Atsparumas nuo suirimo didžiajame skrandyje bakterijų murein galvijų skrandžio lysozyme

rezistencijos nuo suirimo didžiajame skrandyje bakterijų murein galvijų skrandžio lizocimo pervežimas tezės
Background pervežimas lizocimų, fermentų daugiausia susijęs su gynybos nuo bakterinių infekcijų, yra mureinolytic. Atrajotojai keitėsi skrandžio C tipo lizocimą kaip virškinimo fermentų ir pelno iš virškinimo Priekinis žarna bakterijų po dauguma mitybos komponentai, įskaitant baltymų, buvo fermentuojama didžiojo prieskrandžio
. Šiame darbe mes būdingas biologines veiklą galvijų skrandžio sekrecijos prieš membranų, išgrynintas murein ir bakterijų.
Rezultatai
galvijų skrandžio ekstrakto (BGE) buvo aktyvus prieš tiek G + ir G- bakterijų, tačiau poveikis prieš Gram- bakterijų nebuvo dėl lizocimo, nes išgrynintas BGL turėjo tik aktyvumą prieš Gram + bakterijas. Mes negalėjome rasti mažų porų formavimo peptidai į BGE, ir nustatė, kad iš gramneigiamas bakterijas slopinimo BGE lėmė artefakto, kurį sukelia acetato. Mes pranešti, kad pirmą kartą iš galvijų skrandžio lizocimo (BG lizocimo) prieš grynų bakterijų kultūrų veikla ir specifinis atsparumas kai didžiojo prieskrandžio gramteigiamas padermių BGL.
Išvadose
Kai Gram + didžiajame prieskrandyje bakterijų parodė atsparumą Šliužas lizocimą. Mes aptarti šio konstatavimo galimų praktinio pritaikymo tokio stabilaus antimikrobinio peptido šviesos poveikį.
Faktai
lizocimų yra beta N-acetil-muramilo-hidrolizės, kad sutrikdyti bakterinės murein [1]. Dažniausiai gyvūnų lizocimas yra C tipo, pavyzdžiui, vištienos kiaušinių baltos lizocimo (EWL, 14,3 kDa), rastas gyvūnų, vabzdžių ir augalų [2]. Monogastriniams gyvūnai turi vieną genas lizocimo C išreikšta įvairiose [3] audiniuose ir yra manoma, kad visų pirma dalyvauja gynybos nuo bakterinių infekcijų.
Priešingai, atrajotojai turi daug lizocimas genai [4], ir ne mažiau kaip keturis kodas skrandžio lizocimas, kuri veikia kaip virškinimo fermento. Dauguma mitybos komponentai yra fermentuojama didžiajame skrandyje į lakiųjų riebalų rūgščių [5], ir atrajojančių naudą virinant Priekinis žarna bakterijas kaip amino rūgščių šaltinis. Karvė skrandžio lizocimas yra pagrindinis fermentas pritaikytas veikti atšiauriomis skrandžio sąlygomis, optimaliai veiklai žemoje pH (4.5-5.2), mažas joninės jėgos vertybes ir atsparus rūgšties ir pepsino [6, 7]. Mes jau anksčiau pranešė, kad lizocimo įdarbinimas kaip skrandžio virškinimo fermento yra convergently įvyko paukščių Priekinis žarna fermentatoriaus hoacinas [8], taip pat su keliais genas dubliavimo renginių metu savo evoliuciją [9]. Amino rūgščių skirtumai tarp homologinių baltymų iš skirtingų rūšių gali turėti prisitaikanti reikšmę, kaip tai daroma su skrandžio lizocimų. Lizocimų iš karvių ir langūras beždžionių skrandžiai (tiek fermentacijos Priekinis žarna) yra taikomos teigiamos Darvino atrankos [10, 11].
Didžiajame prieskrandyje bakterijų yra svarbus komponentas didžiojo prieskrandžio [5] biomasės ir yra tikėtina, veiksnys daryti evoliuciniu spaudimą skrandžio lizocimo ir kitų skrandžio sekrecijos į žolėdžių su Priekinis žarna fermentacija. Tai paskatino mus sukurti 2 hipotezes: 1 - ten gali būti ir kitų Šliužas peptidai su antimikrobinio aktyvumo, be lizocimo, kuris taip pat veikia prieš gramneigiamas bakterijas; 2 - nuo prieskrandžio bakterijos buvo taikoma atrankiniu slėgio skrandžio antimikrobinių išskyros, didžiojo prieskrandžio bakterijos gali sukūrėme atsparumą šių junginių. Šio darbo tikslas buvo apibūdinti biologiniai veiklą galvijų skrandžio sekrecijos prieš membranų, išgrynintas murein ir bakterijų.
Rezultatai
Karvė Šliužas gleivinė, surinktus 26,4 mg BGE gramui audinio (1,32 g, liofilizuotų ekstrakto iš 100 ml acto ekstraktu nuo 50 g drėgnų gleivinės, SD 0,61, n = 20). Baltymų kiekis ekstraktų buvo 60%, lygus 16 mg baltymo vienam gramui skrandžio audinio. 5 g skrandžio ekstrakto, kad bendras buvo taikoma chromatografija, ir buvo gauti 82,2 mg veikliosios (lizės) baltymų. Tai rodo, kad 1,64% išeiga w /w lizocimo iš neapdirbto ekstrakto, ir 0,43 mg lizocimo vienam gramui audinio.
SDS-PAGE galvijų skrandžio ekstrakto atskleidė svarbų baltymų juosta apie 15 kDa ir kitų dviejų juostos didesnių baltymų (30 ir 45 kDa). Ne denatūravimo elektroforezės parodė baltymų grupę su lizės veiklos dėl M. luteus
-embedded perdangos geliu, matyt skrandžio lizocimo. Lizės M. luteus
pagal skrandžio ekstrakto suspensijos parodyta Fig. 1. Konkreti veikla (M. kazlėkas
) ekstrakto iš viso skrandžio gleivinės buvo 3,40 V (SN 1,48, n = 20), kurio pH 5,5. Specifinis aktyvumas skrandžio ekstrakto sumažėjo 32%, esant pH 6 (2,42 U) ir 42%, kai pH 6,5 (2,04 U). Išgauti specifinis aktyvumas, esant pH 5,5 buvo didesnis negu skrandžio dugno ekstrakto (4,39 U), nei tuo, kad iš antralinėje dalyje ir kūno (2,49 U ir 2,34 U, atitinkamai). 1 pav Bacteriolytic veikla skrandžio ekstrakto prieš M. luteus
. Lizės veikla parodė,% nuo pradinio sklaidos dėl M. luteus pervežimas suspensijos (0,25 mg /ml acetato buferinio tirpalo pH 5.5) apdorotą (parodyta rodykle) su skrandžio ekstraktų visai Šliužas gleivinės (E1, E2, E3 E4 ir E, atitinkantis išgauti koncentracija 42, 133, 233, 417 ir 554 mikrogramų /ml, atitinkamai) ir EWL (5 mikrogramų /ml).
BGE buvo bacteriolytic prieš M. luteus
nuo koncentracijos priklausomu būdu (1 pav). BGE pat nevisavertis Muramidazė E. coli
murein, gaminti kitą anketą tam, kuris grybelio lizocimo cellosyl (2 pav). Muropeptides turi pagrindinę struktūrą, su, susidedančios iš N-acetilgliukozaminilo-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-Glu-gama-MDAP-R1R2, kur R1 ir R2 yra tokie, pakaitai L-karboksi ir D-amino grupių. BGE (500 mikrogramų /ml) pagamintas skirtingus muropeptides į tuos kuriuos cellosyl (50 mikrogramų /ml), įskaitant pikų esant minučių 27 (muropeptide su R1 = D-Ala ir R2 = -H), kuris buvo pagamintas pagal gydymo su cellosyl. Ši viršūnė buvo išplauti ir inkubuojami tiek BGE ir cellosyl. BGE toliau virškinami šį muropeptide (2c pav), o cellosyl nebuvo (2d pav). Tai rodo, skrybėlę skirtingai cellosyl, BGE lizocimas yra L, D Karboksipeptidazė arba Nacetyl muramilo L Ala amidaze veiklą. 2 pav Muramidazė veikla skrandžio ekstrakto Echerichia coli pervežimas išgryninto murein. Muropeptide aprašymą po virškinimo murein su skrandžio ekstrakto (500 mikrogramų /ml, A) arba grybelių Muramidazė cellosyl (50 ug /ml, B). Cellosyl parengė Tetrapeptide ne 27 min, atitinkančios M4 (turintys R1 = D Ala ir R2 = -H). Tai buvo toliau suardomas skrandžio ekstrakto (500 ug /ml, c), bet ne cellosyl (50 ug /ml, d).
BGE buvo aktyvus prieš P. aeruginosa
ir E. coli
, membranos pralaidumu pūslelės ir depoliarizuotą liposomos. Ši veikla buvo tikrinami pavieniais baltymų ir mažus peptidus duoda jokių aktyvių peptidų iš BGE ekstrakto, įskaitant BGL, neaktyvus prieš gramneigiamas bakterijas (1 lentelė). Permeabilizing aktyvumas pasirodė būti dėl acetato panaudojimas skrandžio ekstrakto, nuo BSA resuspenduojamos acto rūgšties ir liofilizuotas turėjo panašaus aktyvumo į BGE. BGL ne slopinti kai kurių gramteigiamas prieskrandžio bakterijų augimą, pavyzdžiui, L. acidophilus
ir S. bovis pervežimas, kurios buvo labai slopinamas EWL, nurodant konkrečią atsparumą prieskrandžio bakterijų murein į BGL (1 lentelė) .table 1 procentas augimo kontrolinių kultūrų bent 6 valandas Gramo + ir Gram- bakterijų auginami EW lizocimo, BG lizocimo ir BGE.
KILMĖ
bakterija

kiaušinio baltymas Lysozyme150 ug /ml
Galvijų Skrandžio Lysozyme150 ug /ml


Galvijų Skrandžio Extract10 mg /ml,



pH 5,5
pH 7,0

pH 5,5
pH 7,0
pH 5,5
pH 7,0
APLINKOS, žarnyno
gramteigiamas
M. luteus

lizuoti 1
lizuoti 1
lizuoti 1
lizuoti 1
lizuoti 1
lizuoti 1
Gram neigiamas
P. aeruginosa

106
173
142
182
0
90
E.coli
103
91
86
124
15
44
PRIESKRANDYJE
gramteigiamas
L. vitulinus

1
4
81
69
10
8
L. acidophilus
0
NG
64
NG
168
NG
S. bovis
101
6
108
114
98
111
gramneigiamų
S. ruminantium
109
112
130
96
89
87
p ruminicola
NG
24
NG
113
NG
208
1
= ląstelės lizuoti gydymo sklaidos tyrimą. Italic Bold numeriai = augimas slopinamas. NG
= ne kultūros augimo šiuo pH.
Diskusijos
Muramidazė veikla rūgšties skrandyje tam Priekinis žarna fermentavimo, gaunančios didelį biomasės bakterijų, leidžia bakterinių ląstelių sienelių virškinimą ir liberalizuoti amino rūgšties -rich ląstelių kiekis. Iš BG lizocimo išvalytų murein veikla skyrėsi nuo kitų c lizocimų turintys mažiau optimalų pH ir L, D Karboksipeptidazė arba Nacetyl muramilo L Ala amidaze veiklą. Tai buvo, kaip ir kiti lizocimų, veikia tik gramteigiamas bakterijas. Kitos sistemos, kaip antai Entamoeba histolytica
, yra žinoma, kad yra lizocimą veikia koncertą su membraniniais permeabilizing peptidų [12], tačiau bando išgryninti aktyvių mažus peptidus iš BGE nepavyko iki šiol.
Buvimas gramneigiamas bakterijas iš didžiojo prieskrandžio neatrodo važinėjęs skrandžio peptidų, galinčių pabloginti jų evoliuciją. Taip būtų apribota sistemos veiksmingumą, nes tik gramteigiamas bakterijas yra linkusios virškinimą ir gramneigiamos bakterijos sudaro didelę dalį prieskrandyje bakterijų biomasės. Be to, kai prieskrandžio gramteigiamas bakterijas, atrodo, sukūrė pasipriešinimą BG lizocimo veiksmų. Didžiojo prieskrandžio bakterijos Streptococcus bovis
gali išsivystyti atsparumas porų formavimo peptidų nizino, pakeičiant mobiliuosius lipoteichoic rūgščių. Įsigijimas Niziną atsparumas taip pat suteikti atsparumą lizocimo [13]. Mažai žinoma apie bakterijų atsparumą vystosi lizocimų iš priimančiosios jie kolonijas, kaip ir didžiajame prieskrandyje bakterijų ir skrandžio galvijų lizocimo atveju. Šis reiškinys gali atspindėti selektyvus poveikis skrandžio fermento didžiojo prieskrandžio bakterijų, nes BGL atsparios bakterijos bus labiau tikėtina, kolonizuoti apatinę žarnas ir jaunus gyvūnus, didžiojo prieskrandžio turinio, nei BGL jautrių padermių.
Naujų antibakterinis paiešką narkotikai privedė ištirti daugiau spekuliacinio metodus sunaikinti ar slopina patogenų mikroorganizmus ir virusus. Tai pagunda optimistiškai prognozuoja, kad labai stabilios peptidai, kad natūraliai vystėsi kaip skrandžio antimikrobinių medžiagų gali turėti didelį potencialą klinikinėje praktikoje. Žmogaus lizocimas (išskiriami monocitų), žaisdami apsauginį vaidmenį nuo infekcijų, mažina superoksido kartos neutrophyls ir padidina limfocitų proliferacijos atsakymą [14-17]. Europos moterų lobistinės organizacijos buvo taikoma nuo bakterinių ir virusinių infekcijų, remiantis jo imuninė stimuliacija ir priešuždegiminių savybių [18].
Atrajotojų BG lizocimų, Ištobulinę labai priešiškoje aplinkoje, pavyzdžiui, skrandžio, sukūrė atsparumą rūgštis ir proteolizę ir gali turėti daug žadančių naudojimo gydant infekcijas, ir maisto pramonėje. Gyvūnų laikymo pramonės, antibiotikų ir hormonų kaip augimą skatinančių medžiagų naudojimas kėlė grėsmę sveikatai žmonėms ir gyvūnams, ir pašarų papildų su kai kuriais augimą skatinančių dabar neteisėtas. Naujų augimo reguliatorių naudojimą, kad nekeltų problemų atsparumas yra prioritetas, ir antimikrobinių peptidų, žinoma, geri kandidatai. Iš tiesų, lizocimas buvo nustatyta, kad toks pat veiksmingas kaip įprastų antibiotikų, skatinant augimą naminių paukščių [19]. Tačiau bakterijų talpos atradimas matyt keisti savo bakterijų murein ir tapti atsparus lizės veiksmų lizocimų, tikrai bus viena susirūpinimą kelianti praktinio pritaikymo, nes turi bakterijų atsparumą antibiotikams.
Išvadas
šis darbas rodo kad skrandžio galvijų lizocimas yra aktyvus prieš gramteigiamas bakterijas, bet kad kai prieskrandžio kamienai neturi įtakos fermento. Galimi praktinio pritaikymo šio antimikrobinio peptido kaip alternatyva antibiotikams gali būti apribota iki bakterijų atsparumo lizės veiksmų lizocimų plėtrai.
Metodai
Skrandžio ekstrakto ir lizocimo valymo
acto rūgšties ekstraktas iš bandos šliužo dislokacijos gleivinės buvo paruoštas kaip aprašyta pagal Dobson et al. [7]. Galvijai skrandžio ekstraktai (BGE) buvo liofilizuoti ir saugomi užšaldyti. BGE baltymai buvo atskirti denatūravimo ir ne-denatūravimo PAGE elektroforezės. Grupė lizės veikla buvo atskleista ant dengiančią agarozės gelyje įterptųjų su M. luteus
. Valymas BG lizocimo buvo atlikta pakartotinai ištirpinant liofilizuoti BGE 10 tūrio. 10% acto rūgšties, centrifugavimo 150,000 × g, esant 4 ° C temperatūroje 1 val. Gautas supernatantas, buvo praskiestas 1: 2,5 su 20% acetonitrilo /0,08% trifluoracto rūgštis. Medžiaga buvo priimtas 0,5 ml partijomis per tam tikrą Superdex Pep 10/30 skiltyje (Pharmacia "LKB), išlyginama 20% acetonitrilo /0,08% trifluoracto rūgštis, esant 20 ° C, o srauto greitis 0,1 ml /min. Aktyvios frakcijos buvo kartu, santykiu 1: 2 su pradinio buferiu (50 mM natrio acetato, pH 4,5) ir pakrauti mono S 5/5 katijonų mainų kolonos (Pharmacia LKB), subalansuotą pradedant buferį. Adsorbuota baltymų eliuojamas plaunant kolonėlę su tuo pačiu buferiniame tirpale (5 ml) ir naudojimo 0-500 mM NaCl gradientu (15 ml) ir galutinį plaunant 1 M NaCl esant 10 ° C temperatūroje. Aktyvus medžiaga buvo skiedžiamas 1:13 su pradinio buferiu (50 mM natrio acetato, pH 7,8) ir vėl kreipėsi į mono S HR 5/5 skiltyje (Pharmacia LKB), subalansuotą pradedant buferį. Stulpelis plautas su tuo pačiu buferiniame tirpale (5 ml) ir sukurtas su 15 ml gradientu 0-500 mM NaCl esant 10 ° C temperatūroje. Aktyvios frakcijos sujungiamos ir laikomi -20 ° C temperatūroje. Atvirkštinių fazių HPLC buvo atliktas ant Akvapor butil 300 kolonėlę (2.1 × 30 mm; Brownlee Labs), susijusiu su 130 Atskyrimo sistema (Applied Biosystems). Eliuavimo buvo padaryta su linijiniu gradientu 0-84% acetonitrilo 0,1% trifluoracto rūgštimi, esant 30 ° C per 45 min. Debitas 0,2 ml min-1, buvo taikomas, nuotekos buvo stebimi 214 nm bangos ilgiui absorbcijos. Didžiausia frakcijos buvo renkami rankiniu būdu ir išbandyti nedelsiant lizocimo veiklos naudojant lysoplate technika [20]. Tricine-SDS elektroforezės buvo atlikta 13% atskyrimo geliai [21].
Antimikrobinių bandymus
lizės aktyvumą prieš M. kazlėkas
nulėmė sklaidos pokyčius iš Micrococcus sustabdymo kazlėkas
(0,25 mg /ml acetatinio buferio) [8]. Kiaušinio baltymas (EW) lizocimas (Sigma) buvo naudojamas kaip kontrolės. Savitasis aktyvumas vienam UG skrandžio ekstrakto buvo apibrėžtas kaip Aktyvumo vienetai 1 ng EWL apie M. luteus
, esant pH 5,5. Slopinamasis poveikis bakterijų augimui buvo nustatytas sultinio ir agaro lysoplates [20]. Mikropraskiedimo jautrumo testavimo [22] buvo siekiama nustatyti minimalius slopinamąjį koncentraciją. Poveikis BGE ar BG lizocimo apie bakterijų augimą lėmė sultinyje kultūroms, kuriose augimas buvo stebimas turbidimetrically (A600 nm).
Muramidazė aktyvumą BGE buvo tiriami nuo išgryninto E. coli
murein [23] su cellosyl (Hoechst , Frankfurt am Main; 50 mikrogramų /ml) ir skrandžio ekstraktas (500 mikrogramų /ml), nustatyti pagal HPLC tirpaus mažos molekulinės masės muropeptides [24] gamybą. Valdymo be murein buvo įtrauktas į trasas ir nepateikė jokių smailių. Kai reikia, pagaminti muropeptides buvo renkami individualiai UV aptikimo lizdo, vakuume džiovintų, resuspenduota MilliQ vandeniu ir demineralizuotas kaip aprašyta anksčiau [23].
Membrana-permeabilyzing veiklą skrandžio ekstraktų lėmė fluorimetricaly, iki karboksifluoresceino išlaisvinimo ( SF) nuo šepetys sienų membranos pūslelių iš kiaulės žarnų teptuku sienos [25] ir išsklaidymo į valinomycin sukeltos difuzijos potencialo liposomų [26].
deklaracijos
Autoriai "originalas pateiktas failai vaizdų
Žemiau nuorodos į autorių originalo pateiktų failų vaizdų. 12898_2003_35_MOESM1_ESM.pdf Autorių originalus failas 1 pav 12898_2003_35_MOESM2_ESM.pdf Autorių originalaus failo 2 pav 12898_2003_35_MOESM3_ESM.ppt Autorių originalios 3 pav 12898_2003_35_MOESM4_ESM.ppt Autorių originalaus failo 4 paveiksle

• Gyvenimo kokybė pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu, vertimas ir psichologinių įvertinimo Irano versija EORTC QLQ-STO22
• Kūrimo ir apibūdinimo iš metastazių modeliu žmogaus skrandžio vėžio nuogas pelėmis