalate in molte parti del Nuovo Mondo, le specie restanti sono riportati solo in molto limitata aree d'Europa, Paesi dell'Est [1] e Africa [2]. mosche bot adulti depositano le loro uova sui capelli dei padroni di casa in luoghi diversi a seconda delle specie di Gasterophilus
[3]. G. pecorum
è un'eccezione in quanto le femmine depongono le uova su erba, foglie e steli di piante [1]. L'infezione si verifica quando le uova sono introdotti nella bocca del cavallo da leccare animali e toelettatura. Il primo stadio larvale (L1) portelli, inizia la migrazione e la muta nel secondo stadio larvale (L2) nella cavità orale [4]. Le larve di diverse specie di Gasterophilus
sono specificamente presenti in una o più regioni del tratto gastrointestinale in cui il terzo stadio larvale (L3) rimane attaccato alla mucosa per circa 8-10 mesi [5]. I segni clinici associati con le fasi di migrazione e maturazione delle larve sono difficili da diagnosticare, ma è stato dimostrato che le diverse specie di Gasterophilus
possono causare gravi danni nel corso del loro ciclo di vita [6-9].
Nel negli ultimi anni gli studi relativi alla immunologia e immunopatologia di molti oestrid myiasis causando larve hanno aumentato a causa delle loro implicazioni importanti nella diagnostica e nei programmi di immunizzazione [10]. Mentre gli studi immunologici sono concentrate principalmente sulla Hypoderma
infezione bestiame grub [11], e le pecore oestrosis nasale da Oestrus ovis
[12], l'immunologia di Gasterophilus
spp. myiasis causato ricevuto poca attenzione. Ciò è dovuto alle difficoltà inerenti lo studio delle interazioni ospite-parassita immunologici a livello di interfaccia mucosa gastrointestinale anche. Di conseguenza, finora sono stati riportati grandi immunogeni [13]. Un singolo studio discusso lo sviluppo di anticorpi per la diagnosi di myiasis G. intestinalis
larve sebbene la specificità della reazione immunitaria non è stato testato nella comparsa di cavallo concomitante infezione parassitaria [14]. analisi più recente, molti proteomica basati, in combinazione con bidimensionale gel elettroforesi, hanno offerto un approccio globale per capire meglio i processi biologici e immunologici di agenti patogeni e malattie [15-17]. Lo scopo di questo studio è stato quello di caratterizzare L2 e L3 proteine ​​di intestinalis G.
e per analizzare la risposta immunitaria dei cavalli e topi immunizzati contro gli antigeni larvali.
Risultati
analisi 1-D del greggio estratto larvale (LCE) della migrazione del lce2 sul gel argento macchiate 1-D L2 e L3
mostrato un modello specifico (Figura 1A) con 14 gruppi che sono stati isolati dal gel per ulteriore identificazione mediante spettrometria di massa (MS) ( Tabella 1). La selezione delle bande è stata basata sulla intensità della banda sul gel d'argento macchiato, nonché l'immuno-reattività osservata dopo immunoblotting con siero di cavallo (Figura 1B) o siero L2-mice (Figura 1C). Tre proteine ​​in 4 dei 14 gruppi selezionati hanno dato un punteggio significativo (p < 0,05) e sono stati identificati come actina (Figura 1A, banda 8), gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) (Figura 1A, banda 9) ed emoglobina (Figura 1A, bande 13 e 14). Un modello migratorio diverso stata osservata per la LCE3 sul gel argento macchiate 1-D (Figura 1D). Analogamente, immunoblot sono stati eseguiti con i sieri di cavalli (Figura 1E) e siero di L3-topi (Figura 1F). La selezione delle 13 bande, indicato con le frecce (Figura 1D), si basa sugli stessi criteri di cui sopra. Sono stati isolati per ulteriore identificazione mediante MS (Tabella 2). Dieci proteine ​​dei 13 band selezionate hanno dato un punteggio significativo (p < 0,05) e sono stati identificati come la catena alfa di proteine ​​sieriche larvale (Figura 1D, bande 1-4), arylphorin (Figura 1D, banda 6), catena beta di proteine ​​del siero larvale (Figura 1D, banda 7), l'emoglobina (Figura 1D, bande 10-12) e lipoproteine ​​murein (Figura 1D, banda 13) .table 1 massa identificazione spettrometria di proteine ​​identificate dalla LCE di L2.
Banda ID
nome Protein
Specie
numero di adesione

MW (da)
pI
punteggio proteico
8
proteina simile a Actina-87E isoforma 2
Drosophila melanogaster

AAM29410
37816
5.36
223
9
Glyceraldehyde-3-fosfato deidrogenasi
Drosophila hydei
S24630
35369
8.2
224
13
emoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
17912
8.44
440
14
emoglobina
intestinalis Gasterophilus

O96457
17912
8.44
144
Spot assegnazioni si riferiscono alla Figura 1. Le proteine ​​di cui sono stati identificati con un punteggio significativo probabilità a p < 0.05 in MSDB.
Tabella 2 Massa Identificazione Spettrometria di proteine ​​identificate dalla LCE di L3.
Banda ID

nome Protein
Specie
numero adesione
Il MW (Da)
pI
punteggio proteine ​​

1 larvale siero proteina 1 catena alfa precursore
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
92 2
larvale siero proteine ​​1 catena alfa precursore
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
89 3
larvale proteine ​​del siero 1 alfa catena precursore
Drosophila melanogaster

LSP1A_DROME
98802
5,72
98 4
larvale proteine ​​sieriche catena alfa 1 precursore
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5.72
102
6
Arylphorin subunità A4 precursore
Calliphora vicina
ARY1_CALVI
92282
5.59
71 7
larvale siero proteine ​​beta 1 catena precursore
Drosophila melanogaster
LSP1B_DROME
95.849
5.41
69 10
emoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
17912
8.44
247
11
emoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
17912
8.44
132
12
emoglobina
intestinalis Gasterophilus
LPEBWM
17912
8.44
112
13
Maggiore esterno lipoproteine ​​membrana precursore (Murein-lipoproteine)
Pectobacterium atrosepticum
LPP_ERWCT
8396
9.36
69
Spot assegnazioni si riferiscono alla Figura 1. Le proteine ​​di cui sono stati identificati con un punteggio significativo probabilità a p < 0,05 (1, 2, 3, 4, 6, 7, 13: dati ExPASy; 10, 11, 12: MSDB).
Figura 1 analisi 1-D della LCE di L2 e L3. Rappresentante 1-D gel argento macchiate di LCE di L2 (A) e L3 (D). Le frecce indicano le band che sono state selezionate per la spettrometria di massa. Analisi Western blot di L2 incubate con siero di cavallo (B) e siero di topo (C). Analisi Western blot di L3 incubate con siero di cavallo (E) e siero di topo (F). L'identificazione delle proteine ​​mediante MS è presentato in Tabella 1 e 2.
analisi 2-D della LCE di L2
La migrazione proteine ​​della LCE di L2 su un gel 2-D (Figura 2A) ha mostrato la presenza di proteine ​​lungo tutto lo spettro pH. Western blot sono stati eseguiti con L2-topi siero (Figura 2B) e siero di cavallo (Figura 2C). Il gel d'argento-colorato è stato utilizzato per allineare spot proteici rilevati su entrambi i profili immunoblot. È stata osservata una grande gamma di proteine ​​immuno-reattiva sul profilo immunoblot cavallo che sulla immunoblot L2-topi. Cerchi indicano 12 punti che sono stati considerati come immuno-reattivo con L2-topi siero (Figura 2A, macchie: 1, 2, 6, 8, 14-20, 25) e le frecce indicano 24 spot che sono stati considerati come immunitario reattivo con siero di cavallo (Figura 2A, macchie: 1-13 e 16-26). Un totale di 26 punti sono stati selezionati per MS analisi (Tabella 3). Tra i 26 punti selezionati, 7 proteine ​​sono state identificate con successo (p < 0,05) da MS: paramyosin (Figura 2A, punto 1), l'albumina sierica (Figura 2A, punto 5), tubulina (Figura 2A, punto 9), enolasi ( Figura 2A, posto 11), tropomiosina (Figura 2A, posto 14), GAPDH (Figura 2A, spot 19) ed emoglobina (Figura 2A, posto 20) .table 3 massa identificazioni spettrometriche di proteine ​​identificate dalla LCE di L2.
Spot ID
nome Protein
Specie
numero adesione

MW (Da)
pI
punteggio proteine ​​
1
Paramyosin
Drosophila melanogaster
S22028
102.277
5.5
97
5
siero albumina precursore
Bos taurus
Abbos
69225
5.8
99
9
tubulina alfa-1 catena
Drosophila melanogaster
A26488
49876
5,0
260
11
Enolasi
Oryza sativa
Q7XBE4
47942
5.4
80
14
tropomiosina
Drosophila melanogaster
C25242
32740
4.7
78
19
gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi
Drosophila hydei
S24630
35369
8.2
100 | 20
emoglobina
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8.4
209
Spot assegnazioni si riferiscono alla figura 2. Le proteine ​​di cui sono stati identificati con un punteggio significativo probabilità a p < 0.05 in MSDB.
Figura 2 Analisi 2-D della LCE di L2. rappresentante 2-D map proteina argento macchiate della LCE di L2 comprendente gradiente di pH dal 3 all'11 con i MWs ranking da 10 a 250 KDa (A). Il gel d'argento macchiato è stato usato per allineare spot proteici identificati sui Western blot effettuati con siero di topi immunizzati con il LCE di L2 (B) e con siero di cavallo (C). I cerchi indicano i punti che sono stati immunolabelled con i topi il siero (B; macchie 1,2,6,8,14-19,25,26) e le frecce indicano i punti che sono stati immunolabelled con siero di cavallo (C; macchie 1-13 e 16-26). Un totale di 26 punti sono stati isolati per ulteriore identificazione MS. L'identificazione delle proteine ​​da MS è presentato nella tabella 3.
analisi 2-D della LCE di L3
Il profilo proteomico della LCE di L3 presentato in figura 3A mostra che la maggior parte delle proteine ​​si trovano in una gamma basidic tra pH 7-11. Western blot sono stati eseguiti con L3-topi siero (Figura 3B) e siero di cavallo (Figura 3C). L'intensità della reazione immunitaria differisce quando LCE di L3 è esposto con L3-topi siero o con siero di cavallo, ma i profili immunoblot erano simili. Dopo confronto dei immunoblot con il gel argento macchiate, 39 punti, indicati da cerchi sono stati selezionati per ulteriore identificazione MS (Tabella 4). 19 dei 39 luoghi isolati sono stati identificati con successo (p < 0,05), corrispondenti a 8 diverse proteine: filamin (Figura 3A, punto 1), il calore shock protein (HSP-70) (Figura 3A, punto 2), albumina sierica precursore (Figura 3A, individuare 3,18-20), fosfoenolpiruvato carbossichinasi (PEPCK) (Figura 3A, punto 8), enolasi (Figura 3A, spot 22,23), fumarasi (Figura 3A, punto 1), beta-actina ( Figura 3A, posto 27), l'emoglobina (Figura 3A, individuare 32-39) .table 4 massa spettrometriche identificazioni di proteine ​​identificate dalla LCE di L3.
Spot ID
nome Protein
Specie
numero di adesione
MW (Da)
pI

punteggio proteine ​​
1
Filamin 1
Drosophila melanogaster
Q8T3K7
151.931
5,72
76 Pagina 2
scossa di calore 70 kDa proteina 70C
Drosophila melanogaster
HSP7A_DROME
70871
5.34
70 3
albumina sierica
Bos taurus

AAN17824
71274
5,82
171 Pagina 8
fosfoenolpiruvato carbossichinasi
Drosophila melanogaster
PPCK_DROME
71.882
6,07
79
18
siero albumina precursore
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
108
19
siero albumina precursore
Bos taurus

ALBU_BOVIN
71244
5,82
117
20
siero albumina precursore
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
165
22
Enolasi (frammento)
Drosophila subobscura
O44101
44548
5.92
142
23
Enolasi
Schistosoma mansoni

ENO_SCHMA
47421
6.18
163
24
fumarasi
Drosophila melanogaster
Q9VTI5
51239
8.47
111
27
Beta-actina
Danio rerio
ACTB1_BRARE
42082
5.3
184
32
emoglobina
intestinalis Gasterophilus

O96457
18026
8.44
95
33
emoglobina
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8.44
113
34
emoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
18026
8.44
131
38
emoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
18026
8.44
415
39
emoglobina
intestinalis Gasterophilus
O96457
18026
8.44
410
Spots assegnazioni si riferiscono a Figura 3. Le proteine ​​elencati sono stati identificati con un punteggio significativo probabilità a p < 0,05 (2, 8, 18, 19, 20, 23, 27: dati ExPASy, 1, 3, 22, 24, 32, 33, 34, 38, 39: MSDB)
Figura 3 Analisi 2-D di. LCE di L3. rappresentante 2-D map proteina argento macchiate della LCE di L3 comprendente gradiente di pH dal 3 all'11 con i MWs ranking da 10 a 250 KDa (A). Il gel d'argento macchiato è stato usato per allineare spot proteici identificati sui Western blot effettuati con siero di topi immunizzati con il LCE di L3 (B) e con siero di cavallo (C). 39 punti immunolabelled sia con sieri sono stati isolati per ulteriore identificazione MS. L'identificazione delle proteine ​​da MS è presentato nella Tabella 4.
Discussione
Il confronto dei modelli di migrazione del lce2 e LCE3 sia in analisi dimensionale (1-D e 2-D), indica che il profilo proteico larvale è fase specifica, suggerendo una diversa composizione nel metabolismo larvale e proprietà antigeniche. I gel d'argento macchiato 1-D degli estratti grezzi larvali hanno indicato una densa concentrazione di proteine; di conseguenza l'allineamento delle bande immuno-reattiva rilevati cavallo e topi potrebbe presentare alcune differenze. L'approccio di proteomica ha confermato il profilo proteina specifica di entrambi gli stadi larvali e ha permesso una migliore identificazione dei diversi punti.
I topi sono stati immunizzati contro artificialmente un estratto proteico greggio da tutta larve. Un gran numero di proteine ​​che normalmente non sono direttamente in contatto con i cavalli sono stati presentati al sistema immunitario dei topi. Inoltre, a differenza infezione naturale ad una reazione immunitaria cavallo, iniezione sottocutanea in topi induce una reazione immunitaria sistemica spostato ad una risposta Th1 dal adiuvante. Questa differenza di reazione immunitaria spiega il fatto che la maggior parte delle proteine ​​L2 e L3 che reagivano con i topi sieri mostrato un segnale più intenso rispetto alla reazione con sieri cavallo. Poiché il ciclo di vita di G. intestinalis
si verifica nel tratto gastro-intestinale dei cavalli, il sistema immunitario mucosale è in contatto con le larve e quindi esposto a sostanze escrete secrete o durante la migrazione e sviluppo [18] larvale. Anche se i modelli di migrazione L2 dalla bocca allo stomaco rimane poco chiaro, la reazione immunitaria rilevato nei cavalli e nei topi immunizzati sperimentalmente potrebbe suggerire che la L2 stadio larvale possiede proteine ​​antigeniche di più rispetto alla L3 stadio larvale, probabilmente utili per la migrazione enzimatica larvale [19]. Pertanto, enolasi è stato identificato da MS ed è stata precedentemente segnalato come un importante enzima localizzato sulla superficie di vari agenti patogeni quando invadere il tessuto [20]. L2 è una fase indurre una forte risposta immunitaria in modo che il suo sviluppo in L3 nello stomaco potrebbe essere un meccanismo di difesa delle larve per bypassare i cavalli difese immunitarie. Al contrario, il fatto che L3 rimane attaccato per 8-10 mesi alla parete dello stomaco suggerisce uno stato ipometabolico o ridotte proprietà immunogeniche. Questo può spiegare la reazione immunitario debole osservata in presenza di siero di cavallo contro il L3
. Due importanti proteine ​​larvali, arylphorin e LSP-2 (proteina del siero larvale), rispettivamente, omologhe a Calliphora vicina
e Drosophila melanogaster
, sono stati identificati nel L3. In insetti olometaboli la costruzione di tessuti adulti durante la metamorfosi richiede una grande quantità di energia. È noto che prima della formazione del puparium, le cellule adipose riassorbono proteine ​​e altre macromolecole che si sono accumulati nel emolinfa durante il periodo di alimentazione larvale [21]. La frazione maggiore di proteine ​​incorporate consiste arylphorins e LSP-2 [22]. Inoltre, l'emoglobina è stato identificato in entrambi gli stadi larvali di G. intestinalis
. Questa abbondante e circolanti molecola è presente nelle cellule altamente tracheated che formano la piastra spiracular posteriore e permette le larve di fare un uso migliore di contatto intermittente quando l'aria viene ingerito con gli alimenti [23].
Maggior parte delle altre proteine ​​identificate in L2 (paramyosin , tubulina, tropomiosina, GAPDH e una proteina simile a actina) o in L3 (filamina, fumarasi, PEPCK, HSP-70, enolasi) sono condivisi con quelli di Drosophila
spp. suggeriscono che esistono omologie strutturali o metaboliche tra queste specie.
Durante questa ricerca, diversi parassiti intestinali (Anoplocephala perfoliata
, Parascaris equorum
, Cyathostominae) erano contemporaneamente presenti con intestinalis G.
nella gastro tratto -intestinal dei cavalli macellati. Il rischio di cross-reattività è ancora da valutare. Ma a differenza di alcuni studi immunologici su elminti intestinali in equidi [24-26], la cross-reattività tra intestinalis G.
e parassiti gastrointestinali non è stato ancora studiato.
Questo lavoro fornisce ulteriori informazioni nella comprensione della l'interazione tra intestinalis G.
e il loro ospite e contribuendo un romanzo schema del profilo proteomica dei principali stadi larvali. Così i nostri risultati dimostrano ulteriormente la complessità di questa interazione ospite-parassita. In effetti, questo studio rivela la necessità di sviluppare uno strumento sierologico affidabile per rilevare i cavalli infestate, in particolare perché l'unico mezzo per rilevare un G. intestinalis
infestazione è da necroscopia.
L'identificazione della maggior parte delle proteine ​​sarà il prossimo passo per definire il loro ruolo, la loro localizzazione cellulare o tissutale e le loro potenziali proprietà antigeniche.
Metodi
la raccolta e l'antigene larvale preparazione
Gasterophilus
spp. L2 e L3 sono stati raccolti dalla porzione pilorica dello stomaco di cavalli provenienti da due allevamenti situati nel distretto del Giura svizzero; Delémont: N 47 ° 21 '; E 7 ° 20 ', Svizzera. Contemporaneamente, il tratto gastro-intestinale di ogni animale è stato esaminato ed è stata osservata la presenza di P. equorum
, A. perfoliata Comprare e Cyathostominae in ogni caso.
Tutte le larve raccolti sono stati lavati in un fosfato sterile salina tamponata (PBS 0,1 M, pH 7,2), identificata come intestinalis G.
sulla base di chiavi morfologiche [1] e congelato a -20 ° C.
Per la preparazione degli estratti grezzi larvali, 10 L2 larve raccolto su due diversi cavalli di una stessa mandria, e sette L3 larve raccolte su un cavallo proveniente dalla seconda mandria, sono stati sonicato e omogeneizzato su ghiaccio in condizioni sterili. L'omogeneizzato è stato estratto durante la notte in un pH 0,1 M 9.6 tampone carbonato contenente 1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) e 5 mm di acido ethylenediamin (EDTA) con l'aggiunta di ulteriori 1 ml /gr di un inibitore della proteasi (Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera) . Gli estratti sono stati centrifugati a 20.000 xg per 30 minuti
(4 ° C). Il surnatante contenente gli antigeni sono state raccolte e il contenuto proteico finale determinato per spettrofotometria (metodo Bradford, BioRad). LCE è stato liofilizzato e conservato a -20 ° C.
Siero Campioni Cavallo I campioni di sangue sono stati prelevati su un gruppo di una ventina di cavalli provenienti dalle due aziende agricole della zona di cui sopra. Anche se i campioni di sangue e di raccolta delle larve non hanno potuto essere effettuati sugli stessi animali nostre osservazioni fatte nel corso di una indagine epidemiologica eseguita simultaneamente (Roelfstra et al, in prep.), Comprese le osservazioni sul campo su animali vivi e nei macelli, ha confermato l'alto livello di endemicità della intestinalis G.
precedentemente descritto da Brocard [19] nella stessa zona e ci permettono di presumere che tutti i cavalli utilizzati in questo studio sono infestate di G. intestinalis
. siero di cavallo fetale è stato utilizzato come controllo negativo per le Western blots. Il sangue è stato centrifugato a 3500 xg
per 15 minuti a temperatura ambiente ed il siero sono stati conservati a -20 ° C.
Immunizzazione di topi ei campioni di siero
topi Balb /c sono stati immunizzati con LCE di L2 (topi L2) o con LCE di L3 (topi L3) da G. intestinalis
. Due grammi di L3 e due grammi di L2 sono stati sonicato, omogeneizzato in un PBS sterile tampone pH 7,2 e centrifugati a 20'000 × g
. Il surnatante è stato quindi emulsionata in uguale volume di adiuvante incompleto di Freund (Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera).
Una dose di 100 mcg di proteine ​​/mouse, in un volume di 200 pl, è stato iniettato per via intramuscolare ogni 2 settimane fino 6 settimane. Gli animali sono stati dissanguati sette settimane dopo la prima immunizzazione. topi di controllo sono stati inoculati con una combinazione di PBS e Freund di adiuvante incompleto ogni volta sopra. sangue campionato è stata centrifugata a 3500 xg
per 15 minuti a temperatura ambiente e sieri conservati a -20 ° C. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato locale competente su sperimentazioni animali.
Un elettroforesi bidimensionale (1-D)
Le proteine ​​di L2 (5 mg /pozzetto) e L3 (5 mg /pozzetto) sono stati separati su gradiente di SDS gel -page (4-20%) in condizioni riducenti (2-β-mercaptoetanolo, 95 ° C per 5 min). L'elettroforesi è stata eseguita a 80/100 V per 30 min /2 ore. Una serie di gel era macchiato di argento per spettrometria di massa, e il secondo è stato trasferito su membrane di nitrocellulosa (GE Healthcare, Uppsala, Svezia) per l'analisi Western Blot.
Elettroforesi bidimensionale (2-D)
liofilizzato LCE i campioni sono stati solubilizzati in 2-DE tampone di lisi (9 M urea, 2 M tiourea, 1% dithioerythriol, 4% CHAPS, 2,5 micron EGTA, e 2,5 micron EDTA). Immobiline strisce secco pH 3-11 non lineare, 11 cm (GE Healthcare, Uppsala, Svezia) sono stati immersi per una notte in un tampone di lisi contenente campione di proteine ​​75 mg, ulteriore 1% Pharmalyte pH 3-10 (GE Healthcare, Uppsala, Svezia), e 0,5% bromofenolo blu. IEF su un Multiphor (GE Healthcare) per 15 kV · h a 20 ° C è stata seguita dalla separazione su gel SDS-PAGE (gradiente 9-15%) a costante di 45 V per gel. Una serie di gel era macchiato di argento per la SM e il secondo è stato trasferito su membrane di nitrocellulosa (GE Healthcare, Uppsala, Svezia) per l'analisi Western Blot. Legame
analisi Western Blot (WB)
non specifico è stato bloccato con 1% polivinilpirrolidone in PBS-Tween per 1 ora. Blots state successivamente incubate con l'anticorpo primario in PBS-Tween (notte a 4 ° C; sieri cavallo o topi sieri 1: 1000) e lavati. Gli spot immunoreattivi sono stati rilevati utilizzando una capra anti-topo IgG (H + L) (1: 20000, Nordic Immunology Laboratories, Tilburg, The Netherlands) o un anti-cavallo IgG (1: 10000, Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera) anticorpo coniugato con perossidasi di rafano. I segnali sono stati rilevati con ECL (chemiluminescenza) su Hyperfilm ECL (GE Healthcare, Uppsala, Svezia) [27]. Dopo la rilevazione ECL, le macchie sono stati successivamente colorate con oro colloidale al fine di corrispondere le macchie visibili a modello generale su gel d'argento macchiato
. Spettrometria di massa (MS)
spot selezionati sono stati asportati dal gel 2-D, decolorato , elaborati da proteolisi con tripsina [28] e analizzato da MALDI-TOF e MS /MS su un /TOF spettrometro di massa tandem MALDI-TOF (ABI 4700 Proteomica Analyzer, Applied Biosystems). PMF combinata (peptide di massa delle impronte digitali) e MS /MS query sono state fatte con la mascotte © v1.9 database del motore di ricerca [29] (Matrix Science) incorporato in GPS-Explorer Software (versione 3.6, Applied Biosystem) sul Swiss- banca dati Prot (versione 20.051.206; 201594 sequenze; ​​73123101 residui) o MSDB (versione 20.040.703; 1501893 sequenze; ​​480537664 residui). l'identificazione delle proteine ​​è stato considerato positivo (Tabelle 1, 2, 3 e 4) se (i) il punteggio MOWSE probabilità a base [30] ottenuti sia da MS e analisi MS /MS è stata significativa (vale a dire i punteggi > 66 sono stati significativi a p < 0,05 per il database ExPASy, e segna > 74 significativa a p < 0,05 per il database MSDB; intervallo di confidenza > 99% come dato da esploratore GPS, versione 3.6); (Ii) le masse peptidiche corrispondenti erano abbondanti nello spettro; e (iii) i pesi molecolari teorici (MW) di successi significativi si inseriscono i valori osservati sperimentali.
dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da SFB 571 concessione A5 Deeg. Gli autori sono grati al Prof. D. Otranto e Prof. D.D. Colwell per i loro commenti critici.
Autori fascicoli presentati originali per
di seguito sono riportati i link ai degli autori fascicoli presentati originali per immagini. 'file originale per la figura 1 13071_2008_54_MOESM2_ESM.pdf Autori 13071_2008_54_MOESM1_ESM.pdf autori file originale per la figura 2 file originale 13071_2008_54_MOESM3_ESM.pdf degli autori per la figura 3 interessi in competizione
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

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