Modstand af vombakterier murein til kvæg gastrisk lysozyme

Modstand af vombakterier murein til kvæg gastrisk lysozym
Abstract
Baggrund
Lysozymer, enzymer meste forbundet med forsvar mod bakterielle infektioner, er mureinolytic. Drøvtyggere har udviklet en gastrisk c typen lysozym som et fordøjelsesfremmende enzym, og overskud fra fordøjelse af fortarm bakterier, efter de fleste kosten komponenter, herunder protein, er blevet gæret i vommen
. I dette arbejde karakteriserede vi de biologiske aktiviteter af bovine gastriske sekreter mod membraner, renset murein og bakterier.
Resultater Salg Bovine gastrisk ekstrakt (BGE) var aktive over for både G + og G- bakterier, men effekten mod gramnegative bakterier skyldtes ikke lysozymet, da oprenset BGL havde kun aktivitet mod Gram + bakterier. Vi kunne ikke finde små poredannende peptider i BGE, og fandt, at inhiberingen af ​​gramnegative bakterier ved BGE skyldtes en artefakt forårsaget af acetat. Vi rapporterer for første gang aktiviteten af ​​bovine gastrisk lysozym (BG lysozym) mod rene bakteriekulturer, og den specifikke modstand nogle vommen grampositive stammer til BGL.
Konklusioner
Nogle Gram + vombakterier viste modstand mod abomasum lysozym. Vi diskuterer konsekvenserne af dette fund i lyset af mulige praktiske anvendelser af en sådan stabil antimikrobielle peptid.
Baggrund
Lysozymer er beta-N-acetyl-muramyl-hydrolase, der forstyrrer bakteriel murein [1]. Den mest almindelige dyr lysozym Er C type, såsom kylling æggehvide lysozym (EWL, 14,3 kDa), findes i animalske, insekter og planter [2]. Enmavede dyr besidder et enkelt gen for lysozym c udtrykt i forskellige væv [3], og menes at være primært involveret i forsvar mod bakterielle infektioner.
I modsætning hertil drøvtyggere har flere lysozym gener [4], og mindst fire kode for en gastrisk lysozym, der fungerer som et fordøjelsesenzym. De fleste kostkomponenter fermenteres i vommen til flygtige fedtsyrer [5], og fordelene ved at fordøje fortarm bakterier som en kilde til aminosyrer drøvtyggere. Ko gastrisk lysozym er en grundlæggende enzym indrettet til at virke under de barske gastriske betingelser, med optimal aktivitet ved lav pH (4,5-5,2), lav ionstyrke værdier, og modstandsdygtig over for syre og pepsin [6, 7]. Vi har tidligere rapporteret, at ansættelsen af ​​lysozym som en gastrisk fordøjelsesfremmende enzym konvergent er sket i den aviær fortarm fermenter Hoatzin [8], også med flere gen dobbeltarbejde hændelser under dens udvikling [9]. Aminosyreforskelle mellem homologe proteiner fra forskellige arter kan have adaptive betydning, som det er tilfældet med gastriske lysozymer. Lysozymer fra maver køer og langur aber (begge med gæring i fortarm) er omfattet af positiv darwinistisk selektion [10, 11].
Vom bakterier udgør en vigtig del af vommen biomasse [5] og er en sandsynlig faktor udøve evolutionære pres på gastrisk lysozym og andre gastriske sekretioner i planteædere med fortarm fermentering. Dette fik os etablere 2 hypoteser: 1 - der kan være andre abomasum peptider med antimikrobiel aktivitet foruden lysozym, der også ville handle mod Gram-negative bakterier; 2 - da vommen bakterier har været genstand for den selektive pres af gastriske antimikrobielle sekreter, måske vombakterier har udviklet resistens over for disse forbindelser. Formålet med dette arbejde var at karakterisere de biologiske aktiviteter af bovine gastriske sekreter mod membraner, oprenset murein og bakterier.
Resultater
Cow abomasum mucosa afkaster 26,4 mg BGE pr g væv (1,32 g, lyofiliseret ekstrakt pr 100 ml eddikesyre ekstrakt fra 50 g våd slimhinde, SD 0,61, N = 20). Proteinindhold af ekstrakter var 60%, svarende til 16 mg protein pr gram af gastrisk væv. I alt 5 g gastrisk ekstrakt blev underkastet kromatografi og 82,2 mg aktiv (lytiske) protein blev opnået. Dette repræsenterer et udbytte på 1,64% vægt /vægt af lysozym fra den rå ekstrakt og 0,43 mg lysozym pr gram væv.
SDS-PAGE af bovin gastrisk ekstrakt afslørede en større proteinbånd på ca. 15 kDa og to andre bånd af større proteiner (30 og 45 kDa). Ikke denaturerende elektroforese viste proteinbånd med lytisk aktivitet på M. luteus
-embedded overlay gel, formentlig gastrisk lysozym. Lyse af M. luteus
suspension ved gastrisk ekstrakt er vist i fig. 1. Specifik aktivitet (på M. luteus
) af ekstrakten fra hele maveslimhinden var 3,40 U (sd 1,48, N = 20) ved pH 5,5. Specifik aktivitet af mavens ekstrakt faldt 32% ved pH 6 (2,42 U) og 42% ved pH 6,5 (2,04 U). Uddrag specifik aktivitet ved pH 5,5 var højere i ekstrakten af ​​gastrisk fundus (4,39 U) end for antrum og krop (2,49 U og 2,34 U, henholdsvis). Figur 1 bakteriolytisk aktivitet af gastrisk ekstrakt mod M. luteus
. Lytisk aktivitet vist som% af initial spredning af en M. luteus
suspension (0,25 mg /ml i acetatpuffer pH 5,5) behandlet (angivet med pil) med gastriske ekstrakter af hele abomasum mucosa (E1, E2, E3, E4 og E, svarende til at udtrække koncentrationer på 42, ​​133, 233, 417 og 554 ug /ml) og EWL (5 ug /ml).
BGE var bakteriolytisk mod M. luteus
i en koncentrationsafhængig måde (figur 1). BGE nedbrudt også muramidase E. coli
murein, der producerer en anden profil til den for det fungale lysozym cellosyl (figur 2). Muropeptides har en grundlæggende struktur bestående af N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-Glu-gamma-MDAP-R1R2, hvor R1 og R2 er substituenter på L-carboxy og D-aminogrupper. BGE (500 ug /ml) producerede forskellige muropeptides til dem, der fremstilles ved cellosyl (50 ug /ml), herunder manglen på en top ved minut 27 (muropeptide med R1 = D-Ala og R2 = H), der blev fremstillet ved behandling med cellosyl. Denne top blev elueret og inkuberet med både BGE og cellosyl. BGE fordøjet yderligere denne muropeptide (Fig 2c) mens cellosyl ikke (figur 2d). Dette tyder på hat modsætning cellosyl, BGE lysozym har L, D carboxypeptidase eller Nacetyl muramyl L-ala amidaseaktivitet. Figur 2 muramidase aktivitet af gastrisk ekstrakt på Echerichia coli
oprenset murein. Muropeptide profil efter fordøjelse af murein med gastrisk ekstrakt (500 ug /ml, a) eller med svampens muramidase cellosyl (50 ug /ml, b). Cellosyl produceret et tetrapeptid på 27 min svarende til M4 (med R1 = D-Ala og R2 = H). Dette blev yderligere spaltet ved gastrisk ekstrakt (500 ug /ml, c), men ikke af cellosyl (50 ug /ml, d).
BGE var aktiv over for P. aeruginosa
og E. coli
, permeabiliserede vesikler og depolariserede liposomer. Disse aktiviteter blev screenet i isolerede proteiner og små peptider der giver ingen aktive peptider fra BGE ekstrakt, herunder BGL, inaktive over Gram-negative bakterier (Tabel 1). Permeabiliserende aktivitet viste sig at skyldes acetat i det gastriske ekstrakt, eftersom BSA resuspenderet i eddikesyre og lyofiliseret havde lignende aktivitet som BGE. BGL ikke inhiberer væksten af ​​nogle grampositive vombakterier såsom L. acidophilus
og S. bovis
, som blev stærkt inhiberet af EWL, hvilket indikerer specifik modstand vombakterien murein til BGL (tabel 1) .table 1 Procentdel af væksten af ​​kontrolkulturer på 6 timer, af Gram + og gramnegative bakterier dyrket i nærvær af EW lysozym, BG lysozym og BGE.
ORIGIN
bakterie
Egg White Lysozyme150 ug /ml
bovin Gastrisk Lysozyme150 ug /ml


bovin Gastrisk Extract10 mg /ml



pH 5,5
pH 7,0

pH 5,5
pH 7,0
pH 5,5
pH 7,0
MILJØ, intestinal
Gram positiv
M. luteus

lyseret 1
lyseret 1
lyseret 1
lyseret 1
lyseret 1
lyseret 1
Gram negative
P. aeruginosa
106
173
142
182
0
90
E. coli
103
91
86
124
15
44
rumen
Gram positive
L. vitulinus
1
4
81
69
10
8
L. acidophilus
0
NG
64
NG
168
NG
S. bovis
101
6
108
114
98
111
Gram negativ
S. ruminantium
109
112
130
96
89
87
P. ruminicola
NG
24
NG
113
NG
208 Salg 1
= celler lyseret ved behandling i spredende assay. Kursiv fed skrift = vækst hæmmes. NG
= ingen vækst af kulturen ved denne pH.
Diskussion
muramidase aktivitet i det sure maven på en fortarm fermenter, modtager en betydelig biomasse af bakterier, tillader fordøjelsen af ​​bakterielle cellevægge og liberalisering af aminosyre -rige celleindhold. Aktiviteten BG lysozym på renset murein var anderledes end andre c lysozymer i at have lavere optimale pH og L, D carboxypeptidase eller Nacetyl muramyl L-ala amidaseaktivitet. Det var, ligesom andre lysozymer, aktive kun mod Gram positive bakterier. Andre systemer som Entamoeba histolytica
, er kendt for at indeholde lysozym handler i forståelse med membran permeabilisering peptider [12], men forsøg på at rense aktive små peptider fra BGE har svigtet, hidtil.
Tilstedeværelse af Gram-negative bakterier i vommen synes ikke at have drevet udviklingen af ​​gastriske peptider i stand til at nedbryde dem. Dette vil begrænse effektiviteten af ​​systemet, eftersom kun grampositive bakterier er modtagelige for fordøjelse, og Gram-negative bakterier udgør en betydelig del af vommen bakteriel biomasse. Endvidere synes at have udviklet resistens over for virkningen af ​​BG lysozym nogle ruminale gram-positive bakterier. Rumen-bakterien Streptococcus bovis
kan udvikle resistens over for det poredannende peptid nisin, ved at modificere celle lipoteichoinsyre syrer. Erhvervelse af nisinresistens tillægges også lysozym modstand [13]. Der vides kun lidt om bakterier udvikler resistens over for lysozymer fra værten, de koloniserer, som i tilfælde af bakterierne i vommen og gastrisk bovint lysozym. Fænomenet kan afspejle den selektive pres af mavens enzym på vombakterier, da BGL-resistente bakterier vil være mere tilbøjelige til at kolonisere den nederste tarmen og vommen af ​​unge dyr, end BGL-følsomme stammer.
Søgen efter nye antibakterielle narkotika har ført til at udforske mere spekulative metoder til at ødelægge eller hæmmer patogene mikroorganismer og vira. Det er fristende at optimistisk forudsige, at meget stabile peptider, der naturligt udviklede som gastrisk antimikrobielle midler kan have et stort potentiale for kliniske anvendelser. Menneskelig lysozym (udskilles af monocytter), mens du spiller en beskyttende rolle mod infektioner, trykker superoxid generation af neutrophyls og forbedrer lymfocyt proliferativ reaktion [14-17]. EWL er blevet anvendt mod bakterie- og virusinfektioner, baseret på dets immun-stimulering og anti-inflammatoriske egenskaber [18].
Drøvtyggere BG lysozymer, har udviklet sig i en meget fjendtlige omgivelser, såsom maven, har udviklet resistens over for syre og proteolyse, og kan besidde lovende anvendelser i behandling af infektioner, og i fødevareindustrien. I animalske landbrugsproduktion, har brugen af ​​antibiotika og hormoner som vækstfremmere stillet sundhedstrusler for mennesker og dyr og foder, tilskud med nogle vækstfremmere er nu ulovligt. Anvendelsen af ​​nye vækstfremmere, der ikke skaber problemer for modstand er en prioritet, og antimikrobielle peptider er selvfølgelig gode kandidater. Faktisk har lysozym vist sig at være så effektiv som konventionelle antibiotika, for at fremme væksten af ​​fjerkræ [19]. Men opdagelsen af ​​kapaciteten af ​​bakterier til formentlig ændre sin bakterielle murein og bliver resistente over for lytisk virkning af lysozymer, vil helt sikkert være til bekymring i praktiske anvendelser, som har bakteriel antibiotikaresistens.
Konklusioner
Dette arbejde viser at gastrisk bovin lysozym er aktivt mod gram-positive bakterier, men at nogle vommen stammer er upåvirket af enzymet. Mulige praktiske anvendelser af denne antimikrobielt peptid som et alternativ til antibiotika kan være begrænset af udviklingen af ​​bakteriel resistens over for lytisk virkning af lysozymer. Salg Metoder
Gastrisk ekstrakt og lysozym oprensning
Eddikesyre ekstrakt fra abomasal mucosa var fremstillet som beskrevet af Dobson et al. [7]. Bovine gastrisk ekstrakter (BGE) var frysetørret og holdes frossen. BGE proteiner blev separeret ved denaturering og ikke-denaturerende PAGE elektroforese. Band lytisk aktivitet blev afsløret på en overliggende agarosegel indlejret med M. luteus
. Oprensning af BG lysozym blev udført genopløsning lyofiliseret BGE i 10 vol. 10% eddikesyre, centrifugering ved 150.000 x g ved 4 ° C i 1 time. Den resulterende supernatant blev fortyndet 1: 2,5 med 20% acetonitril /0,08% trifluoreddikesyre. Materialet blev passeret i 0,5 ml portioner over en Superdex Pep 10/30 søjle (Pharmacia LKB) ækvilibreret med 20% acetonitril /0,08% trifluoreddikesyre ved 20 ° C og en strømningshastighed på 0,1 ml /min. Aktive fraktioner blev samlet, fortyndet 1: 2 med startpuffer (50 mM natrium-acetat, pH 4,5) og sat på en Mono S 5/5 kationbytter-søjle (Pharmacia LKB) ækvilibreret med udgangsbuffer. Adsorberet protein blev elueret ved vask af søjlen med den samme puffer (5 ml) og ved anvendelse af en 0-500 mM NaCI-gradient (15 ml) og en endelig vask af 1 M NaCl ved 10 ° C. Aktivt materiale blev fortyndet 1:13 med startpuffer (50 mM natrium-acetat, pH 7,8) og påført igen på en Mono S HR 5/5 søjle (Pharmacia LKB) ækvilibreret med udgangsbuffer. Søjlen blev vasket med den samme buffer (5 ml) og fremkaldt med en 15-ml gradient af 0-500 mM NaCl ved 10 ° C. Aktive fraktioner blev samlet og opbevaret ved -20 ° C. Omvendt fase-HPLC blev udført på en Aquapore Butyl 300-søjle (2,1 x 30 mm; Brownlee Labs) forbundet med en 130 A separationssystem (Applied Biosystems). Eluering blev udført med en lineær gradient af 0-84% acetonitril i 0,1% trifluoreddikesyre ved 30 ° C i løbet af 45 min. En strømningshastighed på 0,2 ml min-1 blev anvendt, blev effluenten overvåges ved absorbans ved 214 nm. Topfraktioner blev opsamlet manuelt, og testet straks for lysozym aktivitet under anvendelse af lysoplate teknik [20]. Tricin-SDS-elektroforese blev udført i 13% adskillelse geler [21].
Antimikrobielle tests Salg lytisk aktivitet mod M. luteus
blev bestemt ved at sprede ændringer i en suspension af Micrococcus luteus
(0,25 mg /ml i acetatpuffer) [8]. Æggehvide (EW) lysozym (Sigma) blev anvendt som kontrol. Specifik aktivitet pr ug af gastrisk ekstrakt blev defineret som enheder af aktivitet på 1 ng EWL på M. luteus
, ved pH 5,5. Inhiberende virkning på bakterievækst blev bestemt på bouillon og agar lysoplates [20]. Mikrofortynding følsomhed test [22] blev anvendt til bestemmelse minimale inhibitoriske koncentrationer. Effekt af BGE eller BG lysozym på bakterievækst blev bestemt i bouillon kulturer, hvor væksten blev overvåget turbidimetrisk (A600 nm).
Muramidase aktivitet BGE blev analyseret på renset E. coli
murein [23] med cellosyl (Hoechst , Frankfurt am Main, 50 ug /ml) og gastrisk ekstrakt (500 ug /ml), bestemmelse ved HPLC produktionen af ​​opløselige lavmolekylære muropeptides [24]. En kontrol uden murein indgik i kører og gav ingen toppe. Når det er påkrævet, blev produceret muropeptides indsamlet individuelt ved UV-detektion stikkontakt, vakuum tørret, resuspenderes i MilliQ vand og afsaltet som beskrevet tidligere [23].
Membrane-permeabilyzing aktivitet af gastrisk ekstrakter blev bestemt fluorimetricaly ved befrielsen af ​​carboxyfluorescein ( CF) fra børste grænserne membranvesikler fra gris tarm børste grænsen [25] og ved spredning af en valinomycin-induceret diffusion potentiale i liposomer [26].
erklæringer
Forfattere 'oprindelige indsendt filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendt filer til billeder. 12898_2003_35_MOESM1_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12898_2003_35_MOESM2_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12898_2003_35_MOESM3_ESM.ppt Forfatternes oprindelige fil til figur 3 12898_2003_35_MOESM4_ESM.ppt Forfatternes oprindelige fil til figur 4

• Livskvalitet hos patienter med gastrisk cancer: oversættelse og psykometrisk vurdering af den iranske version af EORTC QLQ-STO22
• Etablering og karakterisering af en metastase model af menneskets mavekræft i nøgne mus