Protein udtryk profil Gasterophilus intestinalis larver forårsager hest gastrisk larver og karakterisering af hest immunreaktion

Protein udtryk profil Gasterophilus intestinalis
larver forårsager hest gastrisk larver og karakterisering af hest immunreaktion
Abstract
Baggrund
kun få oplysninger om den immunologiske aspekt af parasitære Gasterophilus intestinalis
(Diptera, Oestridae ) larver forårsager hest gastrisk larver. Formålet med denne forskning var at analysere proteinindholdet i larve rå ekstrakter af migrerende anden og tredje larver (L2 og L3) af G. intestinalis
for at karakterisere immunresponset af heste.
Resultater
Den proteomprofilen af ​​L2 og L3, undersøgt ved hjælp af et og to dimensionelle tilgange, afslørede en migration mønster specifik for hver larvestadiet. Endvidere blev Western blots udført med hest sera og med sera fra Balb /c-mus immuniseret med de larvestadiet rå ekstrakter af L2 eller L3, afslører en anden immunreaktion i naturligt inficerede heste vs
. kunstigt induceret immunreaktion i mus. Sammenligninger af immunoblot profiler viser, at den fase L2 er mere immunogene end den fase L3 mest sandsynligt som en virkning af den højeste enzymatisk produktion af L2 mens migrere gennem værtsvæv. Femten proteiner blev identificeret ved massespektrometri.
Konklusion
Dette arbejde indeholder yderligere oplysninger i forståelse af samspillet mellem G. intestinalis
og deres vært og ved at bidrage en roman ordning af proteomprofilen af ​​de vigtigste larver stadier.
Baggrund
Ni arter af Gasterophilus
(Diptera, Oestridae) er fluer blevet beskrevet årsag, i larvestadiet, mave larver i dyr fra hestefamilien. Mens Gasterophilus intestinalis
(De Geer, 1776) og Gasterophilus nasalis
(Linnaeus, 1758) er fordelt over hele verden og er ofte den eneste art rapporteret i mange dele af den nye verden, er de resterende arter kun rapporteret i meget begrænset områder i Europa, østlige lande [1] og Afrika [2]. Voksen bot fluer deponere deres æg på værter hår på forskellige steder afhængigt af arten af ​​Gasterophilus
[3]. G. pecorum
er en undtagelse, da hunnerne lægger deres æg på græs, blade og stængler af planter [1]. Infektion opstår, når æggene indføres i hest munden af ​​dyr slikke og grooming. De første larvestadium (L1) luger, begynder at migrere og fældende ind i den anden larvestadiet (L2) i mundhulen [4]. Larver af forskellige arter af Gasterophilus
er specifikt til stede i en eller flere regioner af mavetarmkanalen, hvor den tredje larvestadium (L3) forbliver fastgjort til slimhinden i omkring 8-10 måneder [5]. De kliniske symptomer forbundet med migrationen og modning stadier af larverne er vanskelige at diagnosticere, men det har vist sig, at forskellige arter af Gasterophilus
kan forårsage alvorlige skader i løbet af deres livscyklus [6-9].
I seneste års undersøgelser vedrørende immunologi og immunopatologi af mange oestrid larver forårsager larver er steget på grund af deres store konsekvenser i diagnostik og vaccinationsprogrammer [10]. Mens immunologiske studier primært var fokuseret på Hypoderma
kvæg grub infektion [11], og får nasal oestrosis af Oestrus ovis
[12], den immunologi af Gasterophilus
spp. forårsaget larver fik lidt opmærksomhed. Det er også på grund af de iboende vanskeligheder ved at studere immunologiske vært-parasit interaktioner på den gastrointestinale slimhinde interface. Som følge heraf hidtil har været rapporteret om større immunogener [13]. En enkelt undersøgelse drøftede udviklingen af ​​antistoffer til diagnosticering af larver ved G. intestinalis
larver selvom specificitet immunreaktion ikke blev testet i forekomsten af ​​samtidig hest parasitisk infektion [14]. For nylig, mange proteomics-baserede analyser, kombineret med to-dimensionel gel-elektroforese, har tilbudt en samlet tilgang til bedre at forstå de biologiske og immunologiske processer patogener og sygdomme [15-17]. Resultater Formålet med denne undersøgelse var at karakterisere L2 og L3 proteiner af G. intestinalis
og at analysere immunresponset af heste og immuniserede mus mod larval antigener.
1-D-analyse af larvestadiet råekstrakt (LCE) af L2 og L3
Migration af LCE2 på 1-D sølvfarvet gel viste et specifikt mønster (figur 1A) med 14 bånd, der blev isoleret fra gelen til yderligere identifikation ved massespektrometri (MS) ( tabel 1). Udvælgelsen af ​​båndene var baseret på intensiteten af ​​bånd på sølvfarvede gel, samt immunreaktivitet observeret efter immunoblotting med hesteserum (figur 1B) eller L2-mus serum (figur 1C). Tre proteiner i 4 ud af de 14 udvalgte frekvensbånd gav en signifikant score (p < 0,05) og blev identificeret som actin (figur 1A, band 8), glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) (figur 1A, band 9) og hæmoglobin (Figur 1A, bånd 13 og 14). En anden migration mønster blev observeret for LCE3 på 1-D sølvfarvet gel (figur 1D). Analogt blev immunblots udført med hest sera (figur 1E) og sera fra L3-mus (figur 1F). Udvælgelsen af ​​13 bands, angivet med pile (figur 1D), var baseret på de samme kriterier som ovenfor. De blev isoleret til yderligere identifikation af MS (tabel 2). Ti proteiner ud af de 13 udvalgte frekvensbånd gav en signifikant score (p < 0,05) og blev identificeret som a-kæden af ​​larvernes serumprotein (figur 1D, bånd 1-4), arylphorin (figur 1D, band 6), beta-kæde af larver serum protein (figur 1D, band 7), hæmoglobin (figur 1D, bånd 10-12) og murein lipoprotein (Figur 1D, band 13) .table en Massespektrometri identifikation af proteiner identificeret fra LCE af L2.
Band ID
Protein navn
Arter
tiltrædelse nummer

MW (Da)
pI
Protein score
8
Protein ligner Actin-87e isoform 2
Drosophila melanogaster

AAM29410
37816
5.36
223
9
glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase
Drosophila hydei
S24630
35.369
8.2
224
13
Hæmoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8,44
440
14
Hæmoglobin
Gasterophilus intestinalis

O96457
17912
8,44
144
Steder opgaver refererer til figur 1. Proteiner opført er blevet identificeret med stor sandsynlighed score ved p < 0.05 i MSDB.
Tabel 2 Massespektrometri identifikation af proteiner identificeret fra LCE af L3.
Band ID

Protein navn
Arter
tiltrædelse nummer
MW (Da)
pI
Protein score

1
Larver serum protein 1 alpha kæde forløber
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
92
2
Larver serum protein 1 alpha kæde forløber
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
89
3
Larve serum protein 1 alpha kæde forløber
Drosophila melanogaster

LSP1A_DROME
98802
5,72
98
4
Larver serum protein 1 alpha kæde forløber
Drosophila melanogaster
LSP1A_DROME
98802
5,72
102
6
Arylphorin underenhed A4 forløber
Calliphora vicina
ARY1_CALVI
92.282
5,59
71
7
Larver serum protein 1 beta kæde forløber
Drosophila melanogaster
LSP1B_DROME
95.849
5.41
69
10
Hæmoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8,44
247
11
Hæmoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8,44
132
12
Hæmoglobin
Gasterophilus intestinalis
LPEBWM
17912
8.44
112
13
Major ydre membran lipoprotein forløber (murein-lipoprotein)
Pectobacterium atrosepticum
LPP_ERWCT
8396
9,36
69
Steder opgaver refererer til figur 1. Proteiner opført er blevet identificeret med stor sandsynlighed score ved p < 0,05 (1, 2, 3, 4, 6, 7, 13: ExPASy database 10, 11, 12: MSDB).
Figur 1 1-D-analyse af LCE af L2 og L3. Repræsentativ 1-D sølvfarvet gel af LCE af L2 (A) og L3 (D). Pilene angiver de bands, blev udvalgt til massespektrometri. Western blot analyse af L2 inkuberet med hesteserum (B) og muse serum (C). Western blot analyse af L3 inkuberet med hesteserum (E) og museserum (F). Proteinet identifikation ved MS er vist i tabel 1 og 2.
2-D analyse af LCE af L2
proteinet vandring af LCE af L2 på en 2-D gel (figur 2A) viste tilstedeværelsen af proteiner langs hele pH-spektret. Western blots blev udført med L2-mus serum (figur 2B) og med hesteserum (figur 2C). Sølv-farvede gel blev anvendt til at justere detekterede proteinpletter på begge immunoblot profiler. Et større udvalg af immunoreaktive proteiner blev observeret på hesten immunoblot profil end på L2-mus immunoblot. Cirkler angiver 12 pletter, der blev betragtet som immuno-reaktivt med L2-mus serum (figur 2A, pletter: 1, 2, 6, 8, 14-20, 25) og pilene angiver 24 pletter, der blev betragtet som immun reaktive med hesteserum (figur 2A, pletter: 1-13 og 16-26). I alt 26 pletter blev udvalgt til MS-analyse (tabel 3). Blandt de 26 udvalgte steder, blev 7-proteiner med succes identificeret (p < 0,05) ved MS: paramyosin (figur 2A, spot 1), serumalbumin (figur 2A, spot 5), tubulin (figur 2A, spot 9), enolase ( Figur 2A, spot 11), tropomyosin (figur 2A, spot 14), GAPDH (figur 2A, spot 19) og hæmoglobin (figur 2A, spot 20) .table 3 Massespektrometriske identifikationer af proteiner identificeret fra LCE af L2.
Spot ID
Protein navn
Arter
tiltrædelse nummer

MW (Da)
pI
Protein score
1
Paramyosin
Drosophila melanogaster
S22028
102.277
5,5
97
5
Serum albumin forløber
Bos taurus
ABBOS
69.225
5,8
99
9
tubulin alfa-1-kæden
Drosophila melanogaster
A26488
49.876
5,0
260
11
Enolase
Oryza sativa
Q7XBE4
47.942
5,4
80
14
tropomyosin
Drosophila melanogaster
C25242
32.740
4.7
78
19
glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase
Drosophila hydei
S24630
35.369
8,2
100
20
Hæmoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
17912
8,4
209
Steder opgaver refererer til figur 2. Proteiner opført er blevet identificeret med stor sandsynlighed score ved p < 0.05 i MSDB.
Figur 2 2-D analyse af LCE af L2. Sølvfarvet repræsentant 2-D-protein kort over LCE af L2 omfatter pH-gradient fra 3 til 11 med MWS ranking fra 10 til 250 kDa (A). Sølv-farvede gel blev anvendt til at justere detekterede protein pletter på Western blots udført med serum fra mus immuniseret med LCE af L2 (B) og med hesteserum (C). Cirklerne angiver pletter, der blev immunolabelled med mus serum (B; blev 1,2,6,8,14-19,25,26), og pilene angiver de pletter, der blev immunolabelled med hesteserum (C; blev 1-13 og 16-26). I alt 26 pletter blev isoleret til yderligere MS identifikation. Proteinet identifikation ved MS er vist i tabel 3.
2-D analyse af LCE af L3
proteomprofilen af ​​LCE L3 præsenteret på Figur 3A viser, at de fleste af proteinerne er placeret i en basidic interval mellem pH 7-11. Western blots blev udført med L3-mus serum (figur 3B) og med hesteserum (figur 3C). Intensiteten af ​​immunreaktionen adskiller når LCE af L3 er eksponeret med L3-mus serum eller med hesteserum men immunblottet profilerne lignede hinanden. Efter sammenligning af immunoblots med sølvfarvet gel blev 39 pletter, vist med cirkler udvalgt til yderligere MS identifikation (tabel 4). 19 ud af de 39 isolerede pletter lykkedes identificeret (p < 0,05), hvilket svarer til 8 forskellige proteiner: filamin (figur 3A, spot 1), varmeshockprotein (HSP-70) (figur 3A, spot 2), serumalbumin precursor (figur 3A, spot 3,18-20), phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PEPCK) (figur 3A, spot 8), enolase (figur 3A, spot 22,23), fumarase (figur 3A, spot 1), beta-actin ( Figur 3A, spot 27), hæmoglobin (figur 3A, spot 32-39) .table 4 Massespektrometriske identifikationer af proteiner identificeret fra LCE af L3.
Spot ID
Protein navn
Arter
tiltrædelse nummer
MW (Da)
pI

Protein score
1
Filamin 1
Drosophila melanogaster
Q8T3K7
151.931
5,72
76
2
Heat shock 70 kDa protein 70C
Drosophila melanogaster
HSP7A_DROME
70.871
5,34
70
3
serumalbumin
Bos taurus

AAN17824
71.274
5,82
171
8
phosphoenolpyruvatcarboxykinase
Drosophila melanogaster
PPCK_DROME
71.882
6,07
79
18
Serum albumin forløber
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
108
19
Serum albumin forløber
Bos taurus

ALBU_BOVIN
71244
5,82
117
20
Serum albumin forløber
Bos taurus
ALBU_BOVIN
71244
5,82
165
22
Enolase (Fragment)
Drosophila subobscura
O44101
44548
5,92
142
23
Enolase
Schistosoma mansoni

ENO_SCHMA
47421
6.18
163
24
fumarase
Drosophila melanogaster
Q9VTI5
51.239
8.47
111
27
Beta-actin
Danio rerio
ACTB1_BRARE
42.082
5,3
184
32
Hæmoglobin
Gasterophilus intestinalis

O96457
18026
8,44
95
33
Hæmoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
113
34
Hæmoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
131
38
Hæmoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
415
39
Hæmoglobin
Gasterophilus intestinalis
O96457
18026
8,44
410
Steder opgaver refererer til Figur 3. Proteiner listen er blevet identificeret med stor sandsynlighed score ved p < 0,05 (2, 8, 18, 19, 20, 23, 27: ExPASy database 1, 3, 22, 24, 32, 33, 34, 38, 39: MSDB)
Figur 3 2-D-analyse af. LCE af L3. Sølvfarvet repræsentant 2-D-protein kort over LCE af L3 omfattende pH-gradient fra 3 til 11 med MWS ranking fra 10 til 250 kDa (A). Sølv-farvede gel blev anvendt til at justere detekterede protein pletter på Western blots udført med serum fra mus immuniseret med LCE af L3 (B) og med hesteserum (C). 39 pletter immunolabelled med både sera blev isoleret til yderligere MS identifikation. Identifikationen protein ved MS er vist i tabel 4.
Diskussion
sammenligning af migrationsmønstre i LCE2 og LCE3 i både dimensionel analyse (1-D og 2-D), angiver, at larver proteinholdige profil er fase specifik, hvilket antyder en anden sammensætning i larvernes metabolisme og antigene egenskaber. De 1-D sølvfarvede geler af de larvestadiet råekstrakter viste en meget tæt koncentration af proteiner; derfor justeringen af ​​immuno-reaktivt bånd opdaget af hest og mus kan præsentere nogle forskelle. Den proteomisk tilgang bekræftede det specifikke protein profil både larvestadier og tillod bedre identifikation af de forskellige vinkler.
Mus blev kunstigt immuniseret mod en rå proteinekstrakt fra hele larver. Et stort antal proteiner, der normalt ikke direkte i kontakt med heste blev præsenteret for immunsystemet hos musene. Endvidere modsætning naturlig infektion fremkalde en hest immunreaktion, subkutan injektion i mus inducerer et systemisk immunreaktion forskudt til et Th1-respons af adjuvans. Denne forskel i immunreaktion forklarer den kendsgerning, at de fleste af de L2 og L3 proteiner, som reagerede med musesera viste en mere intenst signal sammenlignet med reaktionen med hest sera. Da livscyklus G. intestinalis
forekommer i mave-tarmkanalen hos heste, slimhindeimmunsystemet er i kontakt med larver og således udsat for udskilte eller udskilte stoffer under larvernes migration og udvikling [18]. Selvom L2 migrationsmønstrene fra mund til mave fortsat uklart, kan immunreaktion påvises hos heste og i eksperimentelt immuniserede mus tyder på, at larvestadiet L2 besidder mere antigene proteiner end larvestadiet L3, sandsynligvis nyttige til larvernes enzymatisk migration [19]. Følgelig enolase blev identificeret ved MS og er tidligere blevet rapporteret som et vigtigt enzym lokaliseret på overfladen af ​​flere patogener, når invaderende væv [20]. L2 er en fase inducere et stærkt immunrespons hos værten, således at dens udvikling til L3 i maven kan være en forsvarsmekanisme larvernes at omgå hest immunforsvar. Omvendt er den omstændighed, at L3 forbliver fæstnet til 8-10 måneder til mavevæggen foreslår en hypometabolic status eller reducerede immunogene egenskaber. Dette kan forklare den svage immunreaktion observeret i nærvær af hesteserum mod L3.
To vigtige larval proteiner, arylphorin og LSP-2 (larvestadiet serumprotein), henholdsvis homologe med Calliphora vicina
og Drosophila melanogaster
, blev identificeret i L3. I holometabolous insekter opførelsen af ​​voksne væv under forvandling kræver en stor mængde energi. Det er kendt, at før dannelsen af ​​puparium, fedt kroppen celler reabsorb proteiner og andre makromolekyler, der har akkumuleret i hæmolymfen under larvestadiet fodringsperiode [21]. Den største fraktion af inkorporerede proteiner består af arylphorins og LSP-2 [22]. Derudover blev hæmoglobin identificeret i begge larvestadier af G. intestinalis
. Denne rigelige og cirkulerende molekyle er til stede i stærkt tracheated celler danner den bageste spiracular plade og gør det muligt for larverne at gøre bedre brug af intermitterende kontakt, når luft sluges med fødevarer [23].
De fleste af de andre identificerede proteiner i L2 (paramyosin , tubulin, tropomyosin, GAPDH og et protein svarende til actin) eller i L3 (filamin, fumarase, PEPCK, HSP-70, enolase) deles med de af Drosophila
spp. tyder på, at strukturelle eller metaboliske homologier eksisterer mellem disse arter.
Under denne forskning, forskellige tarmparasitter (Anoplocephala perfoliata
, Parascaris equorum
, Cyathostominae) var til stede samtidig med G. intestinalis
i mave -intestinal tarmkanalen af ​​de slagtede heste. Risikoen for krydsreaktivitet er endnu ikke evalueret. Men i modsætning til nogle immunologiske undersøgelser om indvoldsorme i dyr fra hestefamilien [24-26], den krydsreaktivitet mellem G. intestinalis
og gastrointestinale parasitter er endnu ikke blevet undersøgt.
Dette arbejde indeholder yderligere oplysninger i forståelsen af samspillet mellem G. intestinalis
og deres vært og ved at bidrage en roman ordning af proteomprofilen af ​​de vigtigste larvestadier. Således vores resultater viser yderligere kompleksiteten af ​​denne vært-parasit interaktion. Faktisk har denne undersøgelse viser behovet for at udvikle en pålidelig serologisk værktøj til at detektere angrebne heste, især fordi det eneste middel til at detektere en G. intestinalis
angreb er ved obduktion.
Identifikationen af ​​de fleste af proteinerne vil være den næste skridt at definere deres rolle, deres cellulære eller væv lokalisering og deres potentielle antigene egenskaber.
Metoder
Larve indsamling og antigen forberedelse
Gasterophilus
spp. L2 og L3 blev indsamlet fra pylorus del af maven af ​​heste med oprindelse fra to bedrifter i distriktet i den schweiziske Jura; Delémont: N 47 ° 21 '; E 7 ° 20 ', Schweiz. Samtidig blev den gastrointestinale kanal hos hvert dyr undersøgt og tilstedeværelsen af ​​P. equorum
, A. perfoliata
og Cyathostominae blev observeret i alle tilfælde.
Alle larverne opsamlet blev vasket i en steril phosphat saltvand (PBS 0,1M, pH 7,2), identificeret som G. intestinalis
på grundlag af morfologiske nøgler [1] og nedfrosset ved -20 ° C.
til fremstilling af de larvestadium råekstrakter, 10 L2 larver høstet på to forskellige heste af en samme besætning, og syv L3 larver høstet på en hest, der stammer fra den anden besætning blev sonikeret og homogeniseret på is under sterile betingelser. Homogenatet blev ekstraheret natten over i en 0,1 M pH 9,6 carbonat puffer indeholdende 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid fluorid (PMSF) og 5 mM ethylenediamin tetraeddikesyre (EDTA) ved yderligere tilsætning af 1 ml /g af en proteaseinhibitor (Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz) . Ekstrakterne blev centrifugeret ved 20.000 x g
i 30 minutter (4 ° C). Supernatanten indeholdende antigenerne blev opsamlet og det endelige proteinindhold bestemmes ved spektrometri (Bradford-metoden, BioRad). LCE blev lyofiliseret og opbevaret ved -20 ° C.
Hesteserum prøver Salg Blodprøver blev taget på en gruppe på tyve heste med oprindelse fra de to gårde i det ovenfor beskrevne område. Selvom blodprøver og larvernes samling ikke kunne foretages på de samme dyr vores observationer under et samtidigt udført epidemiologisk undersøgelse (Roelfstra et al, i prep.), Herunder feltobservationer af levende dyr og på slagterier, bekræftede den høje endemisk forekomst af G. intestinalis
tidligere beskrevet af Brocard [19] i samme område og tillader os at antage, at alle heste, der anvendes i denne undersøgelse er befængt af G. intestinalis
. Føtalt hesteserum blev anvendt som en negativ kontrol for Western blots. Blodet blev centrifugeret ved 3500 x g
i 15 minutter ved stuetemperatur, og sera blev opbevaret ved -20 ° C.
Immunisering af mus og serumprøver
Balb /c-mus blev immuniseret med LCE af L2 (L2-mus) eller med LCE af L3 (L3 mus) fra G. intestinalis
. To gram af L3 og to gram L2 blev sonikeret, homogeniseret i en steril PBS-buffer pH 7,2 og centrifugeret ved 20.000 x g
. Supernatanten blev derefter emulgeret i samme volumen Freunds ufuldstændige adjuvans (Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz).
En dosis på 100 ug protein /mus, i et volumen på 200 pi blev injiceret intramuskulært hver 2. uge gennem 6 uger. Dyr blev tappet syv uger efter den første immunisering. Kontrolmus blev inokuleret med en kombination af PBS og Freunds inkomplette adjuvans hver gang ovenfor. Samplet blod blev centrifugeret ved 3500 x g
i 15 minutter ved stuetemperatur, og sera blev opbevaret ved -20 ° C. Alle procedurer blev godkendt af den ansvarlige lokale udvalg om dyr eksperimenter. Salg One dimensional elektroforese (1-D)
Proteinerne i L2 (5 ug /brønd) og L3 (5 ug /brønd) blev adskilt på gradient SDS -side geler (4-20%) under reducerende betingelser (2-β-mercaptoethanol, 95 ° C i 5 minutter). Elektroforese blev udført ved 80/100 V i 30 min /2 timer. Et sæt af geler blev farvet med sølv til massespektrometri, og den anden blev overført til nitrocellulose membraner (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) til Western blot-analyse.
To dimensional elektroforese (2-D)
Frysetørret LCE prøver blev solubiliseret i 2-DE-lysepuffer (9 M urinstof, 2 M thiourinstof, 1% dithioerythriol, 4% CHAPS, 2,5 uM EGTA og 2,5 pM EDTA). Immobilin tørre strimler pH 3-11 ikke-lineære, 11 cm (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) blev nedsænket natten over i lysis buffer indeholdende 75 ug protein prøve, yderligere 1% Pharmalyte pH 3-10 (GE Healthcare, Uppsala, Sverige), og 0,5% bromphenolblåt. IEF på en Multiphor (GE Healthcare) i 15 kV · h ved 20 ° C blev efterfulgt af separation på gradient SDS-PAGE geler (9-15%) ved konstant 45 V pr gel. Et sæt geler blev farvet med sølv til MS og den anden blev overført til nitrocellulosemembraner (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) til Western blot analyse.
Western blot-analyse (WB)
Ikke-specifik binding blev blokeret med 1% polyvinylpyrrolidon i PBS-Tween i 1 time. Blots blev efterfølgende inkuberet med primært antistof i PBS-Tween (natten over ved 4 ° C; horse sera eller musesera 1: 1000) og vasket. De immunoreaktive pletter blev detekteret ved anvendelse af et gede anti-mus IgG (H + L) (1: 20000, Nordic Immunology Laboratories, Tilburg, Holland) eller et anti-hest-IgG (1: 10000, Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz) antistof konjugeret med peberrodsperoxidase. Signaler blev påvist med ECL (forøget kemiluminescens) på Hyperfilm ECL (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) [27]. Efter ECL afsløring blev blots efterfølgende farvet med kolloid guld for at matche de synlige pletter til overordnede mønster på sølv-farvede geler.
Massespektrometri (MS)
Udvalgte pletter blev udskåret fra 2-D-geler, affarvet , behandlet ved proteolyse med trypsin [28] og analyseret ved MALDI-TOF og MS /MS på en MALDI-TOF /TOF tandem massespektrometer (ABI 4700 Proteomics Analyzer, Applied Biosystems). Kombineret PMF (peptid masse fingeraftryk) og MS /MS forespørgsler blev udført med MASCOT © Database søgemaskine v1.9 [29] (Matrix Science) indlejret i GPS-Explorer software (version 3.6, Applied Biosystem) på schweizisk Prot database (version 20.051.206; 201594 sekvenser; 73123101 rester) eller MSDB (version 20.040.703; 1501893 sekvenser 480537664 rester). Protein identifikation blev betragtet positive (tabel 1, 2, 3 og 4), hvis (i) sandsynligheden-baserede MOWSE score [30] fås fra både MS og MS /MS-analyse var signifikant (dvs. scores > 66 var signifikant ved p <0,05 for ExPASy database, og scores > 74 signifikant ved p < 0,05 for MSDB database konfidensinterval > 99% som gives af GPS opdagelsesrejsende, udgave 3.6); (Ii) den matchede peptidmasser var rigeligt i spektret; og (iii) de teoretiske molekylvægte (MW) af de betydelige hits passer de eksperimentelle observerede værdier.
erklæringer
Tak
Dette arbejde blev støttet af SFB 571 tilskud A5 Deeg. Forfatterne er taknemmelige for professor D. Otranto og Prof. D.D. Colwell for deres kritiske bemærkninger.
Forfattere 'originale indsendte filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 13071_2008_54_MOESM1_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 1 13071_2008_54_MOESM2_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 2 13071_2008_54_MOESM3_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 3 konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

• Endoskopisk lukning af gastrisk rør perforeringer med titanium klip: en fire-sag report
• Kæmpe gastrisk bezoar forårsaget af honeycomb, en usædvanlig komplikation af sundhed faddism: en sag report