Resistencia de las bacterias del rumen mureína a la lisozima bovina gástrica

Resistencia de las bacterias del rumen mureína a lisozima bovina gástrica
Resumen Antecedentes

lisozimas, enzimas mayormente asociada con la defensa contra las infecciones bacterianas, son mureinolytic. Los rumiantes han evolucionado una lisozima gástrico de tipo C como una enzima digestiva, y el beneficio de la digestión de las bacterias del intestino anterior, después de que la mayoría de los componentes de la dieta, incluyendo la proteína, han sido fermentados en el rumen
. En este trabajo se caracterizó la actividad biológica de las secreciones gástricas bovina contra membranas, mureína purificada y bacterias.
Resultados
bovina extracto gástrica (BGE) fue activa contra ambas bacterias G + y G-, pero el efecto contra las bacterias Gram no era debido a la lisozima, ya purificada BGL sólo tenía actividad contra bacterias Gram +. No hemos podido encontrar péptidos que forman pequeños poros en el BGE, y encontramos que la inhibición de las bacterias Gram negativas por BGE se debió a un artefacto causado por el acetato. Se presenta por primera vez la actividad de la lisozima bovina gástrico (BG lisozima) frente a cultivos bacterianos puros, y la resistencia específica de algunas cepas Gram positivas rumen a BGL.
Conclusiones
Algunas bacterias Gram + rumen mostraron resistencia a cuajar la lisozima. Se discuten las implicaciones de este hallazgo a la luz de las posibles aplicaciones prácticas de un péptido antimicrobiano tal estable.
Antecedentes
lisozimas son beta-N-acetil-muramil-hidrolasa que interrumpen mureína bacteriana [1]. La lisozima animal más común es el tipo C, tales como el huevo de gallina lisozima (LEM, 14,3 kDa), que se encuentra en animales, insectos y plantas [2]. Los animales monogástricos poseen un único gen de la lisozima c expresa en diversos tejidos [3] y se cree que es principalmente implicados en la defensa contra las infecciones bacterianas.
En contraste, los rumiantes tienen múltiples genes de lisozima [4], y al menos cuatro de código para una lisozima gástrico que funciona como una enzima digestiva. La mayoría de los componentes de la dieta son fermentados en el rumen a los ácidos grasos volátiles [5], y los beneficios de rumiantes de la digestión de las bacterias del intestino anterior como una fuente de aminoácidos. Cow lisozima gástrica es una enzima de base adaptada para actuar en las condiciones gástricas severas, con una actividad óptima a pH bajo (4.5 a 5.2), los valores de fuerza iónica baja, y resistente al ácido y la pepsina [6, 7]. Hemos informado anteriormente de que la contratación de lisozima como una enzima digestiva gástrica se ha producido de manera convergente en el intestino anterior aviar fermentador hoatzín [8], también con múltiples eventos de duplicación de genes durante su evolución [9]. diferencias de aminoácidos entre proteínas homólogas de diferentes especies pueden tener significado adaptativo, como es el caso con lisozimas gástricas. Lisozimas del estómago de las vacas y monos langur (ambos con fermentación en el intestino anterior) son objeto de selección positiva darwinista [10, 11].
Bacterias del rumen representan un componente importante de la biomasa del rumen [5] y es un factor de probabilidad ejerciendo presión evolutiva sobre la lisozima gástrico y otras secreciones gástricas en los herbívoros con la fermentación del intestino anterior. Esto llevó a establecer hipótesis 2: 1 - que puede haber otros péptidos con actividad antimicrobiana abomaso, además de la lisozima, que también actuarían contra las bacterias Gram negativas; 2 - ya que las bacterias del rumen han estado sujetas a la presión selectiva de las secreciones gástricas antimicrobianos, las bacterias del rumen podrían haber desarrollado resistencia a estos compuestos. El objetivo de este trabajo fue caracterizar las actividades biológicas de las secreciones gástricas bovinos contra membranas, mureína y bacterias purificado.
: Resultados de la mucosa del abomaso vaca produjeron 26,4 mg BGE por g de tejido (1,32 g, de extracto liofilizado por 100 ml de extracto acético a partir de 50 g de mucosa húmeda, sD 0.61, n = 20). El contenido de proteína de los extractos fue 60%, equivalente a 16 mg de proteína por gramo de tejido gástrico. Un total de 5 g de extracto de gástrico fue sujeto a cromatografía, y se obtuvieron 82,2 mg de proteína activa (lítico). Esto representa un rendimiento de 1,64% w /w de la lisozima a partir del extracto crudo, y 0,43 mg de lisozima por gramo de tejido.
SDS-PAGE del extracto gástrico bovino reveló una banda principal de proteína de aproximadamente 15 kDa y otros dos bandas de proteínas más grandes (30 y 45 kDa). electroforesis no desnaturalizante mostró la banda de proteína con actividad lítica sobre M. luteus
gel de superposición -embedded, presumiblemente lisozima gástrico. La lisis de M. luteus
suspensión por el extracto gástrico se muestra en la Fig. 1. La actividad específica (en M. luteus
) del extracto de toda la mucosa gástrica fue 3,40 U (sd 1,48, N = 20) a pH 5,5. La actividad específica del extracto gástrico disminuyó 32% a pH 6 (2,42 U) y 42% a pH 6,5 (2,04 U). Extraer actividad específica a pH 5,5 fue más alta en el extracto de fondo gástrico (4,39 U) que en la de antro y cuerpo (2,49 U y 2,34 U, respectivamente). Figura 1 bacteriolítica actividad de extracto gástrica contra M. luteus
. actividad lítica se muestra como% de la dispersión inicial de un M. luteus
suspensión (0,25 mg /ml en tampón de acetato pH 5,5) tratados (indicada por la flecha) con extractos gástricos de toda mucosa abomaso (E1, E2, E3, E4 y e, correspondientes a extraer las concentraciones de 42, 133, 233, 417 y 554 g /ml, respectivamente) y EWL (5 mg /ml).
BGE era bacteriolítica contra M. luteus
de una manera dependiente de la concentración (Figura 1). BGE también degrada Muramidasa E. coli
mureína, produciendo un perfil diferente al de la cellosyl lisozima hongos (Fig 2). Muropéptidos tienen una estructura básica que consta de N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D-Glu-gamma-MDAP-R1R2, en la que R1 y R2 son sustituyentes en la L-carboxi y grupos de D-aminoácidos. BGE (500 mg /ml) produjo diferentes muropéptidos a los producidos por cellosyl (50 g /ml), incluyendo la falta de un pico a 27 minutos (muropeptide con R1 = D-Ala y R2 = H) que fue producido por tratamiento con cellosyl. Este pico se eluyó y se incubaron con tanto BGE y cellosyl. BGE digerido aún más esta muropeptide (figura 2c), mientras que no lo hizo cellosyl (figura 2d). Esto sugiere sombrero a diferencia cellosyl, BGE lisozima tiene L, D o carboxipeptidasa Nacetyl muramil actividad amidasa L-Ala. La Figura 2 la actividad Muramidasa de extracto gástrico en Escherichia coli
mureína purificada. perfil Muropeptide después de la digestión de mureína con extracto gástrico (500 g /ml, a) o con el cellosyl muramidasa fúngica (50 ug /ml, b). Cellosyl produjo un tetrapéptido a los 27 min que corresponde a M4 (con R1 = D-Ala y R2 = -H). Este fue digerido adicionalmente por extracto gástrico (500 ug /ml, c), pero no por cellosyl (50 ug /ml, d).
BGE era activa contra P. aeruginosa y E. coli

, permeabilized vesículas y liposomas despolariza. Estas actividades se rastrearon en proteínas aisladas y pequeños péptidos que no producía péptidos activos del extracto BGE, incluyendo BGL, inactivo contra las bacterias Gram negativas (Tabla 1). actividad permeabilizante resultó ser debido a acetato en el extracto gástrico, ya que BSA se resuspendió en ácido acético y se liofilizó tenía una actividad similar a BGE. BGL no inhibe el crecimiento de algunas bacterias del rumen Gram positivas, tales como L. acidophilus y S. bovis

, que fueron altamente inhibido por EWL, lo que indica la resistencia específica de las bacterias del rumen mureína a BGL (Tabla 1) .Tabla 1 Porcentaje de crecimiento de los cultivos de control a las 6 horas, de Gram + y bacterias Gram-crecido en presencia de EW lisozima, lisozima BG y BGE.
ORIGEN
BACTERIA
clara de huevo Lysozyme150 ug /ml
bovina gástrico Lysozyme150 ug /ml


bovina gástrico Extract10 mg /ml



pH 5,5
pH 7,0

pH 5,5
pH 7,0
pH 5,5
pH 7,0
AMBIENTAL, intestinales
Gram positivas
M. luteus
lisan lisan 1

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