Resistenz vun rumen Bakterien fir Bovine gastric lysozyme murein

Resistenz vun rumen Bakterien murein fir Bovine gastric lysozyme VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Lysozymes, Enzymen meeschtens mat Ofwier géint bakteriell Aids assoziéiert, sinn mureinolytic. Ruminants hunn e gastric c Typ lysozyme als digestive Aktivitéit, a profitéieren Verdauung vun foregut Bakterien Perséinlechkeeten, no stäerkste Nahrungszousaz Voleten, dorënner FAQ, hunn an den rumen VerfÜgung fermentéiert ass. An dëser Aarbecht zeechne mir der biologescher Aktivitéite vun Bovine gastric secretions géint Schläimhait, sidd murein a Bakterien. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Bovine gastric Extrait (BGE) war aktiv géint souwuel G + an G- Bakterien, mä den Effet géint Gram- Bakterien war fir d'lysozyme net duerch, well Dir sidd BGL eenzeg Aktivitéit géint Gramm + Bakterien haten. Mir waren knapp kleng pore administrativ peptides an der BGE ze fannen, an fonnt dass d'inhibition vun Gramm negativ Bakterien duerch BGE wéinst war fir eng artefact vun acetate verursaacht. Mir Rapport fir d'éischt Kéier d 'Aktivitéit vun Bovine gastric lysozyme (BG lysozyme) géint pure bakteriell Kulturen, an der konkreter Resistenz vun e puer rumen Gramm positive analyséieren ze BGL. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung puer Gramm + rumen Bakterien Resistenz zougedréckt lysozyme zu abomasum. Mir diskutéieren d'Konsequenzen vun dësem Gaascht am Liicht vun méiglech praktescher Applicatioun vun esou enger stabiler antimicrobial peptide. VerfÜgung Background VerfÜgung Lysozymes sinn Beta-N-acetyl-muramyl-hydrolase datt bakteriell murein desorganiséieren [1]. De stäerkste gemeinsam Déier lysozyme ass d'c Typ, wéi de Poulet Ee wäiss lysozyme (EWL, 14,3 Kda), am Déier, Insekten a Planzen fonnt [2]. Monogastric Déieren Besëtz vun engem eenheetlechen Gentherapie fir lysozyme c zu verschidde Stoffer ausgedréckt [3] a geduecht ass am Goal géint bakteriell Aids allem Équipe ze ginn. VerfÜgung Am Géigesaz, ruminants hunn Multiple lysozyme Genen [4], an op d'mannst véier Code fir engem gastric lysozyme dat als digestive Aktivitéit Funktiounen. Déi meescht Nahrungszousaz Komponente vun der rumen zu liichtflüchtege fatty Saieren fermentéiert [5], an der ruminant Virdeeler vun foregut Bakterien als Quell vun Aminosaier Saieren verdauen. Cow gastric lysozyme ass eng fundamental Aktivitéit an der onzefridden gastric Konditiounen, mat optimal Aktivitéit um niddereg pH (4.5-5.2), niddereg ionic Kraaft Wäerter ze handelen ugepasst, a resistent Seier an pepsin [6, 7]. Mir hunn am Rapport virdrun, dass de Rekrutement vun lysozyme als gastric digestive Aktivitéit convergently vun der Vullegripp foregut fermenter hoatzin Priedegt huet [8], och mat méi Gene Verdueblung Evenementer während hirer Evolutioun [9]. Aminosaier Differenzen tëscht homologous Proteinen aus verschiddenen Arten hu vläicht Lycée Bedeitung, wéi de Fall mat gastric lysozymes ass. Lysozymes vun der Mamm vu Kéi an langur stëppelt (souwuel mat Fermentatioun an de foregut) ënnerleien positive darwinian Auswiel [10, 11]. Rumen Bakterien vertrieden e wichtege Bestanddeel vun der rumen Biomass [5] an ass e wahrscheinlech Faktor VerfÜgung exerting verännert Drock op gastric lysozyme an aner gastric secretions zu herbivores mat foregut Fermentatioun. Dës Suite eis 2 hypotheses etabléieren: 1 - et kéint aner abomasum peptides gin mat antimicrobial Aktivitéit zu Nieft lysozyme, datt och géint Gramm negativ Bakterien handelen géif; 2 - zënter rumen Bakterien op der selektiv Drock vun gastric antimicrobial secretions Thema gewiescht, kéint rumen Bakterien Resistenz zu deenen awer entwéckelt hunn. D'Zil vun dëser Aarbecht ass d'biologesch Aktivitéite vun Bovine gastric secretions géint Schläimhait, sidd murein a Bakterien ze Markenzeeche. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Cow abomasum mucosa Kriseperiod 26,4 mg BGE pro g vun Otemschwieregkeeten (1.32 g, vun lyophilized Extrait pro 100 ml vun acetic Extrait aus 50 g naass mucosa, Fils 0,61, N = 20). Protein Inhalt vun dovu war 60%, dat si 16 mg FAQ pro Gramm gastric Otemschwieregkeeten. A Ganzen 5 g vun gastric Extrait war Thema ze chromatography, a 82,2 mg vun aktiv (lytic) FAQ kritt huet. Dat entsprécht engem Rendement vun 1,64% w /w vun lysozyme vun der Brutto ofzebauen, an 0,43 mg vun lysozyme pro Gramm Otemschwieregkeeten. VerfÜgung SDS-PAGE vun der Bovine gastric Extrait eng grouss FAQ Band vu ronn 15 Kda réischt an zwee aner Bande vun grouss Proteinen (30 an 45 Kda). Non denaturing electrophoresis zougedréckt d'FAQ Band mat lytic Aktivitéit op M. luteus VerfÜgung -embedded Wiedere fir Fligeren gelies, viraussiichtlech gastric lysozyme. Lysis vun M. luteus VerfÜgung Ophiewe vun der gastric ofzebauen ass an Lalumi gewisen. 1. Spezifësch Aktivitéit (op M. luteus VerfÜgung) vun den Extrait aus dem ganze gastric mucosa war 3,40 U (Fils 1,48, N = 20) an de pH 5.5. Spezifësch Aktivitéit vun der gastric Extrait ofgeholl 32% bei de pH 6 (2.42 U) an 42% bei de pH 6.5 (2.04 U). Extrait spezifesch Aktivitéiten um pH 5.5 war méi héich an den Extrait vun gastric fundus (4.39 U) wéi zu där vun de antrum a Kierper (2.49 U an 2,34 U bzw.). Figur 1 Bacteriolytic Aktivitéit vun gastric Extrait géint M. luteus VerfÜgung. Lytic Aktivitéit als% vun initial Streeung vun engem M. dës luteus VerfÜgung Ophiewe (0,25 mg /l an acetate gefiermt pH 5.5) behandelt mat gastric dovu vum ganze abomasum mucosa (E1, E2, E3, E4 (vun Pfeil uginn) an e, entspriechend Konzentratioune vun 42, 133, 233, 417 an 554 μg /ml, bzw.) an EWL (5 μg /ml) ofzebauen. VerfÜgung BGE war bacteriolytic géint M. luteus VerfÜgung zu enger Konzentratioun-ofhängeg Manéier (Lalumi 1). BGE deforméiert och Muramidase Kolibakterie VerfÜgung murein, eng aner Profil fir dat vun der fungal lysozyme cellosyl (Lalumi 2) produzéiert. Muropeptides hunn eng Struktur aus N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-Glu-ESO-mDap-R1R2, wou R1 an R2 substituents um L-carboxy an D-Héicht Gruppe sinn. BGE (500 μg /ml) produzéiert verschiddene muropeptides zu deene vun cellosyl produzéiert (50 μg /ml), dorënner och d'Feele vun engem Héichpunkt bei Minutt 27 (muropeptide mat R1 = D-Ala an R2 = -H) datt déi Behandlung produzéiert gouf mat cellosyl. Dëst Héichpunkt war mat zwee BGE an cellosyl eluted an incubated. BGE verdaut weider dëst muropeptide (Lalumi 2C) iwwerdeems cellosyl rauszesichen (Lalumi 2D). Dëst deit drophin Hattrick Géigesaatz cellosyl, BGE lysozyme huet L, D carboxypeptidase oder Nacetyl muramyl L-Ala amidase Aktivitéit. Figur 2 Muramidase Aktivitéit vun gastric Extrait op Echerichia belaascht VerfÜgung sidd murein. Muropeptide Profil der Verdauung mat gastric Extrait vun murein (500 μg /ml, e) oder mat der fungal muramidase cellosyl (50 ug /ml, b). Cellosyl produzéiert engem tetrapeptide um 27 min zu M4 entspriechend (R1 no = D-Ala an R2 = -H). Dëst gouf weider vun gastric Extrait verdaut (500 ug /ml, c) awer net vun cellosyl (50 ug /ml, d). VerfÜgung BGE war aktiv géint P. aeruginosa VerfÜgung an Kolibakterie VerfÜgung, permeabilized vesicles an depolarized liposomes. Dës Aktivitéiten waren an isoléiert Proteinen a kleng peptides noginn keng aktiv peptides aus der BGE ofzebauen, dorënner BGL, Aarbechtslosegkeet géint Gramm negativ Bakterien (Table 1) opgefouert. Permeabilizing Aktivitéit bewisen wéinst acetate an der gastric Extrait ze gin, well an acetic Seier resuspended BSA an lyophilized hat ähnlech Aktivitéit zu BGE. BGL net de Wuesstem vun e puer Gramm positive rumen Bakterien inhibit wéi L. acidophilus VerfÜgung an S. BOVIS VerfÜgung, déi héichgradeg vun EWL inhibited waren, beweist spezifesch Resistenz vun de rumen Bakterien murein zu BGL (Table 1) .Table 1 Prozentsaz vum Wuesstem vun Kontroll Kulturen op 6 Stonnen, vun Gramm + an Gram- an der Präsenz vun er lysozyme, ugebaut Bakterien BG lysozyme an BGE. VerfÜgung Urspronk
Bakterie VerfÜgung Ee White Lysozyme150 VerfÜgung ug /ml
Bovine Gastric Lysozyme150 ug /ml VerfÜgung
zu Bovine Gastric Extract10 mg /ml
zu zu zu pH 5.5
pH 7.0 VerfÜgung VerfÜgung pH 5.5
pH 7.0
pH 5.5
pH 7.0
Ëmweltpolitik, INTESTINAL VerfÜgung Gramm positive VerfÜgung M. luteus
1 lysed VerfÜgung 1 lysed VerfÜgung 1 lysed VerfÜgung 1 lysed VerfÜgung 1 lysed VerfÜgung 1 VerfÜgung Gramm negativ VerfÜgung P. aeruginosa lysed
106 VerfÜgung 173 zu 142 zu 182 VerfÜgung 0 VerfÜgung 90 VerfÜgung Kolibakterie
103 VerfÜgung 91 zu 86 VerfÜgung 124 VerfÜgung 15
44 VerfÜgung RUMEN VerfÜgung Gramm positive VerfÜgung L. vitulinus
1 VerfÜgung 4 VerfÜgung 81 zu 69 zu 10 VerfÜgung 8 zu L. acidophilus
0 VerfÜgung NG
64 VerfÜgung NG
168 VerfÜgung NG
S. BOVIS
101 VerfÜgung 6 VerfÜgung 108 zu 114 VerfÜgung 98 VerfÜgung 111
S. negativ Gramm ruminantium
109 zu 112 zu 130 VerfÜgung 96 VerfÜgung 89 zu 87 VerfÜgung P. ruminicola
NG
24 VerfÜgung NG
113 VerfÜgung NG
208 VerfÜgung 1 VerfÜgung = Zellen zu Effekt assay vun Behandlung lysed. Kursiv fett Zuelen = Wuesstem inhibited. NG VerfÜgung = kee Wuesstem vun der Kultur an dëser pH. VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung Muramidase Aktivitéit an der Seier Mo vun engem foregut fermenter, eng bedeitend Biomass vun Bakterien feieren, erlaabt d'Verdauung vun bakteriell Zell Maueren an Liberaliséierung vun Aminosaier Geméis Zell Inhalter. Der Aktivitéit vun BG lysozyme op stilvoller murein war verschidde fir datt vun anere c lysozymes an no ënnen optimal pH an L, D carboxypeptidase oder Nacetyl muramyl L-Ala amidase Aktivitéit. Et war, wéi aner lysozymes, aktiv nëmmen géint Gramm positive Bakterien. Aner Systemer wéi Entamoeba histolytica VerfÜgung, si bekannt lysozyme ze enthalen an concert mat Membran permeabilizing peptides handele [12], mä Versich aktiv kleng peptides aus BGE wesssen Explicatioun, sou wäit. VerfÜgung Präsenz vun Gramm negativ Bakterien am den rumen schéngs net d'Entwécklung vun gastric peptides si vun dauert kapabel Undriff ze hunn. Dëst géif d'Effizienz vun de System Plafong, well nëmmen Gramm positive Bakterien ze unzereegen atomar sinn, an Gramm negativ Bakterien vertrieden eng bedeitend Undeel vun rumen bakteriell Biomass. Doriwwer eraus, wie puer rumen Gramm positive Bakterien Resistenz zu der Aktioun vun BG lysozyme ze hunn entwéckelt. Rumen Bakterie Streptococcus BOVIS VerfÜgung kann Resistenz zu der pore-administrativ peptide nisin entwéckelen, déi Zell verbidden lipoteichoic Saieren. Acquisitioun vun nisin Resistenz conferred och lysozyme Resistenz [13]. Little ass bekannt iwwer Bakterien aus dem Provider se Resistenz zu lysozymes Entwécklungslänner colonize, wéi am Fall vun rumen Bakterien a gastric Bovine lysozyme. De Phänomen kéint de selektiv Drock vun der gastric Aktivitéit spigelen op rumen Bakterien, well BGL-resistent géint Bakterien méi wahrscheinlech ginn déi manner gutt an den rumen vun jonk Déieren, wéi BGL-senisitive analyséieren ze colonize. VerfÜgung der Sich no neien antibacterial Drogen huet der méi spekulativ Approche ze entdecken ze zerstéieren oder pathogen microorganisms an Viren inhibit. Et ass Oflehnung zu optimistically viraus, datt héich stabil peptides datt natierlech als gastric antimicrobials Perséinlechkeeten vläicht fir Medeziner Uwendungen eng héich Potential hun. Mënsch lysozyme (secreted vun monocytes), während engem Schutzpatrounin Roll géint Aids gespillt, depresses superoxide Generatioun vun neutrophyls a verbessert lymphocyte proliferative Äntwert [14-17]. EWL huet géint bakteriell an Haren Aids applizéiert gouf, baséiert op seng immun-Stimulatioun an Anti-demagogesch Eegeschafte [18]. VerfÜgung Ruminant BG lysozymes, an engem ganz feindlech Ëmwelt wéi de Mo. Perséinlechkeeten no, hu Resistenz zu Seier entwéckelt an proteolysis, a vläicht villverspriechend benotzt zu bestéet Aids schätzen, an an de Liewensmëttel Industrie. An der Déier Produktioun geschafft, huet de Gebrauch vun Antibiotiken a liicht wéi Wuesstem Promoteuren zougemaach Gesondheet Gefore fir Mënschen an Déieren, a friesse supplementation mat e puer Wuesstem Promoteuren ass elo illegal. D'Benotzung vun neie Wuesstem Promoteuren, datt et eng Prioritéit net Problemer vun Resistenz verkleeden, an antimicrobial peptides sinn natierlech gutt Kandidaten. Tatsächlech lysozyme gouf doran Wuesstem vu Gefligel [19] esou efficace wéi konventionell Antibiotiken, gin fonnt. der Entdeckung vun der Muecht vu Bakterien awer, bis viraussichtlech seng bakteriell murein änneren an un der lytic Aktioun vun lysozymes resistent ginn, wäert praktesch Uwendungen vun Suerg gin, wéi bakteriell Antibiotike Resistenz huet. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung Dëst Wierk weist datt gastric Bovine lysozyme ass aktiv géint Gramm positive Bakterien mä datt e puer rumen analyséieren sinn duerch d'Aktivitéit onberéiert. Méiglech praktescher Applicatioun vun dësem antimicrobial peptide als eng Alternativ ze versuergen kënnen duerch d'Entwécklung vun bakteriell Resistenz zu der lytic Aktioun vun lysozymes. VerfÜgung Method VerfÜgung Gastric ofzebauen an lysozyme Offäll VerfÜgung Acetic Seier Extrait aus abomasal mucosa limitéiert ginn war bereet als vun Dobson et al beschriwwen. [7]. Bovine gastric dovu (BGE) waren lyophilised an huet gefruer. BGE Proteinen sech duerch denaturing an Net-denaturing PAGE electrophoresis getrennt. Band lytic Aktivitéit war op en doriwwerleiend agarose gelies réischt Ënnerbewosstsinn mat M. luteus VerfÜgung. Offäll vu BG lysozyme war du-dissolving lyophilised BGE zu 10 vol gesuergt. acetic Seier vun 10%, fir 1 h bei 4 ° C bei 150.000 × g centrifuging. Déi doraus resultéierend supernatant, war 1 verdënntem: 2.5 mat 20% acetonitrile /0,08% trifluoroacetic Seier. D'Material war an 0,5 ml Terrainen iwwer eng Superdex Pep 10/30 Kolonne (Pharmacia LKB) equilibrated mat 20% acetonitrile /0,08% trifluoroacetic Seier bei 20 ° C an engem Flux Taux vun 0,1 ml /min batter. Aktiv ufale hinzeginn waren, verdënntem 1: 2 mat ugefaange Prellbock (50 mm Natrium-acetate, pH 4.5) an op enger 5/5, dass-Austausch Kolonne (Pharmacia LKB) equilibrated S Mono iwwerlaascht mat gefiermt Start. Adsorbed FAQ war vun wäschen de Kolonne mat der selwechter Prellbock (5 ml) a vum Gebrauch vun engem 0-500 mm NaCl packt (15 ml) an eng final wäschen vun 1 M NaCl bei 10 ° C eluted. Aktiv Material war 1:13 mat ugefaange Prellbock (50 mm Natrium-acetate, pH 7.8) verdënntem ëmgeseet nees zu engem Mono S HR 5/5 Kolonne (Pharmacia LKB) equilibrated mat ugefaange gefiermt. D'Kolonn war mat der selwechter Prellbock (5 ml) gewäsch an mat engem 15-ml Temperaturgefäll vun 0-500 mm NaCl bei 10 ° C entwéckelt. Aktiv ufale sech hinzeginn a bei -20 ° C gespäichert. Réckgängeg-Phase HPLC war op en Aquapore Butyl 300 Kolonn gesuergt (2,1 × 30 mm; ultra Laboe) verbonne mat enger 130 A Trennung System (Obwuel Biosystems). Elution war iwwer 45 min bei 30 ° C mat engem linear Temperaturgefäll vun 0-84% acetonitrile vun 0,1% trifluoroacetic Seier gemaach. A Flux Taux vun 0,2 ml min-1 applizéiert gouf, war d'effluent vun absorbance bei 214 nm iwwerwaacht. Peak ufale sech manuell a getest direkt fir lysozyme Aktivitéit mat de lysoplate Technik [20] gesammelt. Tricine-SDS electrophoresis war zu 13% Trennung gels standing [21]. VerfÜgung Antimicrobial Tester VerfÜgung Lytic Aktivitéit géint M. luteus VerfÜgung war duerch Streeung Ännerungen zu enger Dispens vun Micrococcus luteus VerfÜgung (0,25 mg alles /ml zu acetate gefiermt) [8]. Ee wäiss (er) lysozyme (Fläch) huet als eng Kontroll benotzt. Spezifësch Aktivitéit pro ug vun gastric Extrait war den Unitéiten vun der Aktivitéit vun 1 NG vun EWL op M. luteus VerfÜgung definéiert, bei pH 5.5. Inhibitory Effekt op bakteriell Wuesstem war op läschen an Agar lysoplates sech [20]. Microdilution waat Test [22] war déi minimal inhibitory Konzentratioune ze bestëmmen. Effet vun BGE oder BG lysozyme op bakteriell Wuesstem war zu Fleeschbritt läschen Kulturen alles an déi war Wuesstem turbidimetrically iwwerwaacht (A600 nm). VerfÜgung Muramidase Aktivitéit vun BGE war assayed op stilvoller Kolibakterie VerfÜgung murein [23] mat cellosyl (Hoechst Frankfurt, am Main; 50 μg /ml) an gastric Extrait (500 μg /ml), déi HPLC Bestëmmung vun der Produktioun vun soluble niddereg molekulare Gewiicht muropeptides [24]. Eng Kontroll ouni murein war an der leeft an huet kee Moundalpen abegraff. Wann néideg, produzéiert muropeptides goufen individuell op der UV erkennen Outlet gesammelt, Vakuum gedréchent, an MilliQ Waasser resuspended an desalted wéi virdru beschriwwen [23]. VerfÜgung Membran-permeabilyzing Aktivitéit vun gastric dovu fluorimetricaly alles war, vun der Liberatioun vu carboxyfluorescein ( CF) aus Biischt Grenz Membran vesicles vum Fierkel intestinal Biischt Grenz [25] an duerch dissipation vun engem valinomycin-entschlof Diffusion Potential vun liposomes [26]. VerfÜgung Deklaratioune VerfÜgung Auteuren 'original deposéiert Fichieren fir Biller VerfÜgung hei sinn d'Linken op der original 'Auteuren deposéiert Fichieren fir Biller. 12898_2003_35_MOESM1_ESM.pdf Auteuren 'original Datei fir Figur 1 12898_2003_35_MOESM2_ESM.pdf Auteuren' original Datei fir Figur 2 12898_2003_35_MOESM3_ESM.ppt Auteuren 'original Datei fir Figur 3 12898_2003_35_MOESM4_ESM.ppt Auteuren' original Datei fir Figur 4

• Liewensqualitéit vun de Patiente mat gastric Kriibs: Iwwersetzung an psychometric Evaluatioun vun der iranescher Versioun vun EORTC QLQ-STO22
• Grënnung an characterization vun engem Metastasen Modell vu mënschlechen gastric Kriibs an Sauna mice