Resistance av vomma bakterier murein til bovin mage lysozyme

motstand av vomma bakterier murein til bovin mage lysozym
Abstract
Bakgrunn
Lysozym, enzymer meste knyttet til forsvar mot bakterielle infeksjoner, er mureinolytic. Drøvtyggere har utviklet seg en mage c typen lysozym som en fordøyelseskanal enzym, og resultat fra fordøyelsen av forutgående bakterier, etter at de fleste kosttilskudd komponenter, inkludert protein, har blitt gjæret i vomma
. I dette arbeidet vi som kjennetegnes av de biologiske aktivitetene til bovine magesaft-sekret mot membraner, renset murein og bakterier.
Resultater
bovin mage-ekstrakt (BGE) var aktiv mot både G + og G- bakterier, men den effekt mot Gram-bakterier var ikke på grunn av lysozym, ettersom renset BGL hadde bare aktivitet mot Gram + bakterier. Vi var i stand til å finne liten poredannende peptider i BGE, og fant at inhiberingen av gram-negative bakterier av BGE skyldes et artefakt som skyldes acetat. Vi rapporterer for første gang aktiviteten til bovin mage lysozym (BG lysozym) mot rene bakteriekulturer, og den spesifikke motstanden i noen vomma Gram-positive stammer til BGL.
Konklusjoner
Noen Gram + vomma bakterier viste motstand mot løpemagen lysozym. Vi diskuterer implikasjonene av dette funnet i lys av mulige praktiske anvendelser av en slik stabil antimikrobielle peptid.
Bakgrunn
Lysozym er beta-N-acetyl-muramyl-hydrolase som forstyrrer bakterie murein [1]. Den vanligste animalsk lysozym c er den type, for eksempel kylling eggehvite lysozym (EAK, 14,3 kDa), som finnes i dyr, insekter og planter [2]. Enmagede dyr har et enkelt gen for lysozym c uttrykt i forskjellige vev [3], og er antatt å være primært involvert i forsvaret mot bakterielle infeksjoner.
I motsetning drøvtyggere har flere lysozym-gener [4], og i det minste fire kode for en mage lysozym som fungerer som en fordøyelseskanal enzym. De fleste diett komponenter er gjæret i vommen til flyktige fettsyrer [5], og de drøvtyggende fordelene ved å spalte forutgående bakterier som en kilde for aminosyrer. Ku gastrisk lysozym er et grunnleggende enzym som er tilpasset til å opptre i de harde gastriske betingelser, med optimal aktivitet ved lav pH (4,5 til 5,2), med lav ionestyrke verdier, og motstandsdyktig mot syre og pepsin [6, 7]. Vi har tidligere rapportert at rekruttering av lysozym som en magefordøyelsesenzym er convergently oppstått i den forutgående avian fermentoren Hoatzin [8], også med flere genduplikasjon hendelser i løpet av sin utvikling [9]. Aminosyre-forskjeller mellom homologe proteiner fra forskjellige arter kan ha adaptiv betydning, slik tilfellet er med gastrisk lysozymer. Lysozym fra magen til kyr og langur apekatter (begge med gjæring i forutgående) er gjenstand for positiv darwinistisk utvalg [10, 11].
Vombakterier representerer en viktig del av vomma biomasse [5] og er en sannsynlig faktor utøve evolusjonært press på mage lysozym og andre mage sekreter i planteetere med forutgående gjæring. Dette fikk oss å etablere 2 hypoteser: 1 - det kan være andre løpemagen peptider med antimikrobiell aktivitet i tillegg til lysozym, som også vil fungere mot gramnegative bakterier; 2 - siden vomma bakterier har vært utsatt for seleksjonspress av mage antimikrobielle sekreter, kanskje Rumen bakterier har utviklet resistens mot disse forbindelsene. Målet med dette arbeidet var å karakterisere de biologiske aktiviteter av storfe mage sekreter mot membraner, renset murein og bakterier.
Resultater
Cow løpemagen slimhinnen overgitt 26,4 mg BGE per gram vev (1,32 g, frysetørket ekstrakt per 100 ml eddiksyre ekstrakt fra 50 g våt slimhinner, sd 0,61, N = 20). Proteininnhold av ekstrakter var 60%, tilsvarende 16 mg protein per gram av gastrisk vev. En total på 5 g av mave ekstrakt ble utsatt for kromatografi, og 82,2 mg av aktiv (lytisk) protein, ble erholdt. Dette representerer et utbytte på 1,64% vekt /vekt av lysozym fra det rå ekstrakt, og 0,43 mg av lysozym per gram vev.
SDS-PAGE av det bovine mage ekstraktet viste et hovedproteinbånd på omtrent 15 kDa og to annen band av større proteiner (30 og 45 KDA). Ikke denaturering elektroforese viste proteinbåndet med lytisk aktivitet på M. luteus
-embedded overlegg gel, antagelig mage lysozym. Lysis av M. luteus
suspensjon av den gastriske ekstrakt er vist i fig. 1. Spesifikk aktivitet (på M. luteus
) av ekstraktet fra hele mageslimhinnen ble 3,40 U (sd-1,48, N = 20) ved pH 5,5. Spesifikk aktivitet av gastrisk ekstraktet ble redusert 32% ved pH 6 (2,42 U) og 42% ved pH 6,5 (2,04 U). Ekstraher spesifikk aktivitet ved pH 5,5 var høyere i den ekstrakt av fundus ventriculi (4,39 U) enn i den av antrum og legemet (2,49 u og 2,34 u, henholdsvis). Figur 1 bacteriolytic aktivitet av mage-ekstrakt mot M. luteus
. Lytisk aktivitet vist som% av initial spredning av en M. luteus
suspensjon (0,25 mg /ml i acetatbuffer pH 5,5) som ble behandlet (angitt med pil) med gastriske ekstrakter av hele abomasum slimhinner (E1, E2, E3, E4 og E, svarende til ekstrahere konsentrasjoner på 42, ​​133, 233, 417 og 554 ug /ml, henholdsvis) og EAK (5 ug /ml).
BGE var bacteriolytic mot M. luteus
på en konsentrasjonsavhengig måte (Figur 1). BGE også degradert muramidase E. coli
murein, produsere en annen profil som i soppens lysozym cellosyl (fig 2). Muropeptides har en grunnstruktur bestående av N-acetylglucosaminyl-N-acetyl-muramyl-L-Ala-D-Glu-gamma-mDap-R1R2, hvor R1 og R2 er substituenter på den L-carboxy og D-aminogrupper. BGE (500 ug /ml) fremstilt forskjellige muropeptides enn dem som produseres av cellosyl (50 ug /ml), inkludert mangel på en topp ved minutt 27 (muropeptide med R1 = D-Ala og R2 = H) som ble fremstilt ved behandling med cellosyl. Denne topp ble eluert og inkubert med både BGE og cellosyl. BGE videre fordøyd dette muropeptide (fig 2c) mens cellosyl ikke (figur 2d). Dette tyder på hatten motsetning cellosyl, har BGE lysozym L, D karboksypepti eller Nacetyl muramyl L-ala amidaseaktiviteten. Figur 2 muramidase aktivitet av mage-ekstrakt på Echerichia coli
renset murein. Muropeptide profilen etter oppslutning av murein med gastrisk ekstrakt (500 ug /ml, en) eller med sopp muramidase cellosyl (50 ug /ml, b). Cellosyl produsert et tetrapeptid på 27 min som tilsvarer M4 (med R1 = D-Ala og R2 = H). Dette ble ytterligere spaltet av mave ekstrakt (500 ug /ml, c), men ikke ved cellosyl (50 pg /ml, d).
BGE var aktiv mot P. aeruginosa
og E. coli
, permeabilisert blemmer og depolariserte liposomer. Disse aktivitetene ble undersøkt i isolerte proteiner og små peptider, hvilket ga ingen aktive peptider fra den BGE ekstrakt, inkludert BGL, inaktive overfor gram-negative bakterier (tabell 1). Permeabilizing aktivitet viste seg å være på grunn av acetat i den gastriske ekstrakt, ettersom BSA resuspendert i eddiksyre og lyofilisert hadde lignende aktivitet til BGE. BGL ikke inhiberer veksten av visse grampositive bakterier rumen slik som L. acidophilus
og S. bovis
, som ble sterkt inhibert av EAK, noe som indikerer spesifikk motstand av rumen bakterier murein til BGL (tabell 1) .table 1 Prosent av vekst av kontrollkulturer ved 6 timer, med Gram + og Gram-bakterier dyrket i nærvær av EW lysozym, BG lysozym og BGE.
ORIGIN
bakterien
Egg Hvit Lysozyme150 ug /ml
Bovine Gastric Lysozyme150 ug /ml


Bovine Gastric Extract10 mg /ml



pH 5,5
pH 7,0

pH 5,5
pH 7,0
pH 5,5
pH 7,0
MILJØ, intestinal
Gram positive
M. luteus <.no> lysert en
lysert en
lysert en
lysert en
lysert en
lysert en
Gram negative
P. aeruginosa

106
173
142
182
0
90
E. coli
103
91
86
124
15
44
vomma
Gram positive
L. vitulinus
en
4
81
69
10
8
L. acidophilus
0
NG
64
NG
168
NG
S. bovis
101
6
108
114
98
111
Gram negative
S. ruminantium
109
112
130
96
89
87
P. ruminicola
NG
24
NG
113
NG
208
1 = celler lysert ved behandling i spredning analysen. Kursiv fet tall = vekst hemmet. NG
= ingen vekst av kultur på denne pH.
Diskusjon
muramidase aktivitet i syre magen av en forutgående fermenter, får en betydelig biomasse av bakterier, gjør at fordøyelsen av bakterielle cellevegger og liberalisering av aminosyren -RICH celleinnholdet. Aktiviteten til BG lysozym på renset murein var annerledes enn andre c lysozym i å ha lavere optimal pH og L, D karboksypepti eller Nacetyl muramyl L-ala amidaseaktiviteten. Det ble, som andre lysozymer, aktive bare mot gram-positive bakterier. Andre systemer som Entamoeba histolytica
, er kjent for å inneholde lysozym opptrer i konsert med membran permeabilizing peptider [12], men forsøk på å rense aktive små peptider fra BGE har sviktet, så langt.
Tilstedeværelse av Gram negative bakterier i vommen synes ikke å ha drevet utviklingen av gastriske peptider i stand til å degradere dem. Dette vil begrense effektiviteten til systemet, siden bare Gram-positive bakterier er mottagelig for fordøyelse, og Gram-negative bakterier utgjør en betydelig andel av vommen bakteriell biomasse. Videre har en del rumen gram-positive bakterier synes å ha utviklet resistens mot virkningen av BG lysozym. Rumen bakterien Streptococcus bovis
kan utvikle resistens mot den pore-dannende peptid nisin, ved å endre celle lipoteichonsyre syrer. Oppkjøp av nisin motstand også konferert lysozym motstand [13]. Lite er kjent om bakterier utvikler resistens mot lysozymer fra verts de kolon, som i tilfelle av rumen bakterier og gastrisk bovint lysozym. Fenomenet kan reflektere seleksjonspress av mage enzymet på Rumen bakterier, siden BGL-resistente bakterier vil være mer sannsynlig å kolonisere lavere tarmen og vomma av unge dyr, enn BGL-sensitive stammer.
Letingen etter nye antibakterielle narkotika har ført til å utforske mer spekulative måter å ødelegge eller hemme patogene mikroorganismer og virus. Det er fristende å optimistisk spår at svært stabile peptider som naturlig utviklet seg som mage antimikrobielle midler kan ha et stort potensial for kliniske applikasjoner. Menneskelig lysozym (skilles ut av monocytter), mens du spiller en beskyttende rolle mot infeksjoner, presser superoksid generasjon neutrophyls og forbedrer lymfocytt proliferativ respons [14-17]. EAK er blitt påført mot bakterielle og virale infeksjoner, basert på dets immun-stimulering og anti-inflammatoriske egenskaper [18] Ruminant BG lysozymer.
, Har utviklet seg i en meget fiendtlig miljø slik som magen, har utviklet resistens mot syre og proteolyse, og kan holde lovende anvendelser i behandling av infeksjoner, og i næringsmiddelindustrien. I dyreproduksjonsindustrien, har bruken av antibiotika og hormoner som vekstfrem poserte helsetrusler for mennesker og dyr, og fôr tilskudd med noen vekst arrangører er nå ulovlig. Bruken av nye vekst arrangører som ikke utgjør problemer med resistens er en prioritet, og antimikrobielle peptider er selvsagt gode kandidater. Faktisk har lysozym blitt funnet å være like effektivt som konvensjonelle antibiotika, for å fremme vekst av fjærkre [19]. Men oppdagelsen av kapasiteten på bakterier å antagelig endre sin bakterie murein og blir resistente mot lytisk handling av lysozym, vil sikkert være av interesse i praktiske anvendelser, som har bakteriell antibiotikaresistens.
Konklusjoner
Dette arbeidet viser at mage storfe lysozym er aktive mot gram-positive bakterier, men at noen vomma stammer er upåvirket av enzymet. Mulige praktiske anvendelser av dette antimikrobielle peptidet som et alternativ til antibiotika kan være begrenset av utvikling av bakteriell resistens til den lytiske virkning av lysozymer.
Methods
Gastrisk ekstrakt og lysozym rensing
Eddiksyre ekstrakt fra abomasal slimhinne var fremstilt som beskrevet av Dobson et al. [7]. Bovine mage ekstrakter (BGE) var frysetørket og holdt frosset. BGE proteiner ble separert ved denaturerende og ikke-denaturerende PAGE elektroforese. Band lytisk aktivitet ble avslørt på en overliggende agarosegel innebygd med M. luteus
. Rensing av BG lysozym ble utført re-oppløsning frysetørret BGE i 10 vol. 10% eddiksyre, sentrifugering ved 150 000 x g ved 4 ° C i 1 time. Den resulterende supernatant ble fortynnet 1: 2,5 med 20% acetonitril /0,08% trifluoreddiksyre. Materialet ble ført i 0,5 ml porsjoner i løpet av en Superdex Pep 10/30-kolonne (Pharmacia LKB) ekvilibrert med 20% acetonitril /0,08% trifluoreddiksyre ved 20 ° C og en strømningshastighet på 0,1 ml /min. Aktive fraksjoner ble slått sammen, fortynnet 1: 2 med utgangsbuffer (50 mM natrium-acetat, pH 4,5) og applisert på en Mono S 5/5 kation-byttekolonne (Pharmacia LKB) ekvilibrert med startbuffer. Adsorberte protein ble eluert ved å vaske kolonnen med den samme buffer (5 ml) og ved anvendelse av en 0-500 mM NaCl-gradient (15 ml) og en avsluttende vask med 1 M NaCl ved 10 ° C. Aktive materiale ble fortynnet 1:13 med utgangsbuffer (50 mM natrium-acetat, pH 7,8) og påført på nytt på en Mono S HR 5/5 kolonne (Pharmacia LKB) ekvilibrert med startbuffer. Kolonnen ble vasket med den samme buffer (5 ml) og utviklet med en 15 ml gradient av 0-500 mM NaCl ved 10 ° C. Aktive fraksjoner ble slått sammen og lagret ved -20 ° C. Reversert-fase HPLC ble utført på en Aquapore Butyl 300 kolonne (2,1 x 30 mm, Brownlee Labs) som er forbundet med en 130 A separasjonssystem (Applied Biosystems). Eluering ble utført med en lineær gradient av 0-84% acetonitril i 0,1% trifluoreddiksyre ved 30 ° C i løpet av 45 min. En strømningshastighet på 0,2 ml min-1 var påført, ble avløpet måles ved absorbans ved 214 nm. Toppfraksjonene ble samlet manuelt og testet umiddelbart for lysozym-aktivitet ved anvendelse av lysoplate teknikk [20]. Tricin-SDS elektroforese ble utført i 13% separasjons geleer [21].
Antimikrobielle tester
Lytisk aktivitet mot M. luteus
ble bestemt ved spredning endringer i en suspensjon av Micrococcus luteus plakater (0,25 mg /ml i acetat-buffer) [8]. Eggehvite (EW) lysozym (Sigma) ble anvendt som en kontroll. Spesifikk aktivitet pr ug av mave ekstrakt ble definert som enheter av aktivitet av 1 ng av EAK på M. luteus
, ved pH 5,5. Hemmende effekt på bakterievekst ble bestemt på buljong og agar lysoplates [20]. Mikrofortynningsplater resistenstesten [22] ble anvendt for å bestemme minimale inhiberende konsentrasjoner. Effekt av BGE eller BG lysozym på bakterievekst ble bestemt i buljong kulturer hvor veksten ble overvåket turbidimetrisk (A600 nm).
Muramidase aktivitet BGE ble analysert på renset E. coli
murein [23] med cellosyl (Hoechst , Frankfurt am Main, 50 ug /ml) og gastrisk ekstrakt (500 ug /ml), å bestemme ved hjelp av HPLC til produksjon av løselige lavmolekylære muropeptides [24]. En kontroll uten murein ble inkludert i går og ga ingen topper. Når det er nødvendig, ble fremstilt muropeptides oppsamlet individuelt ved UV-deteksjon utløp, vakuumtørket, resuspendert i MilliQ vann og avsaltet som tidligere beskrevet [23].
Membran-permeabilyzing aktivitet av mage-ekstraktene ble bestemt fluorimetricaly, ved frigjøringen av karboksyfluorescein ( CF) fra børstegrense membranvesikler fra gris intestinal børste border [25] og ved spredning av en valinomycin-indusert diffusjon potensial i liposomer [26].
Erklæringer
Forfattere 'originale legges filer for Images Nedenfor er koblingene til forfatternes opprinnelige legges filer for bilder. 12898_2003_35_MOESM1_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 1 12898_2003_35_MOESM2_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 2 12898_2003_35_MOESM3_ESM.ppt Forfatteroriginalfilen for figur 3 12898_2003_35_MOESM4_ESM.ppt Forfatteroriginalfilen for figur 4

• Livskvalitet hos pasienter med magekreft: oversettelse og psykometrisk evaluering av den iranske versjonen av EORTC QLQ-STO22
• Etablering og karakterisering av en metastase modell av human magekreft i nakne mus