Protein profil d'expression de Gasterophilus larves de intestinalis causant myiase gastrique cheval et la caractérisation du profil immunitaire cheval d'expression reaction

protéique de intestinalis gasterophilus
larves causant cheval myiase gastrique et la caractérisation de la réaction immunitaire du cheval
Résumé de l'arrière-plan
Peu d'informations est disponible sur l'aspect immunologique (diptères, Oestridae) larves de intestinalis gasterophilus parasites causant myiase gastrique cheval. Les objectifs de cette étude étaient d'analyser la teneur en protéines des extraits bruts larvaires du deuxième et troisième larves migration (L2 et L3) de G. intestinalis
afin de caractériser la réponse immunitaire des chevaux
. Résultats
Le profil protéomique de L2 et L3, étudiée en utilisant un et deux approches dimensionnelles, a révélé un modèle de migration spécifique à chaque stade larvaire. En outre, des Western blots ont été effectués avec les sérums de chevaux et avec des sérums de souris Balb /c immunisées avec des extraits bruts de larves L2 ou L3, révélant une autre réaction immunitaire chez les chevaux infectés naturellement contre
. induite artificiellement réaction immunitaire chez les souris. La comparaison des profils d'immunotransfert montrent que la phase L2 est plus immunogène que L3 très probablement sous l'effet de la plus forte production enzymatique de L2 lors de la migration à travers les tissus de l'hôte de l'étape. Quinze protéines ont été identifiées par spectrométrie de masse.
Conclusion
Ce travail fournit des informations supplémentaires dans la compréhension de l'interaction entre G. intestinalis
et leur hôte et en contribuant un nouveau schéma du profil protéomique de la larvaire principale étapes.
Contexte de neuf espèces de Gasterophilus de (Diptera, Oestridae) les mouches ont été décrites provoquant, au stade larvaire, myiase gastro-intestinal chez les équidés. Alors que Gasterophilus intestinalis
(De Geer, 1776) et Gasterophilus nasalis
(Linnaeus, 1758) sont distribués dans le monde entier et sont souvent les seules espèces signalées dans de nombreuses régions du Nouveau Monde, les autres espèces ne sont déclarées très limitée régions d'Europe, pays de l'Est [1] et de l'Afrique [2]. bot mouches adultes déposent leurs œufs sur les cheveux des hôtes à des endroits différents selon les espèces de Gasterophilus
[3]. G. pecorum
est une exception, car les femelles pondent leurs œufs sur l'herbe, les feuilles et les tiges des plantes [1]. L'infection se produit lorsque les œufs sont introduits dans la bouche de cheval par léchage et toilettage des animaux. Les premiers stades larvaires (L1) écoutilles, commence à migrer et de mue dans le deuxième stade larvaire (L2) dans la cavité buccale [4]. Les larves de différentes espèces de Gasterophilus
sont spécifiquement présents dans une ou plusieurs régions du tractus gastro-intestinal où le troisième stade larvaire (L3) reste attaché à la muqueuse pendant environ 8-10 mois [5]. Les signes cliniques associés à la phase de migration et de maturation des larves sont difficiles à diagnostiquer, mais il a été démontré que les différentes espèces de Gasterophilus
peuvent causer des dommages graves au cours de leur cycle de vie [6-9]. Dans le
dernières années d'études concernant l'immunologie et immunopathologie de nombreuses larves de myiase causant oestrid ont augmenté en raison de leurs implications importantes dans le diagnostic et dans les programmes de vaccination [10]. Alors que les études immunologiques ont été principalement axées sur l'infection des bovins grub de Hypoderma [11], et le mouton nasal oestrose par Oestrus de la
[12], l'immunologie des Gasterophilus de spp. myiase causé reçu peu d'attention. Ceci est également dû aux difficultés inhérentes à l'étude des interactions hôte-parasite immunologiques à l'interface de la muqueuse gastro-intestinale. En conséquence, jusqu'à présent, aucun des immunogènes majeurs ont été rapportés [13]. Une seule étude a examiné l'apparition d'anticorps pour le diagnostic de la myiase par les larves de G. intestinalis, bien que la spécificité de la réaction immunitaire n'a pas été testé dans la survenue de l'infection parasitaire concomitante cheval [14]. analyses basées protéomique Plus récemment, de nombreux, combinés avec électrophorèse sur gel à deux dimensions, ont offert une approche globale pour mieux comprendre les processus biologiques et immunologiques des agents pathogènes et les maladies [15-17]. Les résultats de l'objectif de cette étude était de caractériser les protéines L2 et L3 de G. intestinalis
et d'analyser la réponse immunitaire des chevaux et des souris immunisées contre les antigènes larvaires.
analyse 1-D de l'extrait brut larvaire (LCE) de la migration de L2 et L3 de la lce2 sur le gel coloré à l'argent 1-D montre un motif spécifique (figure 1A) avec 14 bandes qui ont été isolés à partir du gel pour l'identification ultérieure par spectrométrie de masse (MS) ( Tableau 1). La sélection des bandes était basée sur l'intensité de la bande sur le gel coloré à l'argent, ainsi que l'immunoréactivité observée après immunoblot avec du sérum de cheval (figure 1B) ou de sérum L2-souris (figure 1C). Trois protéines dans 4 des 14 groupes sélectionnés ont donné un score significatif (p < 0,05) et ont été identifiés comme l'actine (Figure 1A, la bande 8), la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) (Figure 1A, bande 9) et de l'hémoglobine (figure 1A, les bandes 13 et 14). Un schéma de migration différent a été observé pour la LCE3 sur le gel coloré à l'argent 1-D (figure 1D). De manière analogue, immunoblots ont été effectuées avec des sérums de cheval (figure 1E) et les sérums de L3-souris (figure 1F). La sélection des 13 bandes, indiqués par des flèches (figure 1D), est basée sur les mêmes critères que ceux ci-dessus. Ils ont été isolés pour une identification plus poussée par MS (tableau 2). Dix protéines sur les 13 bandes sélectionnées ont donné un score significatif (p < 0,05) et ont été identifiés comme la chaîne alpha de la protéine sérique larvaire (figure 1D, bandes 1-4), arylphorine (figure 1D, la bande 6), chaîne bêta des protéines sériques larvaire (figure 1D, bande 7), l'hémoglobine (figure 1D, des bandes 10-12) et la lipoprotéine murein (figure 1D, bande 13) .Table 1 masse identification par spectrométrie de protéines identifiées à partir de la LCE de L2.

nom de Protein Band ID
numéro d'accession Espèce

MW (Da)
pI
score Protein
8
Protein similaire à actine-87E isoforme 2
Drosophila melanogaster
37816
5,36
223
9
glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase de
AAM29410
Drosophila hydei
S24630
35369
8.2
224
13
les intestinalis gasterophilus de Hemoglobin
O96457
17912
8,44
440
14
hémoglobine
intestinalis gasterophilus

O96457
17912
8,44
144
Spots affectations se réfèrent à la Figure 1. Les protéines énumérées ont été identifiés avec un score de probabilité significative à p < 0,05 dans MSDB.
Tableau 2 Masse identification par spectrométrie de protéines identifiées à partir de la LCE de L3.
Band ID

nom de protéine
Espèce
numéro d'accession

MW (Da)
pI
score Protein
1
sérum larvaire protein 1 chaîne alpha précurseur
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
92 2
protéine sérique larvaire 1 chaîne alpha précurseur
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
89 3
larvaire protéine sérique 1 alpha précurseur de chaîne
Drosophila melanogaster

LSP1A_DROME
98802
5,72
98 4
larvaire protéine sérique chaîne 1 alpha précurseur
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
102
6
arylphorine sous-unité A4 précurseur
Calliphora vicina
ARY1_CALVI
92282
5,59
71
7
sérum larvaire protein 1 beta chaîne précurseur
Drosophila melanogaster
LSP1B_DROME
95849
5,41
69
10
hémoglobine
intestinalis gasterophilus
O96457
17912
8,44
247
11
hémoglobine
intestinalis gasterophilus
O96457
17912
8,44
132
12
hémoglobine
intestinalis gasterophilus
LPEBWM
17912
8,44
112
13
précurseur majeur externe de lipoprotéines de membrane (murein-lipoprotéines)
Pectobacterium atrosepticum
LPP_ERWCT
8396
9,36
69
Spots affectations se réfèrent à la Figure 1. Les protéines énumérées ont été identifiés avec un score de probabilité significative à p < 0,05 (1, 2, 3, 4, 6, 7, 13: Base de données Expasy; 10, 11, 12 MSDB).
Figure 1 Analyse 1-D du LCE de L2 et L3. gel coloré à l'argent 1-D représentant de LCE de L2 (A) et L3 (D). Les flèches indiquent les bandes qui ont été sélectionnés pour la spectrométrie de masse. Analyse par Western blot de L2 mis en incubation avec du sérum de cheval (B) et du sérum de souris (C). Analyse par Western blot de L3 mis en incubation avec du sérum de cheval (E) et du sérum de souris (F). L'identification des protéines par la SEP est présentée dans le tableau 1 et 2.
Analyse 2-D du LCE de L2
La migration des protéines de la LCE de L2 sur un gel 2-D (figure 2A) a montré la présence de des protéines tout au long du spectre du pH. Western blots ont été effectués avec du sérum de souris L2 (figure 2B) et du sérum de cheval (figure 2C). Le gel coloré à l'argent a été utilisé pour aligner les taches de protéines détectées sur les deux profils d'immunotransfert. Un plus grand nombre de protéines immunoréactives a été observée sur le profil d'immuno-empreinte à cheval sur l'immunotransfert que L2-souris. Les cercles indiquent les 12 points qui ont été considérés comme immunoréactive avec le sérum des souris L2 (figure 2A, les taches: 1, 2, 6, 8, 14-20, 25) et les flèches indiquent les 24 points qui ont été considérés comme réactif immun avec du sérum de cheval (Figure 2A, spots: 1-13 et 16-26). Un total de 26 points ont été sélectionnés pour MS analyse (tableau 3). Parmi les 26 sites sélectionnés, 7 protéines ont été identifiées avec succès (p < 0,05) par MS: paramyosine (figure 2A, point 1), l'albumine sérique (figure 2A, point 5), tubuline (figure 2A, point 9), l'énolase ( Figure 2A, repérer 11), la tropomyosine (Figure 2A, repérer 14), GAPDH (Figure 2A, spot 19) et de l'hémoglobine (Figure 2A, repérer 20) .Table 3 spectrométriques de masse identifications de protéines identifiées à partir de la LCE de L2.

nom de protéine
spot ID
numéro d'accession
espèces

MW (Da)
pI
score Protein
1
paramyosine
Drosophila melanogaster
S22028
102277
5.5
97
5
sérum albumine précurseur
Bos taurus
Abbos
69225
5.8
99
9
tubuline chaîne alpha-1
Drosophila melanogaster
A26488
49876
5.0
260
11
Enolase
Oryza sativa
Q7XBE4
47942
5.4
80
14
Tropomyosin
Drosophila melanogaster
C25242
32740
4.7
78
19
glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
Drosophila hydei
S24630
35369
8.2
100
20
hémoglobine
intestinalis gasterophilus
O96457
17912
8.4
209
Spots affectations se réfèrent à la Figure 2. Les protéines énumérées ont été identifiés avec un score de probabilité significative à p < 0,05 MSDB.
Figure 2 Analyse 2-D de la LCE de L2. Coloration à l'argent représentant 2-D protéine carte du LCE de L2 comprenant un gradient de pH de 3 à 11 avec le rang MWs 10-250 kd (A). Le gel coloré à l'argent a été utilisé pour aligner les taches de protéines détectées sur les Western blots réalisées avec le sérum de souris immunisées avec le LCE de L2 (B) et avec du sérum de cheval (C). Les cercles indiquent les points qui ont été immunomarquées avec des souris de sérum (B; taches 1,2,6,8,14-19,25,26) et les flèches indiquent les points qui ont été immunomarquées avec du sérum de cheval (C; taches 13/01 et 16-26). Un total de 26 points ont été isolés pour une identification supplémentaire MS. L'identification des protéines par MS est présenté dans le tableau 3.
analyse 2-D de la LCE de L3
Le profil protéomique de la LCE de L3 présenté sur la figure 3A montre que la plupart des protéines sont situées dans une gamme basidic un pH compris entre 11/7. Western blots ont été effectués avec du sérum L3-souris (figure 3B), et avec du sérum de cheval (figure 3C). L'intensité de la réaction immunitaire est différente lorsque le LCE de L3 est exposée avec du sérum L3-souris ou avec du sérum de cheval, mais les profils d'immunotransfert ont été similaires. Après comparaison des immunotransferts avec le gel coloré à l'argent, 39 taches, indiquées par des cercles ont été sélectionnés pour une identification plus poussée MS (Tableau 4). 19 des 39 endroits isolés ont été identifiés avec succès (p < 0,05), correspondant à 8 protéines différentes: filamine (figure 3A, point 1), la protéine de choc thermique (HSP-70) (figure 3A, point 2), l'albumine sérique précurseur (figure 3A, repérer 3,18-20), phosphoénolpyruvate carboxykinase (PEPCK) (figure 3A, point 8), énolase (figure 3A, spot 22,23), fumarase (figure 3A, point 1), la bêta-actine ( Figure 3A, repérer 27), l'hémoglobine (figure 3A, spot 32-39) .Table 4 spectrométriques de masse identifications de protéines identifiées à partir de la LCE de L3.

nom de protéine de spot ID
numéro d'accession Espèce

MW (Da)
pI

score Protein
1
Filamin 1
Drosophila melanogaster
Q8T3K7
151931
5,72
76
2
Le choc thermique de 70 kDa protéine 70C
Drosophila melanogaster
HSP7A_DROME
70871
5,34
70 3
sérum albumine
Bos taurus

AAN17824
71274
5,82
171 8
phosphoénolpyruvate carboxykinase
Drosophila melanogaster
PPCK_DROME
71882
6,07
79
18
sérum albumine précurseur
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
108
19
sérum albumine précurseur
Bos taurus

ALBU_BOVIN
71244
5,82
117
20
sérum albumine précurseur
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
165
22
énolase (Fragment)
Drosophila subobscura
O44101
44548
5,92
142
23
Enolase
Schistosoma mansoni

ENO_SCHMA
47421
6.18
163
24
fumarase
Drosophila melanogaster
Q9VTI5
51239
8,47
111
27
bêta-actine
Danio rerio
ACTB1_BRARE
42082
5.3
184
32
hémoglobine
intestinalis gasterophilus

O96457
18026
8,44
95
33
hémoglobine
intestinalis gasterophilus
O96457
18026
8,44
113
34
les intestinalis gasterophilus de Hemoglobin
O96457
18026
8,44
131
38
hémoglobine
intestinalis gasterophilus
O96457
18026
8,44
415
39
hémoglobine
intestinalis gasterophilus
O96457
18026
8,44
410
Spots missions se réfèrent à Figure 3. Les protéines énumérées ont été identifiés avec un score de probabilité significative à p < 0,05 (2, 8, 18, 19, 20, 23, 27: base de données Expasy; 1, 3, 22, 24, 32, 33, 34, 38, 39: MSDB)
Figure 3 Analyse 2-D de. LCE de L3. Coloration à l'argent représentant 2-D protéine carte du LCE de L3, comprenant un gradient de pH de 3 à 11 avec le rang MWs 10-250 kd (A). Le gel coloré à l'argent a été utilisé pour aligner les taches de protéines détectées sur les Western blots réalisées avec le sérum de souris immunisées avec le LCE de L3 (B) et avec du sérum de cheval (C). 39 spots immunomarquées avec les deux sérums ont été isolés pour une identification supplémentaire MS. L'identification des protéines par MS est présenté dans le tableau 4.
Discussion
La comparaison des schémas de migration de la lce2 et LCE3 à la fois l'analyse dimensionnelle (1-D et 2-D), indique que le profil protéinique larvaire est étape spécifique, suggérant ainsi une composition différente dans le métabolisme des larves et des propriétés antigéniques. Les gels colorés à l'argent 1-D des extraits bruts larvaires ont indiqué une concentration très dense de protéines; par conséquent, l'alignement des bandes immunoréactives détectées par le cheval et la souris pourrait présenter quelques différences. L'approche protéomique a confirmé le profil protéique spécifique des deux stades larvaires et a permis de mieux identifier les différentes taches.
Souris ont été artificiellement immunisés contre un extrait protéique brut de larves entières. Un grand nombre de protéines qui ne sont normalement pas en contact direct avec les chevaux ont été présentés au système immunitaire des souris. En outre, contrairement à une infection naturelle provoquant une réaction immunitaire de cheval, injection sous-cutanée chez la souris induit une réaction immunitaire systémique déplacé vers une réponse Th1 par l'adjuvant. Cette différence dans la réaction immunitaire explique le fait que la plupart des protéines L2 et L3 qui réagissaient avec des sérums de souris ont montré un signal plus intense en comparaison avec la réaction avec du sérum de cheval. Etant donné que le cycle de vie de G. intestinalis
se produit dans le tractus gastro-intestinal, des chevaux, le système immunitaire muqueux est en contact avec les larves, et donc exposés à des substances excrétées secrétées ou pendant la migration et le développement des larves [18]. Bien que les modèles de migration L2 de la bouche à l'estomac reste incertaine, la réaction immunitaire détectée chez les chevaux et chez des souris expérimentalement immunisés pourrait suggérer que la L2 stade larvaire possède plus de protéines antigéniques que le L3 stade larvaire, probablement utiles pour la migration enzymatique larvaire [19]. En conséquence, l'énolase a été identifié par SM et a été précédemment rapporté comme une enzyme importante localisée sur la surface de plusieurs agents pathogènes lors de l'invasion des tissus [20]. L2 est une étape induisant une réponse immunitaire de l'hôte fort pour que son développement en L3 dans l'estomac pourrait être un mécanisme de défense des larves de contourner les défenses immunitaires de chevaux. A l'inverse, le fait que L3 reste attaché pendant 8-10 mois à la paroi de l'estomac indique un état hypo-métabolique, ou des propriétés immunogènes réduites. Ceci peut expliquer la réaction immunitaire faible observée en présence de sérum de cheval contre L3
. Deux protéines importantes, les larves et arylphorine LSP-2 (protéine sérique larvaire), respectivement homologues à Calliphora vicina
et Drosophila melanogaster
, ont été identifiés dans la L3. Chez les insectes holométaboles la construction des tissus adultes pendant la métamorphose nécessite une grande quantité d'énergie. Il est connu que, avant la formation de la pupe, les cellules de graisse corporelle réabsorber protéines et d'autres macromolécules qui se sont accumulés dans l'hémolymphe au cours de la période d'alimentation des larves [21]. La majeure partie des protéines incorporées consiste en arylphorins et LSP-2 [22]. En outre, l'hémoglobine a été identifié dans les deux stades larvaires de G. intestinalis
. Cette molécule abondante et la circulation est présente dans des cellules hautement tracheated formant la plaque stigmatique postérieure et permet aux larves de faire un meilleur usage de contact intermittent lorsque l'air est avalé avec de la nourriture [23].
La plupart des autres protéines identifiées dans L2 (paramyosine , tubuline, tropomyosine, GAPDH et une protéine similaire à l'actine) ou L3 (filamine, fumarase, PEPCK, HSP-70, énolase) sont partagés avec ceux de la drosophile de spp. suggérant que des homologies structurelles ou métaboliques existent entre ces espèces.
Au cours de cette recherche, différents parasites intestinaux (Anoplocephala perfoliata
, Parascaris equorum
, Cyathostominae) étaient présents simultanément avec G. intestinalis
dans le tractus gastro tractus -intestinal des chevaux abattus. Le risque de réactivité croisée doit encore être évalué. Mais contrairement à certaines études immunologiques environ helminthes intestinaux chez les équidés [24-26], la réactivité croisée entre G. intestinalis et
parasites gastro-intestinaux n'a pas encore été étudié.
Ce travail fournit de plus amples informations dans la compréhension des l'interaction entre G. intestinalis
et leur hôte et en contribuant un nouveau schéma du profil protéomique des principaux stades larvaires. Ainsi, nos résultats démontrent en outre la complexité de cette interaction hôte-parasite. En effet, cette étude révèle la nécessité de développer un outil sérologique fiable pour détecter les chevaux infestés, en particulier parce que le seul moyen pour détecter un G. intestinalis
infestation est par nécropsie.
L'identification de la plupart des protéines sera le prochaine étape pour définir leur rôle, leur localisation cellulaire ou tissulaire et leurs propriétés antigéniques potentiels.
Méthodes
collecte et l'antigène préparation larvaire
Gasterophilus de spp. L2 et L3 ont été recueillies à partir de la partie pylorique de l'estomac des chevaux provenant de deux fermes situées dans le district du Jura suisse; Delémont: N 47 ° 21 '; E 7 ° 20 ', Suisse. En même temps, le tractus gastro-intestinal de chaque animal a été examiné et la présence de P. equorum
, A. perfoliata
et Cyathostominae a été observée dans tous les cas.
Toutes les larves recueillies ont été lavées dans un phosphate stérile tampon salin (PBS 0,1 M, pH 7,2), identifié comme G. intestinalis
sur la base de clés morphologiques [1] et congelé à -20 ° C.
Pour la préparation des extraits bruts larvaires, 10 larves L2 récolté sur deux chevaux différents d'un même troupeau et sept larves L3 récoltées sur un cheval provenant du deuxième troupeau, ont été soumis à une sonication sur de la glace et homogénéisée dans des conditions stériles. L'homogénat a été extraite pendant une nuit dans une solution à 0,1 M, pH 9,6 tampon carbonate contenant 1 mM de phénylméthylsulfonyle fluorid (PMSF) et de l'acide ethylenediamin tétraacétique 5 mM (EDTA) par l'addition supplémentaire de 1 ml /g d'un inhibiteur de protéase (Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse) . Les extraits ont été centrifugés à 20'000 x g
pendant 30 minutes (4 ° C). Le surnageant contenant les antigènes ont été recueillis et la teneur finale en protéine déterminée par spectrométrie (méthode de Bradford, Bio-Rad). LCE a été lyophilisé et stocké à -20 ° C des échantillons de sérum de cheval
les échantillons de sang de. Ont été prises sur un groupe de vingt chevaux provenant des deux fermes de la région décrite ci-dessus. Bien que les échantillons de sang et la collecte des larves ne peuvent pas être faites sur les mêmes animaux nos observations faites au cours d'une enquête épidémiologique réalisée simultanément (Roelfstra et al, en préparation.), Y compris les observations sur le terrain sur les animaux vivants et dans les abattoirs, a confirmé le niveau élevé d'endémicité de G. intestinalis
décrit précédemment par Brocard [19] dans la même zone et nous permettent de présumer que tous les chevaux utilisés dans cette étude sont infestés par G. intestinalis
. de sérum de cheval foetal a été utilisé comme témoin négatif pour les Western blots. Le sang a été centrifugé à 3500 x g
pendant 15 minutes à la température ambiante et les sérums ont été conservés à -20 ° C.
Immunisation de souris et des souris Balb /c de sérum Des échantillons ont été immunisés avec de L2 LCE (L2 souris) ou avec des LCE de L3 (souris L3) de G. intestinalis
. Deux grammes de L3 et L2 de deux grammes ont été soniquées, homogénéisés dans un tampon PBS stérile à pH 7,2 et centrifugé à 20'000 x g
. Le surnageant a ensuite été émulsionné dans un volume égal de l'adjuvant incomplet de Freund (Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse).
Une dose de 100 ug de protéine /souris dans un volume de 200 ul, a été injectée par voie intramusculaire toutes les 2 semaines jusqu'à la 6 semaines. Les animaux ont été saignés sept semaines après la première immunisation. Les souris témoins ont été inoculés avec une combinaison de l'adjuvant incomplet de Freund PBS et chaque fois ci-dessus. le sang échantillonné a été centrifugé à 3500 × g
pendant 15 minutes à la température ambiante et les sérums stockés à -20 ° C. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité local chargé des expérimentations animales.
Une électrophorèse bidimensionnelle (1-D)
Les protéines de L2 (5 ug /puits) et L3 (5 ug /puits) ont été séparés sur gradient SDS gels -page (4-20%) dans des conditions réductrices (2-β-mercaptoéthanol, 95 ° C pendant 5 min). L'électrophorèse a été réalisée à 80/100 V pendant 30 min /2 heures. Un ensemble des gels a été coloré avec de l'argent pour la spectrométrie de masse, et le second a été transféré sur des membranes de nitrocellulose (GE Healthcare, Uppsala, Suède) pour l'analyse Western blot.
Électrophorèse à deux dimensions (2-D)
lyophilisée LCE les échantillons ont été solubilisés dans du 2-dE tampon de lyse (9 M d'urée, thiourée 2 M, 1% dithioerythriol, 4% de CHAPS, 2,5 uM d'EGTA et 2,5 pM d'EDTA). Immobiline bandes sèches de pH 3-11 non linéaire, 11 cm (GE Healthcare, Uppsala, Suède) ont été immergés pendant une nuit dans un tampon de lyse contenant 75 pg échantillon de protéine, 1% supplémentaire Pharmalyte pH 3-10 (GE Healthcare, Uppsala, Suède), et 0,5% de bleu de bromophénol. IEF sur une Multiphor (GE Healthcare) pour 15 kV • h à 20 ° C a été suivie par une séparation sur gradient de gels de SDS-PAGE (9-15%) à 45 V constant par gel. Un ensemble de gels a été coloré avec de l'argent pour MS et le second a été transféré sur des membranes de nitrocellulose (GE Healthcare, Uppsala, Suède) pour l'analyse Western blot. Liaison
analyse par Western blot (WB)
non spécifique a été bloquée avec 1% de polyvinylpyrrolidone dans du PBS-Tween pendant 1 heure. Les empreintes ont été ensuite incubées avec l'anticorps primaire dans du PBS-Tween (une nuit à 4 ° C, le sérum de cheval ou de sérums de souris 1: 1000) et lavés. Les spots immunoréactifs ont été détectés en utilisant un anticorps de chèvre anti-IgG de souris (H + L) (1: 20000, Nordic Immunology Laboratories, Tilburg, Pays-Bas) ou un anticorps anti-IgG de cheval (1: 10000, Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse) un anticorps conjugué à la peroxydase de raifort. Les signaux ont été détectés avec ECL (de chimioluminescence amplifiée) sur Hyperfilm ECL (GE Healthcare, Uppsala, Suède) [27]. Après la détection ECL, les blots ont ensuite été colorées avec de l'or colloïdal afin de faire correspondre les taches visibles à tendance générale sur des gels colorés à l'argent
. La spectrométrie de masse (MS)
spots sélectionnés ont été excisés des gels 2-D, décoloré , traité par protéolyse avec de la trypsine [28] et analysé par MALDI-TOF MS /MS sur un MALDI-TOF /TOF spectromètre de masse en tandem (ABI 4700, Proteomics Analyseur Applied Biosystems). Combiné PMF (peptide de masse empreinte digitale) et MS /MS requêtes ont été faites avec MASCOT © v1.9 moteur de recherche de base de données [29] (matrice Science) intégré dans le GPS-Explorer Software (version 3.6, Applied Biosystems) sur le Swiss- base de données Prot (version 20051206; 201594 séquences; 73123101 résidus) ou MSDB (version 20040703; 1501893 séquences; 480537664 résidus). L'identification des protéines a été considéré comme positif (tableaux 1, 2, 3 et 4) (i) si le score MOWSE probabiliste [30] obtenu à la fois MS et l'analyse MS /MS était significative (c.-à-scores > 66 étaient significatives à p < 0,05 pour la base de données Expasy et scores > 74 significative à p < 0,05 pour la base de données MSDB; intervalle >confiance, 99% comme donné par l'explorateur de GPS, version 3.6); (Ii) les masses de peptides appariées étaient abondants dans le spectre; et (iii) les masses moléculaires théoriques (MW) des résultats significatifs correspondent aux valeurs observées expérimentales. Déclarations de
Remerciements
Ce travail a été soutenu par SFB 571 subvention A5 Deeg. Les auteurs remercient le Professeur D. Otranto et Prof. D.D. Colwell pour leurs commentaires critiques.
Auteurs Les fichiers originaux soumis pour les images
Voici les liens vers les auteurs originaux soumis fichiers pour les images. de fichier d'origine pour la figure 1 13071_2008_54_MOESM2_ESM.pdf Auteurs 13071_2008_54_MOESM1_ESM.pdf Auteurs fichier d'origine pour la figure 2 fichier original 13071_2008_54_MOESM3_ESM.pdf Auteurs 'pour la figure 3 Intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts.

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