Motstånd av våmmen bakterier murein mot bovint gastric lysozyme

motstånd av våmmen bakterier murein mot bovint gastric lysozym Bild Sammanfattning
Bakgrund
lysozymer, enzymer oftast i samband med försvar mot bakteriella infektioner, är mureinolytic. Idisslare har utvecklats en gastric c typ lysozym som ett matsmältningsenzym och resultatet från rötning av foregut bakterier, efter de flesta kostkomponenter, inklusive protein, har jäst i våmmen
. I detta arbete kännetecknas vi de biologiska aktiviteterna hos nötkreatur gastric sekret mot membran, renat murein och bakterier.
Resultat
bovin gastric extrakt (BGE) var aktiva mot både G + och G- bakterier, men effekten mot Gram bakterier var inte på grund av att lysozym, eftersom renat BGL hade bara aktivitet mot Gram + bakterier. Vi kunde inte hitta små porbildande peptider i BGE, och fann att inhibering av gramnegativa bakterier genom BGE berodde på en artefakt orsakad av acetat. Vi rapporterar för första gången aktiviteten hos bovin gastric lysozym (BG lysozym) mot rena bakteriekulturer, och det specifika motståndet hos vissa vommen grampositiva stammar till BGL.
Slutsatser
Vissa Gram + vommen bakterier visade motståndskraft mot löpmagen lysozym. Vi diskuterar konsekvenserna av detta konstaterande i ljuset av möjliga praktiska tillämpningar av sådan stabil antimikrobiell peptid.
Bakgrund
lysozymer är beta-N-acetyl-muramyl-hydrolas som stör bakterie murein [1]. Den vanligaste djur lysozym är det c typ, såsom kyckling äggvitelysozym (EWL, 14,3 kDa), som finns i djur, insekter och växter [2]. Enkelmagade djur har en enda gen för lysozym c uttrycks i olika vävnader [3] och tros vara primärt involverad i försvar mot bakterieinfektioner.
Däremot idisslare har flera lysozym gener [4], och åtminstone fyra kod för en gastric lysozym som fungerar som en mag enzym. De flesta kostkomponenter fermenteras i vommen till flyktiga fettsyror [5], och de idisslare fördelarna med digesting foregut bakterier som en källa av aminosyror. Ko gastric lysozym är en grundläggande enzym anpassad för att agera i de hårda mag villkor, med optimal aktivitet vid lågt pH (4,5-5,2), låg jonstyrka värden, och resistent mot syra och pepsin [6, 7]. Vi har tidigare rapporterat att rekryteringen av lysozym som en gastric matsmältningsenzym konvergent har inträffat i fågel foregut fermentorn hoatzin [8], även med flera genduplikation händelser under dess utveckling [9]. Aminosyraskillnader mellan homologa proteiner från olika arter kan ha adaptiv betydelse, vilket är fallet med gastriska lysozymer. Lysozymer från magen på kor och langur apor (både med jäsning i foregut) är föremål för en positiv darwinska val [10, 11].
Vommen bakterier utgör en viktig komponent i vommen biomassa [5] och är en trolig faktor utöva evolutionärt tryck på gastric lysozym och andra mag sekret i växtätare med foregut jäsning. Detta föranledde oss att etablera 2 hypoteser: 1 - det kan finnas andra löpmagen peptider med antimikrobiell aktivitet utöver lysozym, som också skulle fungera mot gramnegativa bakterier; 2 - Eftersom vommen bakterier har varit föremål för selektivt tryck av gastriska antimikrobiella sekret kan vommen bakterier har utvecklat resistens mot dessa föreningar. Syftet med detta arbete var att karakterisera de biologiska aktiviteterna hos nötkreatur gastric sekret mot membran, renat murein och bakterier.
Resultat
Cow löpmagen slemhinna gav 26,4 mg BGE per g vävnad (1,32 g, lyofiliserat extrakt per 100 ml ättiksyra utdrag ur 50 g våt slemhinna, sd 0,61, N = 20). Proteinhalten i extrakt var 60%, vilket motsvarar 16 mg protein per gram av gastrisk vävnad. Totalt 5 g av gastrisk extraktet var föremål för kromatografi och 82,2 mg aktiv (lytisk) protein erhölls. Detta representerar ett utbyte av 1,64% vikt /vikt av lysozym från råextraktet, och 0,43 mg lysozym per gram vävnad.
SDS-PAGE av det bovina gastric extraktet avslöjade ett huvudproteinband på omkring 15 kDa och två andra band av större proteiner (30 och 45 kDa). Icke denaturering elektrofores visade proteinband med lytisk aktivitet på M. luteus
-embedded overlay gel, förmodligen gastric lysozym. Lys av M. luteus
suspension genom den gastriska extraktet visas i fig. 1. Specifik aktivitet (på M. luteus
) av extraktet från hela magslemhinnan var 3,40 U (sd 1,48, N = 20) vid pH 5,5. Specifik aktivitet av den gastriska extraktet minskade 32% vid pH 6 (2,42 U) och 42% vid pH 6,5 (2,04 U). Utdrag specifik aktivitet vid pH 5,5 var högre i extrakt av gastric fundus (4,39 U) än i den för antrum och kroppen (2,49 U och 2,34 U, respektive). Figur 1 bacteriolytic aktivitet gastric extrakt mot M. luteus
. Lytisk aktivitet visas som% av initial spridning av en M. luteus
suspension (0,25 mg /ml i acetatbuffert pH 5,5) behandlades (anges med pil) med gastriska extrakt av hela löpmagen slemhinna (E1, E2, E3, E4 och E, motsvarande extrahera koncentrationer av 42, 133, 233, 417 och 554 | ig /ml, respektive) och EWL (5 | j, g /ml).
BGE var bakteriolytiska mot M. luteus
på ett koncentrationsberoende sätt (Figur 1). BGE nedbrytes också muramidas E.coli
murein, som producerar en annan profil än den svamp lysozym cellosyl (fig 2). Muropeptides har en grundläggande struktur som består av N-acetylglukosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-Glu-gamma-mDap-R1R2, där R1 och R2 är substituenter på L-karboxi och D-aminogrupper. BGE (500 | j, g /ml) producerade olika muropeptides till de som produceras av cellosyl (50 | ig /ml), däribland avsaknaden av en topp vid minut 27 (muropeptide med R1 = D-Ala och R2 = H) som producerades genom behandling med cellosyl. Denna topp eluerades och inkuberades med både BGE och cellosyl. BGE diger vidare denna muropeptide (Fig 2c) medan cellosyl inte (Fig 2d). Detta tyder på hatten till skillnad från cellosyl har BGE lysozym L, D karboxipeptidas eller Nacetyl muramyl-L-ala amidasaktivitet. Figur 2 muramidas aktiviteten hos gastric extrakt på Escherichia coli
renat murein. Muropeptide profil efter digerering av murein med gastric extrakt (500 | ig /ml, A) eller med det fungala muramidas cellosyl (50 ug /ml, b). Cellosyl producerade en tetrapeptid vid 27 min motsvarande M4 (som har R1 = D-Ala och R2 = H). Denna digererades ytterligare genom gastrisk extrakt (500 ^ g /ml, c) men inte efter cellosyl (50 ug /ml, d).
BGE var aktivt mot P. aeruginosa
och E. coli
, permeabiliserad vesiklar och depolariserade liposomer. Dessa aktiviteter screenades i isolerade proteiner och små peptider som ger inga aktiva peptider från BGE extrakt, inklusive BGL, inaktiva mot gramnegativa bakterier (tabell 1). Permeabilisering aktivitet visade sig bero på acetat i magsäcksextrakt, eftersom BSA återsuspenderades i ättiksyra och lyofiliserades hade liknande aktivitet som BGE. BGL inte hämmar tillväxten av vissa grampositiva vommen bakterier såsom S. L. acidophilus
och bovis
, som var starkt inhiberas av EWL, vilket indikerar specifik resistans på i vommen bakterier murein till BGL (tabell 1) .table 1 Procentandel av tillväxten av kontrollkulturer vid 6 timmar, av Gram + och gram bakterier odlas i närvaro av EW lysozym, BG lysozym och BGE.
URSPRUNG
BAKTERIE
äggvita Lysozyme150 ug /ml
Bovine Gastric Lysozyme150 ug /ml

vid Bovine Gastric Extract10 mg /ml
vid vid vid pH 5,5
pH 7,0

pH 5,5
pH 7,0
pH 5,5
pH 7,0
MILJÖ, intestinal
grampositiva
M. luteus

lyserade en
lyserade en
lyserade en
lyserade en
lyserade en
lyserade en
gramnegativa
P. aeruginosa
106
173
142
182
0
90
E. coli
103
91
86
124
15
44
VÅM
grampositiva
L. vitulinus
en 4
81
69
10
8
L. acidophilus
0
NG
64
NG
168
NG
S. bovis
101
6
108
114
98
111
gramnegativa
S. ruminantium
109
112
130
96
89
87
P. ruminicola
NG
24
NG
113
NG
208 1
= celler lyserades genom behandling i spridningsanalys. Italic djärva tal = tillväxt hämmas. NG
= ingen tillväxt av kulturen vid detta pH.
Diskussion
muramidas aktivitet i det sura magen på en foregut fermentor, tar emot en betydande biomassa av bakterier, kan nedbrytning av bakteriecellväggar och avreglering av aminosyra rik cellinnehåll. Aktiviteten hos BG lysozym på renat murein var skiljer sig från andra c lysozymer att ha lägre optimalt pH och L, D karboxipeptidas eller Nacetyl muramyl-L-ala amidasaktivitet. Det var, liksom andra lysozymer, aktiva endast mot grampositiva bakterier. Andra system såsom Entamoeba histolytica
, är kända för att innehålla lysozym agerar i samförstånd med membran permeabilisering peptider [12], men försök att rena aktiva små peptider från BGE har misslyckats hittills Förekomst av gramnegativa bakterier i.
vommen verkar inte ha drivit utvecklingen av gastric peptider som kan försämra dem. Detta skulle begränsa effektiviteten hos systemet, eftersom endast grampositiva bakterier är mottagliga för rötning, och gramnegativa bakterier utgör en avsevärd andel av vommen bakteriebiomassa. Vidare har vissa vommen grampositiva bakterier verkar ha utvecklat resistens mot verkan av BG lysozym. Våmmen bakterien Streptococcus bovis
kan utveckla resistens mot det porbildande peptiden nisin, genom att modifiera cell lipoteichoic syror. Förvärv av nisin resistens också lysozym motstånd [13]. Lite är känt om bakterier utvecklar resistens mot lysozymer från värd de kolonisera, som i fallet med Rumen bakterier och gastric bovint lysozym. Fenomenet kan spegla selektionstryck av mag enzymet på vommen bakterier, eftersom BGL-resistenta bakterier kommer att vara mer benägna att kolonisera den nedre tarmen och vommen hos unga djur, än BGL-känsliga stammar.
Sökandet efter nya antibakteriella droger har lett till utforska mer spekulativa metoder för att förstöra eller hämma patogen mikroorganismer och virus. Det är frestande att optimistiskt förutspår att mycket stabila peptider som naturligt utvecklats som gastric antimikrobiella kan ha en hög potential för kliniska tillämpningar. Humant lysozym (utsöndras av monocyter), medan du spelar en skyddande roll mot infektioner, trycker superoxid generation neutrophyls och förbättrar lymfocytproliferativa svar [14-17]. EWL har tillämpats mot bakterie- och virusinfektioner, baserat på dess immunstimulering och antiinflammatoriska egenskaper [18].
Idisslare BG lysozymer, har utvecklats i en mycket fientlig miljö såsom magen, har utvecklat resistens mot syra och proteolys, och kan hålla lovande användningsområden inom behandling av infektioner, och inom livsmedelsindustrin. I djurproduktionsindustrin, har användningen av antibiotika och hormoner som tillväxtbefrämjande poserade hälsorisker för människor och djur och foder tillskott med vissa tillväxtbefrämjande medel är nu olagligt. Användningen av nya tillväxtbefrämjande som inte utgör problem av motstånd är en prioritet, och antimikrobiella peptider är naturligtvis goda kandidater. I själva verket har lysozym visat sig vara lika effektivt som konventionella antibiotika, för att främja tillväxten av fjäderfä [19]. Men upptäckten av kapaciteten hos bakterier förmodligen ändra sin bakterie murein och bli resistenta mot lytiska verkan lysozymer, kommer säkert att vara av intresse i praktiska tillämpningar, som har bakteriell antibiotikaresistens.
Slutsatser
Detta arbete visar som gastric bovint lysozym är aktivt mot grampositiva bakterier men att vissa vommen stammar är opåverkade av enzymet. Möjliga praktiska tillämpningar av denna antimikrobiell peptid som ett alternativ till antibiotika kan begränsas av utvecklingen av bakteriell resistens mot lytiska verkan lysozymer.
Metoder
Gastric extrakt och lysozym rening
Ättiksyra utdrag ur löpmagen slemhinna var framställd såsom beskrivits av Dobson et al. [7]. Nötkreatur gastric extrakt (BGE) var frystorkade och hålls frysta. BGE proteiner separerades genom denaturerande och icke-denaturerande PAGE-elektrofores. Band lytisk aktivitet avslöjades på en överliggande agarosgel inbäddade med M. luteus
. Rening av BG lysozym utfördes återupplösande frystorkat BGE i 10 vol. av 10% ättiksyra, centrifugering vid 150000 x g vid 4 ° C under 1 h. Den resulterande supernatanten, späddes 1: 2,5 med 20% acetonitril /0,08% trifluorättiksyra. Materialet fick passera i 0,5 ml satser under en Superdex Pep 10/30 kolonn (Pharmacia LKB) jämviktad med 20% acetonitril /0,08% trifluorättiksyra vid 20 ° C och en flödeshastighet av 0,1 ml /min. Aktiva fraktioner poolades, späddes ut 1: 2 med startbuffert (50 mM natriumacetat, pH 4,5) och laddades på en Mono S 05/05 katjon-bytarkolonn (Pharmacia LKB) jämviktad med utgångsbuffert. Adsorberade proteinet eluerades genom tvättning av kolonnen med samma buffert (5 ml) och med användning av en 0-500 mM NaCl-gradient (15 ml) och en slutlig tvättning av 1 M NaCl vid 10 ° C. Aktivt material utspäddes 1:13 med startbuffert (50 mM natriumacetat, pH 7,8) och applicerades åter till en Mono S HR 5/5 kolonn (Pharmacia LKB) jämviktad med utgångsbuffert. Kolonnen tvättades med samma buffert (5 ml) och framkallades med en 15 ml gradient av 0-500 mM NaCl vid 10 ° C. Aktiva fraktioner poolades och lagrades vid -20 ° C. Omvändfas-HPLC utfördes på en Aquapore Butyl 300-kolonn (2,1 x 30 mm, Brownlee Labs) som är ansluten med en 130 A separationssystem (Applied Biosystems). Eluering utfördes med en linjär gradient av 0-84% acetonitril i 0,1% trifluorättiksyra vid 30 ° C under 45 min. En flödeshastighet av 0,2 ml min-1 anbringades, var utflödet övervakades genom absorbans vid 214 nm. Toppfraktioner samlades upp manuellt och testas omedelbart för lysozym aktivitet med användning av lysoplate teknik [20]. Tricin-SDS-elektrofores utfördes i 13% separations geler [21].
Antimicrobial tester
Lytisk aktivitet mot M. luteus
bestämdes genom spridning förändringar i en suspension av Micrococcus luteus
(0,25 mg /ml i acetatbuffert) [8]. Äggvita (EW) lysozym (Sigma) användes som en kontroll. Specifik aktivitet per ug av gastrisk extrakt definierades som aktivitetsenheter av ett ng av EWL på M. luteus
, vid pH 5,5. Hämmande verkan på bakterietillväxt bestämdes på buljong och agar lysoplates [20]. Mikroutspädningsresistensbestämning [22] användes för att bestämma minimala hämmande koncentrationer. Effekt av BGE eller BG lysozym på bakterietillväxt bestämdes i buljongkulturer där tillväxten övervakades turbidimetriskt (A600 nm).
Muramidas aktivitet BGE analyserades på renat E. coli
murein [23] med cellosyl (Hoechst , Frankfurt am Main, 50 | ig /ml) och gastrisk extrakt (500 | j, g /ml), bestämning genom HPLC produktionen av lösliga lågmolekylära muropeptides [24]. En kontroll utan murein ingick i körningarna och gav inga toppar. Vid behov producerades muropeptides in individuellt på UV-detektion utlopp, vakuumtorkades, återsuspenderades i MilliQ vatten och avsaltas såsom beskrivits tidigare [23] Membran permeabilyzing.
Aktivitet gastric extrakt bestämdes fluorimetricaly genom befrielsen av karboxifluorescein ( CF) från borstgräns membranvesiklar från gris tarm borste gränsen [25] och genom avledning av en valinomycin-inducerad diffusion potential i liposomer [26].
förklaringar
Authors 'ursprungliga inlämnade handlingarna Images of Nedan finns länkarna till författarnas original lämnat filer för bilder. 12898_2003_35_MOESM1_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 1 12898_2003_35_MOESM2_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 2 12898_2003_35_MOESM3_ESM.ppt Författaroriginalfilen för figur 3 12898_2003_35_MOESM4_ESM.ppt Författaroriginalfilen för figur 4

• Livskvalitet hos patienter med magcancer: översättning och psykometrisk utvärdering av den iranska versionen av EORTC QLQ-STO22
• Upprättande och karakterisering av en metastas modell av human magcancer i nakna möss