Otpornost Rumen bakterija murein do goveđeg želuca lysozyme

otpor buragu bakterija murein do goveđeg želuca lizozim
apstraktne pregled pozadine
lisozime, enzima uglavnom povezane s obrani od bakterijskih infekcija, su mureinolytic. Preživači su se razvili želuca tipa C lizozima kao probavni enzim, te dobit od probave prednjem crijevu bakterije, nakon što je većina prehrambene komponente, uključujući proteine, su fermentiraju u buragu Netlogu. U ovom radu smo karakteriziraju biološke aktivnosti goveda želučanih izlučevina protiv membrane, pročišćene murein i bakterija. Pregled Rezultati
goveda želučane ekstrakta (BGE) bio je aktivan i protiv G + i G- bakterija, ali je učinak protiv Gram bakterije nije bilo zbog lizozim, jer pročišćeni BGL imao samo djelovanje protiv Gram + bakterija. Nismo uspjeli pronaći peptide koji tvore male pore u BGE, te je utvrdio da je inhibicija Gram-negativne bakterije koje BGE je zbog artefakt uzrokovan acetata. Mi prijaviti za prvi put je aktivnost goveđeg želuca lizozim (BG lizozima) protiv čistih bakterijskih kultura, a specifični otpor nekih burag Gram pozitivnih sojeva na BGL. Pregled zaključaka pregled nekih gram + buragu bakterija pokazala otpornost na sirište lizozima. Mi raspraviti implikacije ovog otkrića u svjetlu mogućih praktične primjene takvog stabilnog antimikrobne peptide. Pregled Pozadina pregled lisozomi su beta-N-acetil-muramil-hidrolaza koje oštećenje bakterijske murein [1]. Najčešći lizozim životinja je tip C, kao što je kokoš bjelanjak lisozim (EWL, 14,3 kDa), koji je nađen u životinja, insekata i biljaka [2]. Nepreživače imaju jedan gen za lizozima c izražena u različitim tkivima [3], a smatra se da je prvenstveno u obrani od bakterijskih infekcija.
Nasuprot tome, preživači imaju više lisozima geni [4], a najmanje četiri kod za želuca lizozim koji funkcionira kao probavni enzim. Većina prehrambene komponente fermentiraju u buragu nepostojanim masnih kiselina [5], a preživača prednosti probavljanje prednjem crijevu bakterije kao izvor aminokiselina. Krava želuca lizozim je osnovni enzim je prilagođen za djelovanje u teškim želučanim uvjetima, uz optimalnu aktivnost pri niskom pH (4.5-5.2), niske ionske jakosti vrijednosti, te otporan na kiselinu i pepsin [6, 7]. Mi smo ranije izvijestili da je zapošljavanje lizozim kao želučani probavni enzim convergently je došlo u ptičje prednjem crijevu fermentora hoacin [8], također s više gena dupliciranje zbivanja tijekom svoje evolucije [9]. Razlike aminokiselina između homolognih proteina iz različitih vrsta mogu imati adaptivna značenje, kao što je slučaj kod želučanih lizozime. Lisozomi od želucima krava i langur majmuna (oba s vrenja u prednjem crijevu) podložni su pozitivnom Darwinovu odabir [10, 11].
Burag bakterije predstavljaju važnu komponentu u buragu biomase [5] te je vjerojatno faktor naprezati evolucijski pritisak na želudac lizozim i drugih želučanih izlučevina u biljojeda s prednjem crijevu fermentacije. To je potaknulo da uspostavi 2 hipoteze: 1 - da bi moglo biti i drugih sirište peptide s antimikrobnim djelovanjem uz lizozim, koji bi također djeluju protiv gram negativnih bakterija; 2 - budući da su Burag bakterije su predmet selektivnog pritiska želuca antimikrobnih sekreta, Rumen bakterije mogle su razvile otpornost na ove spojeve. Cilj ovog rada bio je okarakterizirali biološke aktivnosti goveda želučanih izlučevina protiv membrane, pročišćava murein i bakterija. Pregled Rezultati pregled Krava sirište sluznica dalo 26,4 mg BGE po gramu tkiva (1,32 g, liofilizirane ekstrakta na 100 ml octene izvatka iz 50 g mokre sluznice, sD 0.61, N = 20). Sadržaj proteina u ekstraktu bila je 60%, što je ekvivalentno 16 mg proteina po gramu želučanog tkiva. Ukupno 5 g ekstrakta želučane bio podvrgnut kromatografiji i dobiveno je 82,2 mg aktivnog (litičke) proteina. To predstavlja prinos od 1,64% w /w lizozima iz sirovog ekstrakta i 0.43 mg lizozima po gramu papira. Pregled SDS-PAGE goveđeg želučanog ekstrakta otkrila veliku proteinsku vrpcu od otprilike 15 kDa, a druge dvije vrpce većih proteina (30 i 45 kDa). Non denaturiranje elektroforeze pokazala proteinsku vrpcu s litičke aktivnosti na M. luteus pregled -embedded overlay gela, vjerojatno želuca lizozim. Liza M. luteus
suspenzije želuca ekstrakt je prikazana na slici. 1. Specifična aktivnost (na M. luteus pregled) ekstrakta iz cijelog želučane sluznice bila 3,40 U (SD 1,48, N = 20), pH 5,5. Specifična aktivnost želučane ekstrakta smanjen za 32% na pH 6 (2,42 U) i 42% pri pH 6,5 (2,04 U). Ekstrakt određenu aktivnost pri pH 5,5 bila je veća u ekstraktu želučane fundusa (4,39 U) nego u onom antruma i tijela (2,49 U i 2.34 U, respektivno). Bakteriolitičkom aktivnost Slika 1 želučane ekstrakta protiv M. luteus Netlogu. Litičku aktivnost prikazani kao% od početne raspršivanja M. luteus
suspenzije (0.25 mg /ml u acetatnim puferom pH 5.5) tretira (označen strelicom) sa želučanim ekstrakti cijele sirište sluznice (E1, E2, E3, E4 i E, koja odgovara ekstrakt koncentracije 42, 133, 233, 417 i 554 ug /ml) i EWL (5 ug /ml).
BGE bilo bakteriolitičkom protiv M. luteus
na način ovisan o koncentraciji (Slika 1). BGE također razgrađuju Muramidase E. coli pregled murein, stvarajući drugi profil onoj u gljivica lizozima cellosyl (Slika 2). Muropeptides imaju osnovnu strukturu koja se sastoji od N-acetylglucosaminyl-N-acetilmuramil-L-Ala-D-Glu-gama MDAP-R1R2, gdje su R1 i R2 su supstituenti u L-karboksi i D-amino skupine. BGE (500 ug /ml) nastajala muropeptides onima koje cellosyl (50 ug /ml), uključujući nedostatak maksimumom na minute 27 (muropeptide s R1 = D-Ala i R2 = H), koji je proizveden obradom s cellosyl. Taj vršak je isperu i inkubiraju sa obje BGE i cellosyl. BGE dodatno probavlja ovo muropeptide (slika 2c), dok cellosyl da nisu bile (Slika 2D). To sugerira šešir za razliku cellosyl, BGE lizozim ima L, D karboksipeptidaze ili Nacetyl muramil L-ala amidaze aktivnost. Muramidase aktivnost Slika 2 želučane ekstrakta na Echerichia coli
pročišćene murein. Muropeptide profil nakon digestije murein želučanom ekstrakta (500 ug /ml, a) ili gljivične muramidase cellosyl (50 ug /ml, b). Cellosyl proizveo tetrapeptid na 27 min odgovara M4 (ima R1 = D-Ala i R2 = H). Ova je dalje probavljen s želučanom ekstrakt (500 ug /ml, c), ali ne i po cellosyl (50 ug /ml, d).
BGE je aktivno protiv P. aeruginosa
i E. coli pregled, permeabilizirane vrećica i kopolarizirani liposome. Ove aktivnosti su ispitivana u izoliranim proteinima i male peptide koji daju nema aktivnih peptida iz ekstrakta BGE, uključujući BGL, neaktivni protiv Gram-negativne bakterije (tablica 1). Propusnosti aktivnost pokazala se zbog acetat u želučanoj ekstrakta jer BSA ponovno suspendiran u octenoj kiselini i liofilizirane imali sličnu aktivnost BGE. BGL ne inhibira rast nekih Gram pozitivne bakterije kao što su buraga L. acidophilus
i S. bovis
, koje su jako inhibirati EWL, pokazuje specifični otpor buraga bakterija murein na BGL (Tablica 1) .table 1 Postotak rasta kontrolnih kultura u 6 sati, gram + i Gram- bakterije uzgajaju u prisutnosti EW lizozim, BG lizozim i BGE. pregled PODRIJETLO
bakterija
bjelanjak Lysozyme150 ug /ml
Goveđi želudac Lysozyme150 ug /ml pregled
pregled Goveđi želudac Extract10 mg /ml
pregled pregled pregled, pH 5,5 pregled,
pH 7,0 Netlogu pregled, pH 5,5
pH 7,0
pH 5,5
pH 7,0
OKOLIŠA, crijevnih pregled Gram pozitivni pregled M. luteus
pregled lizira 1 pregled lizira 1 pregled lizira 1 pregled lizira 1 pregled lizira 1 pregled lizira 1
gram negativne pregled P. aeruginosa

106 pregled 173 pregled 142 pregled 182
0 pregled 90 pregled E. coli
103 pregled 91 pregled, 86 pregled 124 pregled 15
44 pregled buragu
gram pozitivnih
L. vitulinus
1 pregled 4 pregled 81
69
10
8
L. acidophilus
0 pregled NG
64 pregled NG
168 pregled NG
S. bovis
101 pregled 6
108 pregled 114 pregled 98 pregled 111 pregled Gram negativni pregled S. ruminantium
109 pregled 112 pregled 130 pregled 96 pregled, 89 pregled, 87 pregled, P. ruminicola
NG
24 pregled NG
113 pregled NG
208
1 pregled = stanice liziraju obradom u raspršenja testa. Kurziv bold brojevi = inhibiran rast. NG pregled = nema rasta kulture na ovom pH. Pregled Rasprava pregled Muramidase aktivnosti u kiselom želucu prednjem crijevu fermentaciju, prima znatnu biomase bakterija, omogućuje probavu bakterijske stanične stijenke i liberalizaciju aminokiseline sadržaj -bogatsvo stanica. Aktivnost BG lizozim na pročišćenog murein bila različita od drugih c lisozime u vlasništvo niže optimalnu pH vrijednost i L, D karboksipeptidaze ili Nacetyl muramil L-ala amidaze aktivnost. Bilo je, kao i ostale lisozomi, aktivni samo protiv Gram pozitivnih bakterija. Ostali sustavi poput Entamoeba histolytica pregled, se zna da sadrži lizozima djeluje u dogovoru s membranom propusnosti peptida [12], ali pokušaji da se očisti aktivne mali peptidi iz BGE nisu uspjeli, tako daleko. Pregled Prisutnost Gram-negativne bakterije u buragu ne čini da su odvezeni evoluciju želučanog peptida koje su ih degradirati. Time bi se ograničila učinkovitost sustava, budući da se samo Gram pozitivne bakterije prikladne su za probavu i Gram negativne bakterije predstavljaju znatan dio buragu bakterijske biomase. Nadalje, neki Burag Gram pozitivne bakterije čini se da su razvile otpornost na djelovanje BG lisozim. Burag bakterija Streptococcus bovis pregled mogu razviti otpornost na peptidni konzervansom oblikovanje pora, modifikacijom stanica lipoteikoičke kiseline. Stjecanje Nisin otpora isto tako pruža otpor lizozima [13]. Malo je poznato o bakterija razvija otpornost na lisozomi od domaćina su kolonizirati, kao u slučaju buragu bakterija i želuca goveda lizozim. Fenomen može odražavati selektivni pritisak želučanog enzima u buragu bakterija, jer će se bakterije BGL-otporne biti više vjerojatno da će kolonizirati donji crijevo i burag mladih životinja, od BGL-osjetljivih sojeva.
Potragu za novim antibioticima droga je dovelo do istražiti više spekulativne pristupe za uništavanje ili inhibiraju patogene mikroorganizme i viruse. To je primamljiva da optimistično predviđaju da će vrlo stabilne peptidi koji se prirodno razvio kao želučanih antimikrobnih može imati visok potencijal za kliničke primjene. Ljudski lizozim (luče monociti), dok je igrao zaštitnu ulogu protiv infekcija, deprimira superoksida od neutrophyls i poboljšava limfocita proliferativni odgovor [14-17]. EWL primijenjen na bakterijske i virusne infekcije, na temelju imuni stimulacije i protuupalna svojstva [18]. Pregled preživača BG lizozime, što se razvili u vrlo neprijateljskom okolišu kao što je želudac, su razvile otpornost na kiseline i protcoliza, a može održati obećavajuće koristi u liječenju infekcija, te u prehrambenoj industriji. U industriji proizvodnje hrane, koristi od antibiotika i hormona kao promotora rasta postavio zdravstvene prijetnje ljudi i životinja, kao i dopunu hrane s nekim promotorima rasta sada je protuzakonito. Korištenje novih promotora rasta koji ne uzrokuju probleme otpora je prioritet, a antimikrobni peptidi su naravno dobri kandidati. Doista, lizozim je nađeno da su učinkoviti kao konvencionalne antibiotici, u promociji rasta peradi [19]. Međutim, otkriće sposobnosti bakterija da se vjerojatno mijenjati svoje bakterija murein i postati otporne na litičke akcije lisozomi, sigurno će biti od važnosti u praktične primjene, kao što je bakterija otpornosti na antibiotike.
Zaključci pregled U radu se pokazuje da želuca goveđeg lizozim djeluje protiv Gram-pozitivnih bakterija, ali da su neki Burag sojevi nepromijenjen enzima. Moguće praktične primjene ovog antimikrobne peptide kao alternativa antibioticima može se ograničiti razvojem rezistencije na litičke akcije lisozomi.
Metode
želučane ekstrakt i pročišćavanje lizozima
octena kiselina izvatka iz abomasal sluznicu pripravljen kao što je opisano u Dobson et al. [7]. Goveda želučani ekstrakti (BGE) su liofilizirani i zamrzne. BGE proteini se odvajaju denaturacije i ne-denaturiranom PAGE elektroforezom. Band litička aktivnost se pokazala na presvlačenje agaroznom gelu ugrađen s M. luteus Netlogu. Pročišćavanje BG lisozim izvedena ponovno otapanje liofiliziranog BGE u 10 vol. 10% octene kiseline, centrifugiranjem na 150.000 × g na 4 ° C tijekom 1 sata. Dobiveni supernatant razrijeđen 1: 2,5 s 20% acetonitrila /0,08% trifluoroctena kiselina. Materijal je usvojen 0,5 ml serijama tijekom Superdex Pep 10/30 kolonu (Pharmacia LKB) te je uravnotežen sa 20% acetonitrila /0,08% trifluoroctene kiseline na 20 ° C i brzina protjecanja od 0,1 ml /min. Aktivne frakcije se prikupe, razrijede 1: 2 sa početnom puferu (50 mM natrijev acetat, pH 4,5), te stavi na mono S 5/5 kationskoizmjenjivački stupac (Pharmacia LKB) uravnotežen s početnim puferom. Adsorbirani protein se ispere ispiranjem stupca s istim puferom (5 ml), a upotrebom mM NaCl gradijentom 0-500 (15 ml) i konačno pranjem u 1 M NaCl pri 10 ° C. Aktivna tvar se razrijedi s 1,13 polaznog puferom (50 mM natrijevog acetata, pH 7.8) i ponovno primijeniti na mono- S HR 5/5 kolonu (Pharmacia LKB) uravnotežen s početnim puferom. Kolona je isprana sa istim puferom (5 ml) i razvija s 15 ml gradijentom 0-500 mM NaCl pri 10 ° C. Aktivne frakcije su sakupljene i pohranjene na -20 ° C. HPLC reverzne faze provedena je na Aquapore butil 300 kolonu (2,1 × 30 mm; Brownlee Labs), koje je povezano s 130 Sustav za odvajanje (Applied Biosystems). Ispiranje se vrši s linearnim gradijentom od 0-84% acetonitrila u 0,1% trifluoroctene kiseline na 30 ° C tijekom 45 min. Brzina protoka 0,2 mL min-1 primijenjena, eluat je praćen apsorbancijom na 214 nm. Pik frakcije se skupe i odmah ručno testiran na lizozima aktivnost korištenjem lysoplate tehnike [20]. Tricin SDS-Elektroforeza je provedena na 13% gelu odvajanje [21].
Testova za antimikrobnu aktivnost
litičke protiv M. luteus pregled je određen raspršenje promjene u suspenziji Micrococcus luteus pregled (0.25 mg /ml u acetatnom puferu) [8]. Bjelanjak (EW) lizozima (Sigma) upotrijebljen je kao kontrola. Specifična aktivnost po ug želučane ekstrakta je definirano kao jedinice aktivnosti 1 ng EWL na M. luteus
, pri pH 5,5. Inhibitorni učinak na rast bakterija utvrđen je na juhu i agar lysoplates [20]. Ispitivanje osjetljivosti mikrodilucije [22] je upotrijebljen za određivanje minimalne inhibitorne koncentracije. Učinak BGE ili BG lizozim na rast bakterija utvrđen je u juhu kulturama u kojima se prati turbidimetrically (A600 nm) rast.
Muramidase aktivnost BGE je ispitivan na pročišćava E. coli pregled murein [23] s cellosyl (Hoechst , Frankfurt am Main, 50 ug /ml) i želuca ekstrakt (500 ug /ml), određivanje pomoću HPLC proizvodnju topljivih muropeptides niskomolekulskih [24]. Kontrolna bez murein je uključena u staze i dao nema maksimume. Kada je potrebno, dobiveni muropeptides prikupljeni su pojedinačno na izlazu UV detekcije, suši u vakuumu, resuspendiran u MilliQ vodi i odsoljen kako je ranije opisano [23]. Pregled membranom permeabilyzing aktivnost želučane ekstraktima određena fluorimetricaly, oslobadanjem karboksifluoresceina ( cf) iz membranskih vezikula graničnim četka od svinjskog crijevna četkice granici [25], a rasipanje difuzijskog potencijala valinomcin induciranog u liposome [26]. pregled Izjave
autora na originalni podnio datoteke za slike
Slijedi linkovi na originalu autora poslanih datoteka za slike. Izvorna datoteka za Slika 1 12898_2003_35_MOESM2_ESM.pdf autorskim 12898_2003_35_MOESM1_ESM.pdf autora izvorne datoteke za sliku 2 12898_2003_35_MOESM3_ESM.ppt autorskim izvorne datoteke na Slici 3 12898_2003_35_MOESM4_ESM.ppt autorskim izvorne datoteke za slike 4

• Kvaliteta života u bolesnika s karcinomom želuca: prijevod i psihometrijskom vrednovanje iranske verzije EORTC QLQ-STO22
• Uspostavljanje i karakterizacija metastaza modela humanog karcinoma želuca u golih miševa