Odolnosť baktérií bachora mureínu na bovinné žalúdočné lyzozým

Odolnosť baktérií bachora mureínu bovínnej žalúdočné lyzozým
abstraktné
pozadia
lyzozýmu, enzýmy väčšinou spojené s obranou proti bakteriálnym infekciám, sú mureinolytic. Prežúvavce sa vyvinuli žalúdočné typu C lyzozým ako tráviace enzýmy, a zisk z trávenia foregut baktérií potom, čo väčšina diétne komponenty, ako sú bielkoviny, než doteraz používané kvasenia v bachore
. V tejto práci sme charakterizované biologickej aktivity dobytka žalúdočných sekrétov voči membrán, čistenej mureínu a baktérií.
Výsledky
bovínnej žalúdočné extraktu (BGE) bola aktívna proti obom G + a G- baktérií, ale účinok proti gram-baktérií nebolo vzhľadom k lyzozým, pretože čistený BGL mal len aktivitu proti gram + baktérie. Nepodarilo sa nám nájsť peptidy, ktoré tvoria malé póry v BGE, a zistil, že inhibícia gramnegatívne baktérie podľa BGE bol kvôli artefaktu spôsobeného acetátu. Popisujeme prvýkrát aktivita hovädzieho žalúdočné lyzozýmu (BG lyzozýmu) proti čistých bakteriálnych kultúr, a merný odpor niektoré pozitívne kmene gram-bachora do BGL.
Závery
niektorým gram + baktérie bachora ukázali odolnosť voči slezu lyzozým. My diskutovať o dôsledkoch tohto nálezu vo svetle možných praktických aplikácií takého stabilného antimikrobiálne peptid.
Pozadie
lyzozýmu sú beta-N-acetyl-muramyl-hydroláza, ktoré narúšajú bakteriálnu mureínu [1]. Najčastejšou zviera Lyzozým je typu C, ako je napríklad kuracie vaječného bielka lyzozým (EWL, 14,3 kDa), sa nachádzajú v živočíšnych, hmyzu a rastlín [2]. Monogastrické zvieratá majú jediný gén pre lyzozým c vyjadrené v rôznych [3] tkanív a predpokladá sa, že sa v prvom rade zapojený v obrane proti bakteriálnym infekciám.
Naopak, prežúvavce majú viac lyzozým génov [4], a aspoň štyri kód žalúdočné lyzozým, ktorý funguje ako tráviaci enzým. Väčšina zloženie výživy sú fermentované v bachore na prchavé mastné kyseliny [5], a prežúvavcov výhody trávenie foregut baktérie ako zdroj aminokyselín. Krava žalúdka Lyzozým je základný enzým upravený konať v drsných podmienkach žalúdku, s optimálnou aktivitou pri nízkom pH (4.5-5.2), nízke hodnoty iónovej sily, a odolná proti kyselinám a pepsínu [6, 7]. Už skôr sme uviedli, že nábor lyzozým ako žalúdočné tráviaceho enzýmu konvergentné došlo v vtáčej foregut fermentora hoacinotvaré [8], tiež s niekoľkými génovou duplikáciou udalostí v priebehu svojho vývoja [9]. aminokyselinových rozdielov medzi homológne proteíny z rôznych druhov, môže byť adaptívne význam, ako je to v prípade žalúdočných lyzozýmu. Lyzozýmu zo žalúdkov kráv a hulman opíc (oba s kvasenie v foregut) je podmienené kladným Darwinovej selekcia [10, 11].
Bachorová baktérie predstavujú dôležitú súčasť bachora [5] biomasy, a je pravdepodobné, že faktor vyvíjanie evolučný tlak na žalúdočné lyzozým a ďalších žalúdočných štiav v bylinožravce s foregut fermentácie. Táto výzva nám nadviazať 2 hypotézy: 1 - tam by mohlo byť ďalšie slezu peptidy s antimikrobiálne aktivitou okrem lyzozým, ktoré by tiež pôsobí proti gramnegatívne baktérie; 2 - vzhľadom na to bachorová baktérie boli podrobené selekčného tlaku žalúdočných antimikrobiálnych sekrétov, Rumen baktérie mohli vyvinuli odolnosť voči týchto zlúčenín. Cieľom tejto práce bolo charakterizovať biologickej aktivity dobytka žalúdočných sekrétov voči membrán, čisteného mureínu a baktérií.
Výsledky
Cow slezu sliznice priniesli 26,4 mg BGE na gram tkaniva (1,32 g, lyofilizovaného extraktu na 100 ml octovej výpisu z 50 g vlhkého sliznice, SD 0,61, n = 20). Obsah proteínu v extrakte bola 60%, čo zodpovedá 16 mg proteínu na gram žalúdočné tkaniva. Celkom 5 g žalúdočné extraktu bolo predmetom chromatografie, a bolo získané 82,2 mg účinnej (lytické) proteínu. Tento výťažok 1,64% m /m lyzozýmu zo surového extraktu a 0,43 mg lyzozýmu na gram tkaniva.
SDS-PAGE z hovädzieho extraktu žalúdočné odhalila hlavný proteínový pás o 15 kDa a ďalšie dva pásy väčších proteínov (30 a 45 kDa). Non denaturácia elektroforéza ukázal proteínový prúžok s lytické aktivity na M. luteus
-embedded kontextové gélu, pravdepodobne žalúdočné lyzozým. Lýze M. luteus
suspenzií žalúdočné extraktu je znázornené na obr. 1. Špecifická aktivita (na M. luteus
) v extrakte z celého žalúdočnej sliznice bol 3,40 U (SD 1,48, N = 20) pri pH 5,5. Špecifická aktivita žalúdka extraktu sa znížil o 32% pri pH 6 (2,42 U) a 42% pri pH 6,5 (2,04 U). Extrakt špecifickú aktivitu pri pH 5,5 bol vyšší v extrakte žalúdku fundusu (4,39 U), ako v tom, že z antra a tela (2,49 U a 2,34 U, v uvedenom poradí). Obrázok 1 bacteriolytic činnosť žalúdka extraktu proti M. luteus
. Lytické aktivity uvedené ako% počiatočnej rozptylu v M. luteus
suspenzie (0,25 mg /ml v ACETÁTY pufri o pH 5,5), ktorý sa (označené šípkou) s žalúdočnými výťažkami z celého slezu sliznice (E1, E2, E3, E4 a E, čo zodpovedá extrahovať koncentrácie 42, 133, 233, 417 a 554 ug /ml, v danom poradí) a EWL (5 ug /ml).
BGE bol bacteriolytic proti M. luteus
v závislosti od koncentrácie (obrázok 1). BGE tiež degradovaný Muramidasa E. coli
mureínu, produkovať iný profil k tomu, ktorý hubového lyzozýmu cellosyl (obrázok 2). Muropeptides majú základnú štruktúru, skladajúci sa z N-acetylglukosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-Glu-gamma-MDAP-R1R2, kde R1 a R2 sú substituenty v L-karboxy a D-aminoskupiny. BGE (500 ug /ml), vyrába rôzne muropeptides s účinkami cellosyl (50 ug /ml), vrátane nedostatku vrcholom za minútu 27 (muropeptide s R1 = D-Ala a R2 = H), ktorý bol produkovaný pôsobením s cellosyl. Tento vrchol sa vymýva a inkubované ako s BGE a cellosyl. BGE ďalej stráviteľné tento muropeptide (obr 2c), zatiaľ čo cellosyl nemali (obr 2D). To naznačuje, klobúk na rozdiel od cellosyl, BGE lyzozým má L, D alebo karboxypeptidáza Nacetyl muramyl L-ala amidázové aktivitu. Obrázok 2 Muramidasa činnosť žalúdka extraktu na Echerichia coli
čistenej mureínu. Muropeptide profil po trávenie mureínu s žalúdočné extrakt (500 ug /ml, a) alebo hubového Muramidasa cellosyl (50 ug /ml, b). Cellosyl produkoval tetrapeptid pri teplote 27 min, čo zodpovedá M4 (s R1 = D-Ala a R2 = H). Tento bol ďalej štiepený pomocou žalúdočnej extraktu (500 ug /ml, c), ale nie cellosyl (50 ug /ml, d).
BGE bol aktívny voči P. aeruginosa stroje a E. coli
, permeabilizovány pľuzgieriky a depolarized lipozómy. Tieto aktivity boli testované v izolovaných proteínov a malé peptidy prinášajúcich žiadne aktívne peptidy z extraktu BGE, vrátane BGL, účinné proti Gram-negatívnych baktérií (tabuľka 1). Permeabilizací aktivitu Ukázalo sa, že v dôsledku acetát v žalúdočnej extrakte, pretože BSA resuspendované v kyseline octovej a vysuší zmrazením mal podobnú aktivitu ako BGE. BGL neinhibuje rast niektorých baktérií, grampozitívnych bachora, ako je L. acidophilus stroje a S. bovis
, ktoré boli vysoko inhibované EWL, označujúci špecifický odpor bachora baktérií mureínu na BGL (tabuľka 1) .Table 1 Percento rastu kontrolných kultúr po 6 hodinách, v Gram + a Gram baktérie pestované v prítomnosti lyzozýmu EW, BG lyzozýmu a BGE.
PÔVOD
baktérie
vaječného bielka Lysozyme150 ug /ml
bovínnej žalúdka Lysozyme150 ug /ml


dobytka žalúdka Extract10 mg /ml



pH 5,5
pH 7,0

pH 5,5
pH 7,0
pH 5,5
pH 7,0
PROSTREDIA, črevné
Gram pozitívne
M. luteus
lyžovalo 1
lyzovanej 1
lyzovanej 1
lyzovanej 1
lyzovanej 1
lyzovanej 1
gramnegatívne
P. aeruginosa
106
173
142
182
0
90
E. coli
103
91
86
124
15
44
bachora
Gram pozitívne
L. vitulinus
1
4
81
69
10
8
L. acidophilus
0
NG
64
NG
168
NG
S. bovis
101
6
108
114
98
111
gramnegatívne
S. ruminantium
109
112
130
96
89
87
P. ruminicola
NG
24
NG
113
NG
208
1
= bunky lyžovanie pôsobením v rozptylu teste. Kurzíva Tučné čísla = rast inhibovaný. NG
= žiadny rast kultúry pri tomto pH.
Diskusia
Muramidasa aktivity v kyslom žalúdku foregut fermentora, ktorý je príjemcom značnej biomasy baktérií, umožňuje trávenie bakteriálnych bunkových stien a liberalizáciu aminokyseliny bohatý obsah bunky. Aktivita BG lyzozýmu na čistené mureínu sa líši od ostatných c lyzozýmu v tom, že spodná optimálne pH a L, D alebo karboxypeptidáza Nacetyl muramyl-L-ala-amidázy aktivitu. Bolo to, rovnako ako ostatné lyzozýmu, aktívny iba proti grampozitívnym baktériám. Iné systémy, ako je Entamoeba histolytica
, je známe, že obsahujú lyzozým koná v zhode s membránou permeabilizací peptidy [12], ale snaží sa očistiť aktívny malé peptidy z BGE zlyhali, tak ďaleko.
Prítomnosť gramnegatívne baktérie v bachora nezdá sa, že riadené evolúcia žalúdočných peptidov, ktoré sú schopné degradovať je. To by obmedzilo účinnosť systému, pretože len gram pozitívne baktérie sú prístupné pre trávenie, a gramnegatívne baktérie predstavujú značnú časť bachora bakteriálnej biomasy. Ďalej, niektoré bachorová Gram pozitívne baktérie sa zdá, že sa vyvinula rezistencia voči pôsobeniu BG lyzozýmu. Bachora baktérie Streptococcus bovis
môže vyvinúť rezistencia na póry tvoriace peptid nizínu, modifikácií bunkovej lipoteichoic kyselín. Obstaranie nizínu odporu takisto udeľuje lyzozýmu rezistenciu [13]. Málo je známe o baktérie vzniku rezistencie na lyzozýmu od hostiteľa sa kolonizovať, ako je tomu v prípade bachore baktérií a žalúdočné dobytka lyzozýmu. Tento jav môže odrážať selekčného tlaku žalúdočné enzýmu na bachora baktérií, pretože BGL-rezistentné baktérie budú s väčšou pravdepodobnosťou kolonizovať nižšia črevo a bachora mladých zvierat, než BGL-citlivými kmeňmi.
Hľadanie nových antibakteriálne drogy viedlo k objavovaniu viac špekulatívne prístupy k zničeniu alebo inhibujú patogény mikroorganizmy a vírusy. To je lákavé optimisticky predpokladať, že vysoko stabilné peptidy, ktoré sa prirodzene vyvinuli ako žalúdočné antimikrobiálne látky môžu mať vysoký potenciál pre klinické aplikácie. Ľudský lyzozým (vylučovaný monocyty), zatiaľ čo zohráva ochrannú úlohu proti infekciám, potláča tvorbu superoxidu z neutrophyls a zvyšuje proliferačnú odpoveď lymfocytov [14-17]. EWL bola použitá proti bakteriálnym a vírusovým infekciám, na základe jeho imunitný stimuláciu a protizápalové vlastnosti [18].
Prežúvavcov BG lyzozýmu, že sa vyvinul vo veľmi nepriateľské prostredie, ako v žalúdku, sa vyvinula rezistencia na kyselinu a proteolýzy, a môžu držať sľubné použitie v liečbe infekcií, a v potravinárskom priemysle. Vo výrobnom priemysle zvierat, použitia antibiotík a hormónov ako rastových to predstavuje zdravotné ohrozenie ľudí a zvierat a krmivá doplnenie s niektorými rastovými je teraz nezákonné. Využitie nových rastových stimulátorov, ktoré nepredstavujú problém rezistencie je prioritou, a antimikrobiálne peptidy sú samozrejme dobré kandidátmi. V skutočnosti bolo zistené, lyzozým, musí byť rovnako účinný ako konvenčné antibiotiká, pri podpore rastu hydiny [19]. Avšak, objav kapacity baktérií pravdepodobne zmeniť svoj bakteriálne mureínu a stávajú rezistentné na lytickú pôsobenie lyzozýmu, bude iste treba v praktických aplikáciách, ako je bakteriálna rezistenciu voči antibiotikám.
Závery
táto práca ukazuje že žalúdočné hovädzie lyzozým je účinný proti grampozitívnym baktériám, ale že niektoré bachorová kmene sú ovplyvnené enzýmu. Možné praktické aplikácie tohto antimikrobiálneho peptidu ako alternatíva k antibiotikám môže byť obmedzený vývoj bakteriálnej rezistencie na lytickú pôsobenie lyzozýmu.
Metódy
žalúdočné extraktu a čistenie lyzozýmu
, kyseliny octovej a extrakt z abomasal sliznice bol pripravený ako je popísané Dobson et al. [7]. Dobytka žalúdka extrakty (BGE) boli lyofilizované a udržiavať v zmrazenom stave. BGE proteíny boli oddelené denaturáciu a non-denaturačné PAGE elektroforézy. Kapela lytická aktivita bola odhalená na prekrývajúce agarózovom géle s vstavanými M. luteus
. Čistenie BG lyzozýmu bola vykonaná re-rozpustením lyofilizovaného BGE v 10 obj. 10% kyseliny octovej, centrifugáciou pri 150000 x g pri 4 ° C po dobu 1 hodiny. Výsledný supernatant bol zriedený 1: 2,5 s 20% acetonitrilu /0,08% kyseliny trifluóroctovej. Tento materiál bol prijatý v 0,5 ml dávkach cez Superdex Pep 10/30 kolóny (Pharmacia LKB) ekvilibrované s 20% acetonitrilu /0,08% kyseliny trifluóroctovej pri teplote 20 ° C a prietoku 0,1 ml /min. Aktívne frakcie sa spoja, zriedi v pomere 1: 2 s východiskovým pufrom (50 mM sodný-acetátu, pH 4,5) a nanesený na Mono S 5/5 katexovej kolónu (Pharmacia LKB) ekvilibrované s východiskovej pufer. Adsorbovaný proteín bol eluovaný premytí stĺpca rovnakým pufrom (5 ml) a za použitia 0-500 mM NaCl gradientom (15 ml) a konečnom premytí 1 M chloridu sodného pri 10 ° C. Aktívny materiál bol zriedený 1:13 so štartovným pufrom (50 mM sodný-acetátu, pH 7,8) a aplikované znovu mono S HR 5/5 (Pharmacia LKB) ekvilibrované s východiskovej vyrovnávacej pamäte. Kolóna sa promyla rovnakým pufrom (5 ml) a vyvinutý s 15 ml gradientom 0-500 mM NaCl pri 10 ° C. Aktívne frakcie boli spojené a skladované pri -20 ° C. HPLC s reverznou fázou bola vykonávaná na kolóne Aquapore butyl 300 (2,1 x 30 mm, Brownlee Labs) spojené s 130 A separačný systém (Applied Biosystems). Eluovanie bola vykonaná s lineárnym gradientom 0 až 84% acetonitrilu v 0,1% kyseline trifluóroctovej pri teplote 30 ° C v priebehu 45 min. Rýchlosťou 0,2 ml toku min-1 bola použitá, Výtok sa monitoruje absorbancií pri 214 nm. Vrcholové frakcie boli spojené manuálne a okamžite testovaná na aktivitu lyzozýmu pomocou lysoplate techniky [20]. Tricin-SDS elektroforéza bola vykonaná v 13% separačné gély [21].
Antimikrobiálny testy
lytickú aktivitu proti M. luteus
bolo stanovené rozptylom zmeny v suspenzii Micrococcus luteus
(0,25 mg /ml v acetátový pufri) [8]. Vaječný bielok (EW), lyzozým (Sigma) bol použitý ako kontrola. Špecifická aktivita za ug žalúdočné extrakt bol definovaný ako jednotky aktivity 1 ng EWL na M. luteus
, pri pH 5,5. Inhibičný účinok na rast baktérií bol stanovený na živnej pôde a agare lysoplates [20]. Mikroředění citlivosť testu [22], bola použitá pre stanovenie minimálnej inhibičnej koncentrácie. Účinok BGE alebo BG lyzozýmu na rast baktérií bol stanovený v vývar kultúrach, v ktorom rast bol turbidimetria (A600 nm) monitorované.
Muramidasa aktivitu BGE bola testovaná na čistené E. coli
mureínu [23] s cellosyl (Hoechst , Frankfurt am Main, 50 ug /ml) a žalúdočné extrakt (500 ug /ml), sa stanoví pomocou HPLC na produkciu rozpustných muropeptides s nízkou molekulovou hmotnosťou [24]. Kontrolný bez mureínu bol zaradený do behov a dal žiadne piky. V prípade potreby, vyrobené muropeptides boli odoberané jednotlivo na výstupe UV detekcie, vysuší sa vo vákuu, resuspendovaného v MilliQ vode a zbaví solí, ako bolo opísané skôr [23].
Membránu permeabilyzing aktivitu žalúdočných extraktoch bola stanovená fluorimetricaly, podľa oslobodenie karboxyfluorescein ( FS) z kefa na hraniciach membránových vačkov z prasacej črevnej kefa hraníc [25] a odvod difúzny potenciál valinomycin indukované v lipozómoch [26].
vyhlásenie
Autori ďalej len "pôvodné predložený súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na pôvodné autorov predložený súbory obrazov. "Pôvodný súbor pre Obrázok 1 12898_2003_35_MOESM2_ESM.pdf autorského 12898_2003_35_MOESM1_ESM.pdf autorov pôvodného súboru pre obrázok 2 'originálneho súboru pre Obrázok 3 12898_2003_35_MOESM4_ESM.ppt autorského 12898_2003_35_MOESM3_ESM.ppt autorského pôvodného súboru na obrázku 4

• Kvalita života u pacientov s rakovinou žalúdka: prekladom a psychometrického vyhodnotenie iránskej verzia EORTC QLQ-STO22
• Vznik a charakterizácia metastáz modelu ľudského karcinómu žalúdka u nahých mice