Protein izraz profil Gasterophilus intestinalis ličinke povzročajo konj želodca myiasis in karakterizacijo konjske imunskega odziva

Protein izraz profil Gasterophilus intestinalis
ličinke povzročajo konj želodca myiasis in karakterizacijo konjske imunskega odziva
Abstract
Ozadje
malo informacij je na voljo na imunološko vidik parazitskih Gasterophilus intestinalis
(Diptera, Oestridae ) ličinke povzročajo konja želodca myiasis. Cilji raziskave so bili za analizo vsebnosti beljakovin ličinkah surovih izvlečkov selijo drugega in tretjega ličinke (L2 in L3) od G. intestinalis
za karakterizacijo imunski odziv konj.
Rezultati
proteomskimi profil L2 in L3, raziskovali z eno in dvodimenzionalnih pristope, je pokazala migracije vzorec so specifični za vsako stopnjo ličinke. Poleg tega so Western blots izvedli s konjskimi serumih in serumov Balb /c miši imunizirane z ličinkah surovih ekstraktov L2 ali L3, razkriva drugačen imunski odziv na naravno okuženih konj vs
. umetno izzvane imunski odziv pri miših. Primerjave profilov imunoblot kažejo, da je faza L2 več imunogeno kot fazi L3 najverjetnejše kot učinek najvišje encimske proizvodnjo L2, medtem ko se selijo prek gostiteljskih tkiv. Petnajst proteini so bile ugotovljene z masno spektrometrijo.
Zaključek
Ta del vsebuje dodatne informacije v razumevanju interakcij med G. intestinalis
in gostiteljem ter s prispevanjem novo shemo proteomske profila glavnega ličink faze.
ozadju
devet vrst Gasterophilus
(Diptera, Oestridae) muhe so opisane povzroča, v ličinkam, gastrointestinalne myiasis v kopitarjev. Medtem ko Gasterophilus intestinalis
(De Geer, 1776) in Gasterophilus nasalis
(Linnaeus, 1758) so razdeljeni po vsem svetu in so pogosto edine vrste, o katerih so poročali v mnogih delih novega sveta, so ostale vrste poročali le v zelo omejeni območja v Evropi, vzhodnih državah [1] in v Afriki [2]. bot odrasle muhe deponiranje jajca na laseh gostiteljev "na različnih lokacijah, odvisno od vrste Gasterophilus
[3]. G. pecorum
je izjema, ker ženske nesejo jajca na trave, listja in stebel rastlin [1]. Okužba se pojavi, ko so jajca vnesene konj usta živali lizanje in nego. Prva posoda faza (L1) lopute, začne selijo in goljenje v drugi posodi stopnji (L2) v ustni votlini [4]. Ličinke različnih vrst Gasterophilus
so še posebej prisotni v eni ali več regijah gastrointestinalnega trakta, kjer tretja faza ličinke (L3) ostane pritrjena na sluznici za približno 8-10 mesecev [5]. Klinični znaki, povezani s fazami migracij in zorenja v ličinke, je težko diagnosticirati, vendar se je pokazalo, da se različne vrste Gasterophilus
lahko povzroči veliko škodo v svojem življenjskem ciklu [6-9].
V preteklih letih študije o imunologije in imunopatologija mnogih oestrid myiasis povzročajo ličinke so se povečale zaradi svojih pomembnih posledic v diagnostiki in pri programih imunizacije [10]. Medtem ko so imunološke raziskave v glavnem osredotočena na Hypoderma
govedo ličink okužbe [11], in ovac nosne oestrosis s estrusa ovis
[12], je imunologije za Gasterophilus
spp. povzročila myiasis deležni le malo pozornosti. To je tudi zaradi inherentnih težav pri študiju imunološke gostiteljskih-parazit interakcije na sluznico prebavil vmesnika. Kot posledica tega doslej niso poročali o večjih Imunogene [13]. En sam študija razpravljali o razvoju protiteles za diagnostiko myiasis z G. intestinalis
ličinke čeprav specifičnost imunskega odziva ni bil preizkušen pri pojavu sočasna konj parazitske okužbe [14]. Analize v zadnjem času na osnovi proteomika-, veliko, v kombinaciji z dvodimenzionalno gelsko-elektroforeza, so ponudili celovit pristop za boljše razumevanje bioloških in imunoloških procesov patogenih organizmov in bolezni [15-17]. Namen te študije je bil na L2 in L3 proteine ​​G. intestinalis
in analizo imunski odziv konj in imuniziranih miši proti ličinkah antigenov.
Rezultati
1-D analizo posodi ekstrakta surove (LCE) od L2 in L3
migraciji na LCE2 na 1-D-srebrne obarvamo gel pokazala poseben vzorec (slika 1A) s 14 pasov, ki so bile izolirane iz gela za nadaljnjo identifikacijo s strani masne spektrometrije (MS) ( tabela 1). Izbor pasov je temeljila na intenzivnosti pasu na srebrni obarvajo gela, kot tudi imunološko reaktivnosti opazimo po imunoblotanju z konjski serum (slika 1B) ali L2-miši seruma (slika 1C). Tri beljakovine v 4 od 14 izbranih pasov je pomemben rezultat (p < 0,05) in so bili opredeljeni kot aktina (Slika 1A, trak 8), gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) (slika 1A, glasbenega 9) in hemoglobin (slika 1A, trakovi 13 in 14). Drugačen migracije vzorec je bil opažen pri LCE3 na 1-D-srebrno obarvane gelu (slika 1D). Analogno smo immunoblots izvedli s konjskimi serumov (slika 1E) in serumih L3-miši (slika 1F). Izbor 13 pasov, označena s puščicami (slika 1D), je temeljila na enakih merilih kot je opisano zgoraj. Bili so izolirani za nadaljnjo identifikacijo z MS (tabela 2). Deset proteinov od 13 izbranih pasov je pomemben rezultat (p < 0,05) in so bili ugotovljeni kot alfa verige ličinke beljakovine v serumu (slika 1D, trakovi 1-4), arylphorin (slika 1D, pasu 6), beta veriga za posodo serumskih beljakovin (slika 1D, pasu 7), hemoglobina (slika 1D, trakovi 10-12) in murein lipoprotein (slika 1D, glasbenega 13) .table 1 Masa identifikacijsko spektrometrija beljakovin, opredeljenih z Led L2.
band ID-
ime Protein
vrst
število pristop

MW (da)
pI
ocena Protein
8
Protein podoben aktina-87E izooblike 2
Drosophila melanogaster

AAM29410
37.816
5.36
223
9
gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze
Drosophila hydei
S24630
35369
8.2
224
13
hemoglobina
Gasterophilus intestinalis
O96457
17.912
8.44
440
14
hemoglobin
Gasterophilus intestinalis

O96457
17.912
8.44
144
Fleck naloge glej sliko 1. Proteini navedene so bile opredeljene s precejšnjo verjetnostjo rezultatom p < 0.05 v msdb.
Tabela 2 Masa identifikacija spektrometrija beljakovin, opredeljenih z Led s L3.
Band ID

ime Protein
vrst
dostopna številka

MW (DA)
PI

rezultat beljakovin

1
Ličinke serum protein 1 alfa veriga predhodnik
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98.802
5,72
92
2
Ličinke serum protein 1 alfa veriga predhodnik
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98.802
5,72
89
3
ličinkah serum beljakovin 1 alfa verige predhodnika
Drosophila melanogaster

LSP1A_DROME
98.802
5,72
98
4
Ličinke serum protein 1 alfa veriga predhodnik
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98.802
5,72
102
6
Arylphorin podenote A4 predhodnik
Calliphora vicina
ARY1_CALVI
92.282
5.59
71
7
Ličinke serum protein 1 beta verižni prekurzor
Drosophila melanogaster
LSP1B_DROME
95.849
5.41
69
10
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8.44
247
11
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
17.912
8.44
132
12
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
LPEBWM
17.912
8.44
112
13
Major zunanje membrane lipoprotein prekurzor (Murein-lipoprotein)
Pectobacterium atrosepticum
LPP_ERWCT
8396
9.36
69
Fleck naloge glej sliko 1. Proteini navedene so bile opredeljene s precejšnjo verjetnostjo rezultatom p < 0,05 (1, 2, 3, 4, 6, 7, 13: Expasy baza, 10, 11, 12: msdb).
Slika 1 1-D analizo LCE L2 in L3. Predstavnik 1-D-obarvajo s srebrom gel Ice L2 (A) in L3 (D). Puščice kažejo pasov, ki so bili izbrani za masne spektrometrije. Western blot analizo L2 inkubirana z konjski serum (B) in seruma miške (C). Western blot analizo L3 inkubirana z konjski serum (E) in seruma miške (F). Identifikacijska protein z MS je predstavljen v tabeli 1 in 2.
2-D analiza Led L2
migracije beljakovin v Led L2 na 2-D gel (slika 2A) je pokazala prisotnost proteini vse skupaj pH spektra. Western blots smo izvedli z L2-miši seruma (slika 2B) in konjski serum (slika 2C). Gel-srebrno obarvane je bila uporabljena za uskladitev ugotovljenih proteinske lise na obeh imunoblot profilov. Večji obseg imuno-reaktivne beljakovine so opazili na konja imunoblot profilu kot na L2-miši imunoblot je. Krogi 12 spotov, ki so bili obravnavani kot imunsko reagira z L2-miši serumu (Slika 2A, lise: 1, 2, 6, 8, 14-20, 25) in puščice kažejo 24 spotov, ki so bili obravnavani kot imunski reagira z konjski serum (Slika 2A, lise: 1-13 in 16-26). Skupno 26 vložki so bili izbrani za MS analizo (tabeli 3). Med 26 izbranimi vložki so 7 proteini uspešno označene (p 0.05) z MS: paramyosin (slika 2A, promptno 1), serum albumin (slika 2A, točkovno 5), tubulina (slika 2A, zelo 9), enolazni ( Slika 2A, spot 11), tropomiozin (slika 2A, spot 14), GAPDH (slika 2A, spot 19) in hemoglobin (slika 2A, spot 20) .table 3 masno spektrometrijo identifikacije proteinov, opredeljenih z Led L2.
računa ID
ime Protein
vrst
število pristop

MW (DA)
pI
ocena Protein
1
Paramyosin
Drosophila melanogaster
S22028
102.277
5,5
97
5
serum albumin predhodnik
Bos taurus
ABBOS
69.225
5.8
99
9
tubulinu alfa-1 veriga
Drosophila melanogaster
A26488
49876
5.0
260
11
enolazni
Oryza sativa
Q7XBE4
47.942
5.4
80
14
tropomiozin
Drosophila melanogaster
C25242
32.740
4.7
78
19
gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze
Drosophila hydei
S24630
35.369
8.2
100
20
hemoglobina
Gasterophilus intestinalis
O96457
17.912
8.4
209
Fleck naloge glej sliko 2. Proteini navedene so bile opredeljene s precejšnjo verjetnostjo rezultatom p < 0.05 v msdb.
Slika 2 2-D analizo Led L2. -Srebro obarvajo predstavnik 2-D protein karta Led na L2, ki vsebuje pH gradienta od 3 do 11 s MW razvrstitev od 10 do 250 KDa (A). Gel-obarvajo s srebrom je bila uporabljena za uskladitev odkritih proteinske lise na zahodnem blots opravljenih z serumu miši imuniziranih s LCE L2 (b) in s konjski serum (C). Krogi označujejo lise, ki so immunolabelled z miši serumu (B, je dobro videl kako 1,2,6,8,14-19,25,26) in puščice označujejo lise, ki so immunolabelled s konjskega seruma (C, je dobro videl kako 1-13 in 16-26). Skupno 26 mestih so izolirali za nadaljnjo identifikacijo MS. Identifikacijska protein z MS je prikazana v tabeli 3.
2-D analiza Led od L3
proteomske profilu Led od L3 predstavljeno na sliki 3A kaže, da je večina beljakovin, ki se nahajajo v basidic območju med pH 7-11. Western blots bile izvedene L3-miši seruma (slika 3B) in konjski serum (slika 3C). Jakost imunskega odziva razlikuje ko je LCE od L3 izpostavljena s L3-miši serum ali s konjskega seruma, vendar profili imunoblot bili podobni. Po primerjavi immunoblots s srebrno obarvane gel, je bilo izbranih 39 spotov, ki jih krogih indicirano za nadaljnjo identifikacijo MS (tabela 4). 19 od 39 izoliranih lise smo uspešno označene (P 0,05), kar ustreza 8 različnih proteinov: filamin (slika 3A, točkovno 1), protein toplotnega šoka (HSP-70) (slika 3A, zelo 2), serumski albumin predhodnik (slika 3A, spot 3,18-20), fosfoenolpiruvat karboksikinaze (PEPCK) (slika 3A, točka 8), enolazni (slika 3A, spot 22,23), fumarase (slika 3A, točka 1), beta-aktin ( Slika 3A, spot 27), hemoglobin (slika 3A, spot 32-39) .table 4 Masa spektrometrične identifikacije proteinov, opredeljenih z Led s L3.
računa ID
ime Protein
vrst
število pristop

MW (DA)
pI

ocena Protein
1
Filamin 1
Drosophila melanogaster
Q8T3K7
151.931
5,72
76
2
Toplotni udar 70 kDa protein 70C
Drosophila melanogaster
HSP7A_DROME
70.871
5,34
70
3
serum albumin
Bos taurus

AAN17824
71.274
5,82
171
8
fosfoenolpiruvat karboksikinaze
Drosophila melanogaster
PPCK_DROME
71.882
6.07
79
18
serum albumin predhodnik
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71.244
5,82
108
19
serum albumin predhodnik
Bos taurus

ALBU_BOVIN
71244
5,82
117
20
serum albumin predhodnik
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71.244
5,82
165
22
enolazni (Fragment)
Drosophila subobscura
O44101
44.548
5.92
142
23
enolazni
Schistosoma mansoni

ENO_SCHMA
47.421
6.18
163
24
Fumarase
Drosophila melanogaster
Q9VTI5
51.239
8.47
111
27
Beta-aktin
Danio rerio
ACTB1_BRARE
42.082
5.3
184
32
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis

O96457
18026
8.44
95
33
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8.44
113
34
hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8.44
131
38
hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
18.026
8.44
415
39
Hemoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8.44
410
Fleck naloge se nanašajo na Slika 3. beljakovine, naštete so bile ugotovljene s precejšnjo verjetnostjo rezultatom p < 0,05 (2, 8, 18, 19, 20, 23, 27: Expasy baza, 1, 3, 22, 24, 32, 33, 34, 38, 39: msdb)
Slika 3 2-D analizo. LCE od L3. -Srebro obarvajo predstavnik 2-D protein karta Led na L3, ki obsega pH gradienta od 3 do 11 s MW razvrstitev od 10 do 250 KDa (A). Gel-obarvajo s srebrom je bila uporabljena za uskladitev odkritih proteinske lise na zahodnem blots opravljenih z serumu miši imuniziranih s LCE L3 (b) in s konjski serum (C). 39 vložki immunolabelled z obema serumov smo izolirali za nadaljnjo identifikacijo MS. Identifikacijska protein z MS je predstavljen v tabeli 4.
Razprava
primerjavo migracijskih tokov v LCE2 in LCE3 tako v dimenzijske analize (1-D in 2-D), kaže, da je posoda proteinski profil fazi specifična, kar kaže drugačno sestavo ličinke presnove in antigenske lastnosti. Za 1-D-srebrne obarvajo geli iz ličinkah surovih ekstraktov pokazali zelo gosto koncentracijo proteinov; Zato bi uskladitev, ki jih konja odkritih imuno-reaktivnega pasovih in miših predstavili nekatere razlike. Proteomskimi pristop potrdil poseben profil beljakovin obeh ličinke in omogočiti boljše prepoznavanje različnih mestih.
Miši umetno cepijo pred izvlečka surovih beljakovin iz polnomastnega ličinke. Številni proteini, ki običajno niso v neposrednem stiku s konji so bili predstavljeni na imunski sistem miši. Poleg tega, za razliko od naravne okužbe izzove konja imunski odziv, subkutana injekcija pri miših povzroči sistemsko imunska reakcija premaknilo odgovora Th1 ga adjuvans. Ta razlika v imunskem odzivu pojasnjuje, da je večina proteinov L2 in L3, ki reagirajo z miši serumih pokazala bolj intenzivno signala v primerjavi z reakcijo s konjsko serumih. Ker je življenjski cikel G. intestinalis
pojavlja v prebavilih konj, mukozni imunski sistem je v stiku z ličinkami in tako izpostavljena izločajo ali izločajo snovi v posodi za migracije in razvoj [18]. Čeprav L2 migracijski vzorci od ust do želodca vedno ni jasno, lahko imunski reakcija zaznali pri konjih in eksperimentalno imuniziranih miših kažejo, da je posoda faza L2 ima več antigenske proteinov kot posodi fazi L3, verjetno uporabne za ličinke migracije encimsko [19]. Zato je enolazni identificiramo z MS in je bil prej poročali kot pomemben encim ko vdrla tkivo [20] lokalizirana na površini več patogenov. L2 je oder inducira močan gostitelja imunski odziv, tako da bi lahko njen razvoj v L3 v želodcu je obrambni mehanizem ličink bypass konj imunsko obrambo. Po drugi strani pa je dejstvo, da L3 ostaja zvesta 8-10 mesecev stene želodca predlaga hypometabolic status, ali nižje imunogene lastnosti. To lahko pojasni šibek imunski odziv opažen v prisotnosti konjskega seruma proti L3.
Dveh pomembnih ličink beljakovine, arylphorin in LSP-2 (ličinke serum beljakovin), oziroma homologne Calliphora vicina
in Drosophila melanogaster
, so bile ugotovljene v L3. V holometabolous insektov gradnja odraslih tkiv med metamorfozo zahteva veliko energije. Znano je, da je pred tvorbo puparium, maščobne celice telesa resorbira proteinov in drugih makromolekul, ki so nabrane v hemolimfa v posodi času hranjenja [21]. Največji delež vključenih proteinov sestavljajo arylphorins in LSP-2 [22]. Poleg tega je hemoglobin opredeljena v obeh ličinke G. intestinalis
. Ta bogata in kroži molekula je prisoten v zelo tracheated celicah tvorijo posteriorno spiracular ploščo in omogoča ličinke bolje izkoristiti prekinitvami stiku, ko je zrak zaužitju s hrano [23].
Večina drugih ugotovljenih proteinov v L2 (paramyosin , tubulin, tropomiozin, GAPDH in protein podobna aktin) ali L3 (filamin, fumarase, PEPCK, HSP-70, enolazni) se delijo s tistimi, Drosophila
spp. ki kažejo, da obstajajo strukturne ali presnovni homologije med temi vrstami.
Med te raziskave, različni črevesni zajedavci (Anoplocephala perfoliata
, Parascaris equorum
, Cyathostominae) so bili hkrati prisotni z G. intestinalis
v gastro -intestinal trakta zaklanih konj. Tveganje navzkrižne reaktivnosti je še oceniti. Toda za razliko od nekaterih imunoloških raziskavah o črevesni paraziti v kopitarjev [24-26] je navzkrižna reaktivnost med G. intestinalis
in želodčno-črevesne zajedavce še ni bila raziskana.
Ta del vsebuje dodatne informacije v razumevanju interakcija med G. intestinalis
in njihova gostitelja in s prispevanjem novo shemo proteomske profila glavnih ličinke. Tako naši rezultati še dodatno kaže na kompleksnost tega gostiteljice-parazit interakcijo. Dejansko pa ta študija razkriva, da je treba razviti zanesljivo serološki orodje za odkrivanje napadene konje, zlasti zato, ker je edino sredstvo za odkrivanje G. intestinalis
napad je z obdukcijo.
Identifikacijo večine proteinov bo naslednji korak je, da opredelijo svojo vlogo, svoj celični ali tkivni lokalizacije in njihovih potencialnih antigenske lastnosti.
Metode
posodo za zbiranje in antigen pripravo
Gasterophilus
spp. L2 in L3 so bili zbrani od pilorusa dela želodca konj, ki izvirajo iz dveh kmetij, ki se nahajajo v okrožju švicarski Jura; Delémont: N 47 ° 21 '; E 7 ° 20 ', Švica. Hkrati je bila preučena gastrointestinalni trakt vsake živali in opazili prisotnost P. equorum
, A. perfoliata
in Cyathostominae v vsakem primeru.
Vse ličinke zbrali smo sprali v sterilni fosfata fiziološko raztopino pufra (PBS 0,1 M, pH 7,2), označene kot G. intestinalis
na osnovi morfoloških [1] ključev in zamrznemo pri -20 ° C.
Za pripravo ličinkah surovih ekstraktov 10 L2 ličinke pridelanega na dveh različnih konjev iste črede, in sedem L3 ličinkami, pridelano na enega konja, ki izvira iz druge črede, so sonicated in homogenizirati na ledu v sterilnih pogojih. Homogenat smo ekstrahirali preko noči pri 0,1 M pH na 9,6 karbonatni pufer z nadaljnjim dodajanjem 1 ml /gr inhibitorja proteaze (Sigma-Aldrich, Buchs, Švica), ki vsebuje 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF) in 5 mM ethylenediamin tetraocetne kisline (EDTA) . Ekstrakte smo centrifugirali pri 20'000 x g
30 minut (4 ° C). Supernatant, ki vsebuje antigene smo zbrali in končna vsebnost beljakovin določi spektrometrijo (metoda Bradford, BioRad). LCE smo liofilizirali in shranili pri -20 ° C.
Krvi konja vzorcev seruma
Vzorci so bili sprejeti na skupino dvajsetih konj, ki izvirajo iz dveh kmetijah v zgoraj opisanem območju. Čeprav so vzorci krvi in ​​ličinke zbiranje ne bi bilo mogoče opraviti na isti živali, naše pripombe, ki med hkrati opravljene epidemiološke raziskave (Roelfstra et al, v prep.), Vključno z terenskih opazovanj na živih živalih in v klavnicah, je potrdilo visoko stopnjo endemičnosti od G. intestinalis
do [19] Brocard prej opisane na istem območju in nam omogočajo, da domnevajo, da so vsi konji, ki se uporabljajo v tej študiji okužena z G. intestinalis
. Fetalni konjskega seruma je bila uporabljena kot negativna kontrola za Zahodni blots. Kri smo centrifugirali pri 3500 x g
15 minut pri sobni temperaturi in serume smo hranili pri -20 ° C.
Imunizacija miši in serumskih vzorcih
Balb /c miši imuniziramo z Led L2 (L2 miši) ali z Led L3 (L3 miši) iz G. intestinalis
. smo sonicirali dve g L3 in dve gramov L2, homogeniziramo v sterilnem PBS pufra pH 7,2 in centrifugiramo pri 20'000 x g
. Supernatant smo nato emulgiramo v enakem volumnu Freundov nepopolni adjuvant (Sigma-Aldrich, Buchs, Švica).
Odmerku 100 mikrogramov proteina /miš, v volumnu 200 ul, smo injicirali intramuskularno vsaka 2 tedna preko 6 tednov. Živali so bile izkrvaveti sedem tednov po prvem cepljenju. Kontrolne miši smo inokulirali s kombinacijo PBS in Freundov nepopolni adjuvant vsakič zgoraj. Vzorčili kri smo centrifugirali pri 3500 x g
15 minut pri sobni temperaturi in serumov, skladiščenih pri -20 ° C. Vsi postopki so bili potrjeni s strani odgovornega lokalnega odbora za živali eksperimentov.
One dimenzionalno elektroforezo (1-D)
proteinov L2 (5 g /dobro) in L3 (5 g /dobro) smo ločili na gradient SDS -PAGE geli (4-20%) pod redukcijskimi pogoji (2-β-merkaptoetanola, 95 ° C 5 minut). Elektroforeza bila izvedena na 80/100 V za 30 min /2 uri. En komplet gelov smo obarvali s srebrom za masne spektrometrije, drugi je bil prenesen na nitroceluloza membrane (GE Healthcare, Uppsala, Švedska) za Western blot analizo.
Dvodimenzionalna elektroforeza (2-D)
liofiliziranih LCE vzorce smo raztopili v 2-DE liznega pufra (9 M ureo, 2 M tiourea, 1% dithioerythriol, 4% čeljusti, 2,5 uM EGTA in 2,5 uM EDTA). Immobiline suhe trakovi pH 3-11 nelinearno, 11 cm (GE Healthcare, Uppsala, Švedska) so bili potopljeni nočitev v lize pufru, ki vsebuje 75 mikrogramov beljakovin vzorec, dodaten 1% Pharmalyte pH 3-10 (GE Healthcare, Uppsala, Švedska), in 0,5% bromfenol modro. IEF na Multiphor (GE Healthcare) za 15 kV · h pri 20 ° C je sledilo ločitve gradient SDS-PAGE gelov (9-15%) pri konstantnem 45 V na gel. En komplet gelov smo obarvali s srebrom za MS in drugi je bil prenesen na nitroceluloza membrane (GE Healthcare, Uppsala, Švedska) za Western blot analizo.
Western blot analiza (WB)
Nespecifična vezava je bil blokiran s 1% polivinilpirolidona v PBS-Tween 1 uro. Blots smo nato inkubirali s primarnim protitelesom v PBS-Tween (preko noči pri 4 ° C, konj serumih ali mišjih serumih 1: 1000) in sprali. V imunološko lise so odkrili s pomočjo koza anti-mouse IgG (H + L) (1: 20000, Nordic Immunology Laboratories, Tilburg, Nizozemska) ali anti-konja IgG (1: 10000, Sigma-Aldrich, Buchs, Švica) protitelo konjugirano s hrenovo peroksidazo. Signali so bile ugotovljene z ECL (izboljšano kemiluminiscentnim) na Hyperfilm ECL (GE Healthcare, Uppsala, Švedska) [27]. Po odkritju ECL, so blots nato obarvamo z koloidnega zlata, tako da ustrezajo vidne lise na splošno stanje na srebrno obarvanih gelov.
Masna spektrometrija (MS)
Izbrana lise so izrezali 2-D gelov, razbarvamo z proteolize obdelali s tripsinom [28] in analizira MALDI-TOF in MS /MS na MALDI-TOF /TOF tandem masni spektrometer (ABI 4700 Proteomika analizatorja, Applied Biosystems). Kombinirana PMF (peptid masa prstni odtis) in MS /MS poizvedbe so bile izvedene z maskoto © v1.9 Database iskalnik [29] (Matrix Science), vgrajene v GPS-Explorer programske opreme (različica 3.6, Applied Biosystem) na Swiss- prot podatkovna baza (verzija 20051206, 201594 sekvence, 73123101 ostanki) ali msdb (različica 20040703; 1501893 sekvence, 480537664 ostanki). Identifikacija Protein je štelo pozitivni (tabele 1, 2, 3 in 4), če bi bil (i), ki temelji na verjetnost MOWSE ocena [30], pridobljene iz obeh držav članic in analizo MS /MS pomembna (tj rezultati > 66 je bilo značilno pri p < 0,05 za Expasy baze podatkov, in rezultati > 74 značilno pri p < 0,05 za zbirko podatkov msdb; interval zaupanja > 99%, kot je določeno s GPS Explorer, različica 3.6); (Ii) ujema peptid množice so obilne v spektru; in (iii) teoretični molekulske mase (MW) o pomembnih zadetkov ustrezala eksperimentalno ugotovljene vrednosti.
Izjave
Zahvala
tem delu je podprt s SFB 571 nepovratna A5 DEEG. Avtorji se zahvaljujejo prof D. Otranto in prof D.D. Colwell za svoje kritične pripombe.
Avtorjev originalnih predloženi datoteke za slike
Spodaj so povezave do avtorjev izvirnih predloženih spisov za slike. "Izvirno datoteko na sliki 1 13071_2008_54_MOESM2_ESM.pdf avtorjev 13071_2008_54_MOESM1_ESM.pdf avtorjev prvotni datoteki številka 2 prvotne datoteke 13071_2008_54_MOESM3_ESM.pdf avtorjev za slika 3 nasprotujočimi si interesi
Avtorji izjavljajo, da nimajo konkurenčnih interesov.

• Endoskopsko zaprtje želodčnih cevi perforacije titana posnetkov: štiri primer report
• Ogromna želodca bezoarske s satja povzročil, nenavaden zaplet zdravstvenega faddism: primer report