Протеин профиль экспрессии личинок Intestinalis Gasterophilus вызывая лошади желудка миазы и характеристика иммунной экспрессии белка reaction

лошади профиля Gasterophilus интестиналис
личинок, вызывающих лошади желудка миазы и характеристика лошади иммунной реакции
Аннотация
Фон изображения мало информации доступно на иммунологическую аспекте паразитарных Gasterophilus Intestinalis
личинок (Diptera, Oestridae) вызывает лошади миазы желудка. Целями данного исследования было проанализировать содержание белка личиночной сырых экстрактов мигрирующего личинками второго и третьего (L2 и L3) группы G. интестиналис
Для охарактеризовать иммунный ответ лошадей.
Результаты <бр> протеомного профиль L2 и L3, исследовали с помощью одного и двух размерных подходов, выявили миграции шаблон, специфичные для каждой личиночной стадии. Кроме того, Вестерн-блоттинг проводили с лошадиной сывороткой и с сыворотками BALB /C мышей, иммунизированных с личинками неочищенных экстрактах L2 или L3, обнажив различные иммунные реакции у естественно зараженных лошадей VS
. искусственно вызванной иммунной реакции у мышей. Сравнения профилей иммуноблота, показывают, что этап L2, более иммуногенной, чем стадия L3, скорее всего, как эффект самой высокой ферментативной производства L2, мигрируя через тканей хозяина. Пятнадцать белков были идентифицированы с помощью масс-спектрометрии.
Заключение
Эта работа предоставляет дополнительную информацию в понимании взаимодействия Г. интестиналис
и их хозяина и способствуя новую схему протеомического профиля основного личиночной этапы.
фон
Девять видов Gasterophilus
(двукрылых, Oestridae) мухи были описаны в результате чего, в личиночной стадии, желудочно-кишечного тракта миазы в equids. В то время как Gasterophilus Intestinalis
(De Geer, 1776) и Gasterophilus Nasalis
(Linnaeus, 1758) распространяются по всему миру и часто являются единственными видами, представленные во многих частях Нового Света, остальные виды представлены только в очень ограниченном районах Европы, стран Востока [1] и в Африке [2]. Взрослый бот мухи откладывают яйца на волосы хозяев в разных местах, в зависимости от вида Gasterophilus
[3]. Г. pecorum
является исключением, так как самки откладывают яйца на травы, листьев и стеблей растений [1]. Заражение происходит, когда яйца вводят в рот лошади животной облизывание и холить. Первые личиночной стадии (L1), люков, начинает мигрировать и линьки во второй личиночной стадии (L2) в полости рта [4]. Личинки различных видов Gasterophilus
которые специфически присутствуют в одном или нескольких участках желудочно-кишечного тракта, где третий личиночной стадии (L3), остается прикрепленной к слизистой оболочке в течение приблизительно 8-10 [5] месяцев. Клинические признаки, связанные с миграцией и этапах созревания личинок трудно диагностировать, но было показано, что различные виды Gasterophilus
может вызвать серьезные повреждения во время их жизненного цикла [6-9].
В последние годы исследования, касающиеся иммунологии и иммунопатологии многих oestrid миазы вызывает личинок увеличились из-за их важных последствий в диагностике и в программах иммунизации [10]. В то время как иммунологические исследования были в основном сосредоточены на подкожного
крупного рогатого скота шпилек инфекции [11], и овцы носовой oestrosis по течки OVIS
[12], иммунологии Gasterophilus
SPP. вызвал миазы уделялось мало внимания. Это также связано с неизбежными трудностями при изучении иммунологических паразита и хозяина взаимодействий на желудочно-кишечный интерфейс слизистых оболочек. Как следствие, до сих пор никаких серьезных иммуногены не сообщалось [13]. Единственное исследование обсуждалось развитие антител для диагностики миазы Г. Intestinalis
личинок, хотя специфичность иммунной реакции не была протестирована в возникновении сопутствующей лошади паразитарной инфекции [14]. Совсем недавно, многие протеомики на основе анализа, в сочетании с двумерным гель-электрофореза, предложили комплексный подход, чтобы лучше понять биологические и иммунологические процессы патогенов и заболеваний [15-17]. Цель данного исследования состояла в том, чтобы охарактеризовать L2 и L3 белки G. интестиналис
и для анализа иммунного ответа у лошадей и мышей, иммунизированных против личиночных антигенов.

Результаты 1-D анализ личиночной неочищенного экстракта (LCE) из L2 и L3
миграции LCE2 на серебристо-гель, окрашенный 1-D показал специфическую картину (Фигура 1А) с 14 полосами, которые были выделены из геля для дальнейшей идентификации методом масс-спектрометрии (МС) ( Таблица 1). Выбор полос была основана на интенсивности полосы на окрашенных серебром геле, а также иммуно-реактивности, наблюдаемой после иммуноблоттинга с лошадиной сывороткой (Фиг.1В) или L2-сыворотке мышей (рис 1C). Три белки в 4 из 14 выбранных полос дало значительный балл (р &л; 0,05) и были идентифицированы как актин (рисунок 1А, группа 8), глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (рис 1A, группа 9) и гемоглобина (Фигура 1А, полосы 13 и 14). Иная картина наблюдалась миграция для LCE3 на 1-D серебристо-окрашенный гель (рис 1D). Аналогично, иммуноблоты были выполнены с лошадиной сывороткой (рис 1E) и сывороток L3-мышей (рис 1F). Выбор из 13 полос, показаны стрелками (рис 1D), была основана на тех же критериях, что и выше. Они были выделены для дальнейшей идентификации с помощью МС (таблица 2). Десять белков из 13 выбранных полос дало значительный балл (р &л; 0,05) и были идентифицированы как альфа-цепи личиночной сывороточного белка (рис 1D, полосы 1-4), arylphorin (рис 1D, полоса 6), бета-цепи личиночной сывороточного белка (рис 1D, полоса 7), гемоглобина (рис 1D, полосы 10-12) и муреин липопротеина (рис 1D, полоса 13) .table 1 Масс-спектрометрия идентификации белков, идентифицированных из LCE из L2.
бэнд ID

название белка

видов

инвентарный номер

MW (Da)

ИЭТ


протеин оценка

8
Белок похож на актин-87E изоформы 2
дрозофилы

AAM29410
37816
5,36
223
9
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Drosophila hydei

S24630
35369
8.2
224
13
гемоглобином
Gasterophilus интестиналис

O96457
17912
8,44
440
14
гемоглобин
Gasterophilus интестиналис <бр>
O96457
17912
8,44
144
Пятна назначения см Рисунок 1. Белки, перечисленные были идентифицированы со значительным счетом при р &ЛТ; 0,05 в MSDB.
Таблица 2 Массовая идентификация спектрометрия белков, идентифицированных из LCE из L3.
Полоса ID

название белка

видов

инвентарный номер

MW (Da) завод
Pí


Protein балл <бр>
1
Личиночная сывороточного белка 1 альфа-цепь предшественник
дрозофилы

LSP1A_DROME
98802
5,72
92 страница 2 Личиночная белков сыворотки 1 альфа-цепь предшественник
дрозофилы

LSP1A_DROME
98802
5,72
89 страница 3 из белка сыворотки личинок 1 альфа-цепи предшественника
дрозофилы

LSP1A_DROME
98802
5,72
98 4
Личиночная сывороточного белка 1 альфа-цепь предшественник
дрозофилы

LSP1A_DROME
98802
5,72
102
6
Arylphorin субъединица A4 предшественник
Calliphora Vicina

ARY1_CALVI
92282
5,59
71
7
Личиночная сывороточного протеина бета 1 одноцепочечный предшественник
дрозофилы

LSP1B_DROME
95849
5,41
69
10
Гемоглобин
Gasterophilus интестиналис

O96457
17912
8,44
247
11
Гемоглобин
Gasterophilus интестиналис

O96457
17912
8,44
132
12
Гемоглобин <бр> Gasterophilus интестиналис

LPEBWM
17912
8,44
112
13
Основной предшественник наружной мембраны липопротеинов (муреин-липопротеидов)
Pectobacterium atrosepticum

LPP_ERWCT
8396
9.36
69
Пятна назначения см Рисунок 1. Белки, перечисленные были идентифицированы со значительным счетом при р &ЛТ; 0,05 (1, 2, 3, 4, 6, 7, 13: база данных Expasy; 10, 11, 12: КМРС). Рисунок 1
1-D анализ LCE из L2 и L3. Представитель 1-D серебристо-окрашенный гель LCE из L2 (A) и L3 (D). Стрелки указывают на полосы, которые были выбраны для масс-спектрометрии. Вестерн-блот-анализ L2 инкубировали с лошадиной сывороткой (B) и сывороткой мыши (C). Вестерн-блот-анализ L3 инкубировали с лошадиной сывороткой (Е) и сывороткой мыши (F). Идентификация белка с помощью МС представлены в таблице 1 и 2.
2-D анализ LCE из L2
белке миграцию LCE из L2 на 2-D геле (фиг.2А) показал наличие белки вдоль всего спектра рН. Вестерн-блоттинг проводили с L2-сыворотке мышей (Фигура 2В) и с лошадиной сывороткой (фиг.2с). Серебристо-окрашенный гель используется для выравнивания обнаруженные белковые пятна на обоих профилях иммуноблота. Больший диапазон иммуно-реактивного белка наблюдалась на лошади профиля иммуноблот, чем на L2-мышей иммуноблот. Круги указывают на 12 мест, которые были рассмотрены в качестве иммуно-реактивными с L2-сыворотке мышей (рис 2А, пятна: 1, 2, 6, 8, 14-20, 25) и стрелки указывают на 24 места, которые считались иммунной реактивными с лошадиной сывороткой (Рисунок 2А, пятна: 1-13 и 16-26). В общей сложности 26 мест были выбраны для MS анализа (таблица 3). Среди 26 отобранных мест, 7 белков были успешно идентифицированы (р &л; 0,05) с помощью МС: paramyosin (рис 2А, спот-1), сывороточного альбумина (рис 2А, точечная 5), тубулина (рис 2А, точечная 9), энолазы ( Рисунок 2А, место 11), тропомиозин (рис 2А, место 14), GAPDH (рис 2А, место 19) и гемоглобина (рис 2А, место 20) .table 3 масс-спектрометрического идентификации белков, идентифицированных из LCE из L2.
Пятно ID

название белка

видов

номер Присоединение

MW (Da)

ИЭТ


протеин оценка

1
Paramyosin
дрозофилы

S22028 <бр> 102277
5.5
97 страница 5 Сывороточный альбумин предшественник
Bos Taurus

Abbos
69225
5,8
99
9 <бр> Tubulin альфа-1 цепь
дрозофилы

A26488
49876
5,0
260
11
энолаза
Oryza Sativa

Q7XBE4
47942
5.4
80
14
тропомиозином
дрозофилы

C25242
32740
4,7
78
19 <бр> глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Drosophila hydei

S24630
35369
8,2
100
20
гемоглобин
Gasterophilus интестиналис

O96457
17912
8,4
209
Пятна назначения см Рисунок 2. Белки, перечисленные были идентифицированы со значительным счетом при р &ЛТ; 0,05 в MSDB.
Рисунок 2 2-D анализ LCE из L2. Серебристо-окрашивали представитель 2-D белок карта LCE из L2, содержащую градиент рН от 3 до 11 с MWs ранжирования от 10 до 250 кД (A). Серебристо-окрашенный гель используется для выравнивания обнаруженные белковые пятна на Вестерн-блоттинга, выполненных с сывороткой мышей, иммунизированных LCE из L2 (В) и с лошадиной сыворотки (C). Кружки обозначают пятна, которые были immunolabelled с сывороткой мышей (B; видит 1,2,6,8,14-19,25,26) и стрелки указывают места, которые были immunolabelled с лошадиной сыворотки (C; видит 1-13 и 16-26). В общей сложности 26 мест были выделены для дальнейшей идентификации MS. Идентификация белка с помощью МС представлена ​​в таблице 3.
2-D анализ LCE из L3
протеомного профиля LCE из L3, представленной на фигуре 3А показано, что большинство белков расположены в диапазоне basidic между рН 7-11. Вестерн-блоттинг проводили с L3-сыворотке мышей (рис 3б) и с лошадиной сывороткой (рис 3C). Интенсивность реакции иммунной отличается, когда ХПЛ из L3 подвергается воздействию с L3-мышиной сыворотки или с лошадиной сывороткой, но профили иммуноблот были сходными. После сравнения иммуноблоттинга с серебром-гель, окрашенный, 39 пятна, обозначенные кружками, были отобраны для дальнейшей идентификации MS (таблица 4). 19 из 39 изолированных участков были успешно идентифицированы (р ≪ 0,05), что соответствует 8 различных белков: filamin (фиг.3А, точечной 1), белок теплового шока (HSP-70) (рис 3А, место 2), сывороточный альбумин предшественника (рис 3A, пятно 3,18-20), фосфоэнолпируват карбоксикиназы (PEPCK) (рис 3A, точечная 8), енолаза (рис 3A, пятно 22,23), fumarase (рис 3A, спот 1), бета-актина ( Рисунок 3A, место 27), гемоглобин (рис 3A, пятно 32-39) .table 4 масс-спектрометрического идентификации белков, идентифицированных из LCE из L3.
Пятно ID

название белка

видов

инвентарный номер

MW (Da)

ИЭТ <бр>

протеин оценка

1
Filamin 1
дрозофилы

Q8T3K7
151931
5,72
76
2
теплового шока 70 кДа белок 70C
дрозофилы

HSP7A_DROME
70871
5,34
70 страница 3 сывороточный альбумин
парнокопытных

AAN17824
71274
5,82
171
8
фосфоэнолпируват карбоксикиназы
дрозофилы

PPCK_DROME
71882
6,07
79 <бр> 18
Сывороточный альбумин предшественник
Bos Taurus

ALBU_BOVIN
71244
5,82
108
19
Сывороточный альбумин предшественник
Bos Taurus

ALBU_BOVIN
71244
5,82
117
20
Сывороточный альбумин предшественник
Bos Taurus

ALBU_BOVIN
71244
5,82
165
22
енолаза (фрагмент)
Drosophila subobscura

O44101
44548
5,92
142
23
энолаза
Schistosoma mansoni <бр>
ENO_SCHMA
47421
6,18
163
24
Fumarase
дрозофилы

Q9VTI5
51239
8,47
111
27
бета-актина
Danio rerio

ACTB1_BRARE
42082
5.3
184
32
Гемоглобин
Gasterophilus интестиналис

O96457
18026
8,44
95
33
Гемоглобин
Gasterophilus интестиналис

O96457
18026
8,44
113
34
гемоглобином
Gasterophilus интестиналис

O96457
18026
8,44
131
38
гемоглобин
Gasterophilus интестиналис

O96457
18026
8,44
415
39
Гемоглобин
Gasterophilus интестиналис

O96457
18026
8,44
410
Пятна заданий см Рисунок 3. Белки перечисленное были идентифицированы со значительным счетом при р &ЛТ; 0,05 (2, 8, 18, 19, 20, 23, 27: Expasy базы данных; 1, 3, 22, 24, 32, 33, 34, 38, 39: КМРС) Рисунок 3
2-D анализ. LCE из L3. Серебро пятнах представитель 2-D белок карта LCE из L3, включающий градиент рН от 3 до 11 с MWs ранжирования от 10 до 250 кД (A). Серебристо-гель, окрашенный был использован для выравнивания обнаруженных белковых пятен на вестерн-блоттинга, выполненных с сывороткой мышей, иммунизированных LCE из L3 (В) и с лошадиной сыворотки (C). 39 пятен immunolabelled с обоими сывороток были выделены для дальнейшей идентификации MS. Идентификация белков с помощью МС представлена ​​в таблице 4.
Обсуждение
Сравнение миграционных закономерностей LCE2 и LCE3 в обоих размерного анализа (1-D и 2-D), указывает на то, что личиночной белковый профиль стадии конкретных, таким образом, предлагая различный состав в личиночной метаболизма и антигенные свойства. В 1-D серебро окрашенных гелей личиночной экстрактов сырых показали очень плотную концентрацию белков; следовательно, выравнивание иммуно-реактивных групп, обнаруженных лошади и мышей могут представлять некоторые различия. Протеомные подход подтвердил специфический белковый профиль обоих личиночной стадии и позволило бы лучше определить различные пятна.
Мыши были искусственно иммунизированных против сырого белкового экстракта из всего личинок. Большое количество белков, которые, как правило, непосредственно не контактируют с лошадьми были представлены иммунной системы мышей. Кроме того, в отличие от естественной инфекции вызывая иммунную реакцию, конский, подкожные инъекции у мышей вызывает системный иммунный реакция сдвигается в ответ Th1 по адъюванта. Это различие в иммунной реакции, объясняет тот факт, что большинство белков L2 и L3, которые вступают в реакцию с мышами сывороток показали более интенсивный сигнал по сравнению с реакцией с лошадиной сывороткой. Так как жизненный цикл Г. интестиналис
происходит в желудочно-кишечном тракте лошадей, слизистой иммунной системы находится в контакте с личинками и, таким образом, подвергаются экскретируемых или секретируемых веществ во время личиночной миграции и развития [18]. Хотя миграция L2 модели от рта до желудка, остается неясным, иммунная реакция обнаружена у лошадей и экспериментально иммунизированных мышей можно предположить, что личинка L2 обладает более антигенных белков, чем на личиночной стадии L3, вероятно, полезно для личиночной ферментативной миграции [19]. Соответственно, енолаза был идентифицирован с помощью МС и ранее сообщалось, как важный фермент локализован на поверхности нескольких патогенных микроорганизмов при вторжении ткани [20]. L2 представляет собой этап индукции сильного иммунного ответа хозяина так, что ее развитие в L3 в желудке может быть защитный механизм личинок, чтобы обойти иммунную защиту лошади. С другой стороны, тот факт, что L3 остается присоединенным в течение 8-10 месяцев, чтобы стенки желудка предполагает гипометаболическое статус или уменьшить иммуногенные свойства. Это может объяснить слабую иммунную реакцию, наблюдаемую в присутствии лошадиной сыворотки против L3.
Два важных личиночной белки, arylphorin и ЛСП-2 (личиночной сывороточного белка), соответственно, гомологичные CALLIPHORA Vicina
и дрозофилы <бр>, были идентифицированы в L3. В holometabolous насекомых строительство взрослых тканей во время метаморфоза требует большого количества энергии. Известно, что перед формированием пупария, жировые клетки тела абсорбировать протеины и другие макромолекулы, которые накопились в гемолимфе в течение личиночного периода кормления [21]. Основная часть включенных белков состоит из arylphorins и ЛСП-2 [22]. Кроме того, гемоглобин был выявлен в обоих личиночной стадии Г. Intestinalis
. В этом изобилии и циркулирующих молекула присутствует в сильно tracheated клеток, образующих заднюю пластину Дыхальцевые и позволяет личинки, чтобы лучше использовать прерывистый контакт, когда воздух глотают с пищей [23].
Большинство других идентифицированных белков в L2 (paramyosin , тубулина, тропомиозин, GAPDH и белок похож на актин) или L3 (filamin, fumarase, PEPCK, HSP-70, энолаза) являются общими с таковыми у дрозофилы
SPP. предполагая, что структурные или метаболические гомологий существуют между этими видами.
Во время этого исследования, различные кишечные паразиты (Anoplocephala perfoliata
, Parascaris equorum
, Cyathostominae) были одновременно присутствуют с Г. интестиналис
в гастро -intestinal тракта забитых лошадей. Риск перекрестной реактивности еще предстоит оценить. Но в отличие от некоторых иммунологических исследований о кишечных гельминтов в equids [24-26], перекрестная реактивность между G. интестиналис
и желудочно-кишечных паразитов до сих пор не изучены.
Эта работа предоставляет дополнительную информацию в понимании взаимодействие между Г. интестиналис
и их хозяин и внося новую схему протеомического профилю основных личиночной стадии. Таким образом, наши результаты дополнительно демонстрируют сложность этого взаимодействия хозяин-паразит. На самом деле, это исследование показывает необходимость разработки надежного серологического инструмент для обнаружения зараженных лошадей, особенно потому, что единственным средством для обнаружения G. Intestinalis
инвазия на аутопсии.
Идентификация большинства белков будет Следующим шагом, чтобы определить их роль, их клеточный или тканевой локализации и их потенциальные антигенные свойства.
Методы
личиночной сбора и антигена препарат
Gasterophilus
SPP. L2 и L3 были собраны из пилорического части желудка лошадей, происходящих из двух ферм, расположенных в районе швейцарской Юры; Delémont: N 47 ° 21 '; E 7 ° 20 ', Швейцария. Одновременно, желудочно-кишечного тракта у каждого животного исследовали и наблюдали наличие P. equorum
, А. perfoliata
и Cyathostominae в любом случае.
Все личинки собирают промывали в стерильном фосфатно солевого буфера (PBS, 0,1 М, рН 7,2), идентифицированный как Г. интестиналис
на основе морфологических ключей [1] и замораживали при -20 ° с.
Для приготовления личиночной экстрактов сырых, 10 личинок L2 собран на двух разных лошадях одного и того же стада, и семь личинок L3 заготовленной на одну лошадь, происходящих из второго стада, обрабатывали ультразвуком и гомогенизируют на льду в стерильных условиях. Гомогенат экстрагировали в течение ночи в 0,1 М рН 9,6 карбонатного буфера, содержащего 1 мМ фенилметилсульфонил fluorid (PMSF) и 5 ​​мМ ethylenediamin кислоты (ЭДТА) путем дальнейшего добавления 1 мл /г ингибитора протеазы (Sigma-Aldrich, Buchs, Швейцария) , Экстракты центрифугировали при 20'000 × г
в течение 30 минут (4 ° С). Супернатант, содержащий антигены, собирали и конечное содержание белка определяли с помощью спектрофотометрии (методом Брэдфорда, Biorad). ХПЛ лиофилизировали и хранили при -20 ° C.
Horse Образцы сыворотки
Образцы крови брали на группе из двадцати лошадей, происходящих из двух ферм в описанной выше области. Хотя образцы крови и личиночной коллекция не могла быть сделана на тех же животных, наши наблюдения, сделанные в ходе одновременно проведенного эпидемиологического обследования (Roelfstra и др в стадии подготовки.), В том числе полевых наблюдений на живых животных и в скотобоен, подтвердили высокий уровень эндемичности G. интестиналис
ранее описанные Brocard [19] в том же районе и позволяют нам предположить, что все лошади, используемые в данном исследовании, заражаются Г. Intestinalis
. Фетальной сыворотки лошади, использовали в качестве отрицательного контроля для вестерн-блоттинга. Кровь центрифугировали при 3500 • g
в течение 15 минут при комнатной температуре, и сыворотки хранили при -20 ° С.
Иммунизация мышей и образцы сыворотки
BALB /C мышей, иммунизированных LCE из L2 (мыши L2) или с LCE из L3 (L3 мышей) от G. Intestinalis
. Два грамма L3 и два грамма L2 были облучали ультразвуком, гомогенизируют в стерильном PBS буфере с рН 7,2 и центрифугировали при 20'000 × г
. Затем надосадочную жидкость эмульгировали в равном объеме неполном адъюванте Фрейнда (Sigma-Aldrich, Buchs, Швейцария).
Дозе 100 мкг белка /мышь, в объеме 200 мкл, вводили внутримышечно через каждые 2 недели через 6 недель. У животных брали кровь через семь недель после первой иммунизации. Контрольные мыши были привиты с комбинацией PBS и Фрейнда неполном адъюванте каждый раз выше. Sampled кровь центрифугировали при 3500 • g
в течение 15 минут при комнатной температуре и сывороток хранят при -20 ° С. Все процедуры были одобрены ответственным местным комитетом по экспериментам на животных.
Одномерным электрофорез (1-D)
белках L2 (5 мкг /лунку) и L3 (5 мкг /лунку) были разделены на градиентный SDS -page гели (4-20%) при восстанавливающих условиях (2-β-меркаптоэтанола, 95 ° С в течение 5 мин). Электрофорез проводили при 80/100 В, в течение 30 мин /2 ч. Один набор гелей окрашивали серебром для масс-спектрометрии, а второй переносили на нитроцеллюлозные мембраны (GE Healthcare, Упсала, Швеция) для Вестерн-блоттинга.
Двумерный электрофорез (2-D)
Лиофилизированный LCE образцы растворяют в 2-DE буфера для лизиса (9 М мочевины, 2 М тиомочевины, 1% dithioerythriol, 4% CHAPS, 2,5 мкМ EGTA и 2,5 мкМ ЭДТА). Immobiline сухие полоски рН 3-11 нелинейными, 11 см (GE Healthcare, Упсала, Швеция), погружали на ночь в буфере для лизиса, содержащего 75 мкг образца белка, дополнительный 1% фармалит рН 3-10 (GE Healthcare, Упсала, Швеция), и 0,5% бромфеноловый синий. ИЭФ на Multiphor (GE Healthcare) на 15 кВ · ч при 20 ° С с последующим разделением на градиентный ДСН-ПААГ геле (9-15%) при постоянном 45 В на геле. Один набор гелей окрашивали серебром для РС и второй переносили на нитроцеллюлозные мембраны (GE Healthcare, Упсала, Швеция) для Вестерн-блот-анализа.
Вестерн-блот-анализ (ВБ)
Неспецифическое связывание блокировали 1% поливинилпирролидона в PBS-Tween в течение 1 часа. Затем блоты инкубировали с первичным антителом в PBS-Tween (в течение ночи при 4 ° С, лошадь сывороток мышей, или сывороток 1: 1000) и промывают. Иммунореактивные пятна были обнаружены с помощью козьих антител против мышиного IgG (H + L) (1: 20000, Нордик Immunology Laboratories, Tilburg, Нидерланды) или анти-лошадь IgG (1: 10000, Sigma-Aldrich, Buchs, Швейцария) антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена. Сигналы были обнаружены с ЭСЛ (усиленной хемилюминесценции) на Hyperfilm ЭСЛ (GE Healthcare, Упсала, Швеция) [27]. После обнаружения ЭХЛ блоты затем окрашивают коллоидным золотом, чтобы соответствовать видимые пятна в общий узор на серебряных окрашенных гелей.
Масс-спектрометрия (МС)
Отдельные пятна вырезали из 2-D гелей, обесцвечивают , обрабатывается протеолиза трипсином [28] и анализировали с помощью MALDI-TOF и MS /MS на /TOF тандемной масс-спектрометра MALDI-TOF (ABI 4700 Протеомика Analyzer, Applied Biosystems). Комбинированный PMF (пептид масса отпечатков пальцев) и MS /MS запросы были сделаны с MASCOT © База данных поисковой системы v1.9 [29] (Matrix Science) встроенный в GPS-проводник программного обеспечения (версии 3.6, Applied биосистем) на Swiss- база данных Prot (версия 20051206; 201594 последовательности; 73123101 остатки) или MSDB (версия 20040703; 1501893 последовательности; 480537664 остатки). Идентификация белка считается положительным (таблицы 1, 2, 3 и 4), если (I) вероятность того, на основе оценка MOWSE [30], полученные из обоих МС и МС-анализ /MS было статистически значимым (т.е. баллы > 66 были значимыми при р &ЛТ; 0,05 для базы данных Expasy и оценки > 74 значимыми при р &ЛТ; 0,05 для базы данных MSDB; доверительный интервал > 99%, как указано на GPS исследователем, версия 3.6); (II) совпавшие пептидные массы были в изобилии в спектре; и (III) теоретические молекулярные массы (MW) о значительных хитов соответствуют экспериментальным наблюдаемым значениям.
Объявления
Благодарности
Эта работа была поддержана SFB 571 грант A5 Диг. Авторы выражают благодарность профессору Д. Отранто и проф D.D. Колвелл за свои критические замечания.
Авторов оригинальные представленные файлы для изображений изображения Ниже приведены ссылки на авторов оригинальных представленных файлов для изображений. 'Исходный файл для фигурного 1 13071_2008_54_MOESM2_ESM.pdf Авторского 13071_2008_54_MOESM1_ESM.pdf авторов исходного файла для фигурного 2 исходного файла 13071_2008_54_MOESM3_ESM.pdf Авторского для фигурного 3 конкурирующими интересами
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

• Эндоскопическое закрытие желудка перфораций трубки с титановыми зажимами: отчет четыре случая
• Огромные желудка безоарового вызванное сотами, необычное осложнение здоровья faddism: клинический случай