La resistenza dei batteri del rumine murein ai bovini lysozyme

gastrica resistenza dei batteri del rumine murein ai bovini lisozima gastrica
Abstract
sfondo
lisozimi, enzimi per lo più associata con la difesa contro le infezioni batteriche, sono mureinolytic. I ruminanti si sono evoluti un gastrica tipo c lisozima come un enzima digestivo, e trarre profitto dalla digestione dei batteri foregut, dopo la maggior parte componenti della dieta, tra cui proteine, sono stati fermentato nel rumine
. In questo lavoro si caratterizza le attività biologiche delle secrezioni gastriche bovini contro membrane, murein purificato e batteri.
Risultati
bovino estratto gastrica (DTF) era attivo sia contro G + e batteri G-, ma l'effetto contro i batteri Gram non era dovuto al lisozima, in quanto purificata BGL aveva solo attività contro i batteri Gram +. Non siamo riusciti a trovare pori piccoli che formano i peptidi del BGE, e ha scoperto che l'inibizione di batteri Gram negativi da BGE è stato a causa di un artefatto causato da acetato. Riportiamo per la prima volta l'attività di bovini lisozima gastrica (BG lisozima) contro colture batteriche pure, e la resistenza specifica di alcuni ceppi positivi rumine Gram a conclusioni BGL.
Alcuni batteri Gram + rumine hanno mostrato resistenza alla abomaso lisozima. Discutiamo le implicazioni di questa scoperta alla luce di possibili applicazioni pratiche di un peptide antimicrobico così stabile.
Sfondo
lisozimi sono beta-N-acetil-muramil-idrolasi che inficiano murein batterica [1]. Il lisozima animale più comune è il tipo C, come ad esempio il pollo albume lisozima (EWL, 14.3 kDa), trovato in animali, insetti e piante [2]. monogastrici in possesso di un singolo gene per il lisozima c espresso in vari tessuti [3] ed è pensato per essere principalmente coinvolto nella difesa contro le infezioni batteriche.
Al contrario, i ruminanti hanno più geni lisozima [4], e almeno quattro codice per un lisozima gastrico che funziona come un enzima digestivo. La maggior parte dei componenti della dieta sono fermentati nel rumine di acidi grassi volatili [5], ed i vantaggi ruminanti di digerire batteri foregut come una fonte di aminoacidi. Mucca lisozima gastrico è un enzima essenziale atta ad agire in condizioni gastriche dure, con attività ottimale a pH basso (4,5-5,2), bassi valori di forza ionica, e resistenti agli acidi e pepsina [6, 7]. Abbiamo precedentemente riportato che l'assunzione di lisozima come un enzima digestivo gastrico è convergente verificato nel fermentatore hoatzin foregut aviaria [8], anche con più duplicazione genica durante la sua evoluzione [9]. differenze di amminoacidi tra proteine ​​omologhe di specie diverse possono avere un significato adattativo, come è il caso con lisozimi gastrici. Lisozimi dallo stomaco delle mucche e scimmie langur (entrambe con fermentazione in foregut) sono soggette a selezione positiva darwiniana [10, 11].
Batteri Rumen rappresentano una componente importante della [5] la biomassa ruminale ed è un fattore probabile esercitando una pressione evolutiva sulla lisozima gastrica e altre secrezioni gastriche in erbivori con foregut fermentazione. Ciò ha indotto a stabilire 2 ipotesi: 1 - ci potrebbero essere altri peptidi ad attività antimicrobica abomaso oltre a lisozima, che sarebbe anche agire contro batteri Gram negativi; 2 - dal momento che i batteri del rumine sono stati sottoposti alla pressione selettiva delle secrezioni gastriche antimicrobici, i batteri del rumine potrebbero hanno sviluppato una resistenza a questi composti. L'obiettivo di questo lavoro è stato quello di caratterizzare le attività biologiche delle secrezioni gastriche bovini contro membrane, murein purificata e batteri.
Risultati
mucosa mucca abomaso ceduti 26,4 mg DTF per g di tessuto (1,32 g, di estratto liofilizzato per 100 ml di estratto acetico da 50 g mucosa bagnato, sd 0.61, N = 20). Il contenuto proteico di estratti è stata del 60%, equivalenti a 16 mg di proteina per grammo di tessuto gastrico. Un totale di 5 g di estratto gastrica è stato oggetto di cromatografia, e 82,2 mg di proteina attiva (litico) sono stati ottenuti. Questo rappresenta un rendimento del 1,64% w /w di lisozima dall'estratto grezzo e 0,43 mg di lisozima per grammo di tessuto.
SDS-PAGE dell'estratto gastrica bovina rivelato un importante banda proteica di circa 15 Kda e due altri bande di proteine ​​più grandi (30 e 45 kDa). elettroforesi non denaturazione ha mostrato la band proteina con attività litica su M. luteus
gel sovrapposizione -Embedded, presumibilmente lisozima gastrica. Lisi di M. luteus
sospensione dall'estratto gastrica è mostrato in Fig. 1. Attività specifiche (su M. luteus
) dell'estratto da tutta mucosa gastrica era 3,40 U (sd 1,48, N = 20) a pH 5,5. Attività specifiche dell'estratto gastrica è diminuita del 32% a pH 6 (2.42 U) e il 42% a pH 6,5 (2,04 U). Estrarre specifica attività a pH 5,5 è stata maggiore nel l'estratto di fondo gastrico (4.39 U) rispetto a quella del antro e corpo (2,49 U e 2,34 U, rispettivamente). Figura 1 attività Bacteriolytic di estratto gastrica contro M. luteus
. attività litica indicato come% di dispersione iniziale di un M. luteus
sospensione (0,25 mg /ml in tampone acetato pH 5,5) trattati (indicato dalla freccia) con estratti gastrici di tutto mucosa abomasum (E1, E2, E3, E4 e e, corrispondente per estrarre le concentrazioni di 42, 133, 233, 417 e 554 mcg /ml, rispettivamente) e EWL (5 mg /ml).
BGE era bacteriolytic contro M. luteus
in modo concentrazione-dipendente (Fig. 1). BGE anche degradato Muramidasi E. coli
murein, producendo un profilo diverso da quello del cellosyl lisozima fungine (Figura 2). Muropeptides hanno una struttura di base costituita da N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-Glu-gamma-MDAP-R1R2, in cui R1 e R2 sono sostituenti al L-carbossilico e gruppi D-amminoacidi. BGE (500 mcg /ml) ha prodotto diverse muropeptides a quelli prodotti da cellosyl (50 ug /ml), tra cui la mancanza di un picco a 27 minuti (muropeptide con R1 = D-Ala e R2 = H) che è stato prodotto mediante trattamento con cellosyl. Questo picco è stato eluito e incubato con entrambi BGE e cellosyl. BGE digerito ulteriormente questo muropeptide (Fig 2c) mentre cellosyl NON HA (Fig 2d). Questo suggerisce cappello a differenza cellosyl, BGE lisozima ha L, D o carbossipeptidasi Nacetyl muramil attività L-ala amidasi. Figura 2 attività Muramidasi di estratto gastrica su Echerichia coli
murein purificata. profilo Muropeptide dopo digestione del murein con estratto gastrica (500 ug /ml, a) o con il cellosyl Muramidasi fungina (50 ug /ml, b). Cellosyl prodotto un tetrapeptide a 27 min corrispondente alla M4 (con R1 = D-Ala e R2 = H). Ciò è stato ulteriormente digerito dal estratto gastrica (500 ug /ml, c), ma non dalla cellosyl (50 ug /ml, d).
BGE era attivo contro P. aeruginosa Comprare e E. coli
, permeabilizzate vescicole e liposomi depolarizzati. Queste attività sono stati proiettati in proteine ​​isolate e piccoli peptidi che producono nessun peptidi attivi dall'estratto BGE, tra BGL, inattivo contro i batteri Gram negativi (Tabella 1). Permeabilizzante attività è risultata essere dovuto ad acetato nell'estratto gastrica, poiché BSA risospese in acido acetico e liofilizzate aveva un'attività simile a BGE. BGL non inibisce la crescita di alcuni batteri Gram-positivi, come rumine L. acidophilus
e S. bovis
, che sono stati fortemente inibita da EWL, indicando resistenza specifica dei batteri del rumine murein a BGL (Tabella 1) .table 1 Percentuale di crescita delle colture di controllo a 6 ore, di Gram + e Gram- cresciuti in presenza di EW lisozima, BG lisozima e BGE.
ORIGINE
BATTERI
bianco d'uovo Lysozyme150 ug /ml
bovina gastrico Lysozyme150 ug /ml


bovina gastrico Extract10 mg /ml



pH 5,5
pH 7,0

pH 5,5
pH 7,0
pH 5,5
pH 7,0
AMBIENTALE, INTESTINALE
Gram positivi
M. luteus
lisati 1
lisati 1
lisati 1
lisati 1
lisati 1
lisati 1
Gram negativi
P. aeruginosa
Il 106
173
142
182
0
90
E. coli
103
91
86
124
15
44
RUMEN
Gram positivi
L. vitulinus
1 4
81
69 10
8
L. acidophilus
0
NG
64
NG
168
NG
S. bovis
101 Pagina 6
108
114
98
111
Gram negativo zona S. ruminantium
109
112
130
96
89
87
P. ruminicola
NG
24
NG
113
NG
208
1 = cellule lisate dal trattamento in dispersione dosaggio. Corsivo grassetto = crescita inibita. NG
= nessuna crescita della cultura a questo pH
. Attività Discussione
Muramidasi nello stomaco acido di un fermentatore foregut, ricevendo un notevole biomassa di batteri, permette la digestione delle pareti delle cellule batteriche e la liberalizzazione di amminoacido ricchi di contenuto della cella. L'attività di BG lisozima sulla murein purificata era diversa da quella degli altri lisozimi c nell'avere pH inferiore ottimale e L, D o carbossipeptidasi Nacetyl muramil attività L-ala amidasica. E 'stato, come altri lisozimi, attivi solo contro i batteri Gram-positivi. Altri sistemi, come Entamoeba histolytica
, sono noti per contenere il lisozima che agiscono di concerto con i peptidi della membrana permeabilizzante [12], ma i tentativi di purificare piccoli peptidi attivi da BGE non sono riusciti, finora
. La presenza di batteri Gram negativi in rumine non sembra aver guidato l'evoluzione di peptidi gastrici capace di degradare. Ciò limiterebbe l'efficienza del sistema, poiché solo batteri Gram positivi sono suscettibili di digestione e batteri Gram negativi rappresentano una parte considerevole della biomassa batterica ruminale. Inoltre, alcuni batteri Gram positivi ruminale sembrano aver sviluppato resistenza all'azione di BG lisozima. bovis Rumen batterio Streptococcus
possono sviluppare resistenza al peptide nisina pore-forming, modificando acidi lipoteichoic cellulari. Acquisizione di resistenza nisina anche conferito resistenza lisozima [13]. Si sa poco batteri sviluppare resistenza al lisozimi dall'host colonizzano, come nel caso di batteri del rumine e lisozima bovini gastrica. Il fenomeno potrebbe riflettere la pressione selettiva dell'enzima gastrico sui batteri del rumine, poiché i batteri BGL-resistenti saranno più propensi a colonizzare l'intestino inferiore e il rumine degli animali giovani, rispetto ai ceppi BGL-sensibili.
La ricerca di nuovi antibatterici farmaci ha portato ad esplorare approcci più speculativi di distruggere o inibire microrganismi patogeni e virus. Si è tentati di prevedere con ottimismo che i peptidi altamente stabili che naturalmente si è evoluto come antimicrobici gastrici possono avere un alto potenziale di applicazioni cliniche. lisozima umano (secreto dalle monociti), durante la riproduzione di un ruolo protettivo contro le infezioni, deprime la generazione superossido di neutrofili e linfociti aumenta la risposta proliferativa [14-17]. EWL è stato applicato contro le infezioni batteriche e virali, sulla base della sua proprietà anti-infiammatorie immuno-stimolazione e [18].
Lisozimi Ruminant BG, essendosi evoluti in un ambiente molto ostile come lo stomaco, hanno sviluppato una resistenza agli acidi e proteolisi, e può tenere usi promettenti nel trattamento delle infezioni, e nell'industria alimentare. Nel settore della produzione animale, gli usi di antibiotici e ormoni come promotori della crescita ha posto minacce per la salute per gli esseri umani e gli animali, e la supplementazione di alimentazione con alcuni promotori della crescita è ora illegale. L'utilizzo di nuovi fattori di crescita che non pongono problemi di resistenza è una priorità, e peptidi antimicrobici sono naturalmente buoni candidati. Infatti, lisozima è stato trovato per essere efficace come antibiotici convenzionali, nel promuovere la crescita di pollame [19]. Tuttavia, la scoperta della capacità dei batteri di modificare presumibilmente la sua murein batterica e diventare resistente all'azione litica di lisozimi, sarà sicuramente di preoccupazione nelle applicazioni pratiche, come ha batterica resistenza agli antibiotici.
Conclusioni
Questo lavoro mostra che il lisozima bovina gastrico è attiva contro i batteri Gram-positivi, ma che alcuni ceppi del rumine sono influenzati dall'enzima. Le possibili applicazioni pratiche di questo peptide antimicrobico come alternativa agli antibiotici può essere limitata dallo sviluppo di resistenza batterica all'azione litica di lisozimi.
Metodi
estratto gastrica e purificazione lisozima
acetico estratto acido da mucosa abomasale era preparato come descritto da Dobson et al. [7]. Bovino estratti gastrici (DTF) erano liofilizzata e mantenuti congelati. proteine ​​BGE erano separati da denaturazione e non denaturazione PAGE elettroforesi. attività litica Banda è stato rivelato su un gel sovrapposizione embedded con M. luteus
. Purificazione di BG lisozima è stata eseguita ri-dissoluzione BGE liofilizzata in 10 vol. di acido acetico al 10%, centrifugazione a 150.000 xg a 4 ° C per 1 h. Il supernatante risultante, è stato diluito 1: acido trifluoroacetico 2,5 con 20% acetonitrile /0,08%. Il materiale è stato passato in 0,5 ml lotti sopra una colonna di 10/30 Superdex Pep (Pharmacia LKB) equilibrata con 20% acetonitrile /0,08% di acido trifluoroacetico a 20 ° C e una portata di 0,1 ml /min. Le frazioni attive sono state riunite, diluito 1: 2 con tampone di partenza (50 mM di sodio acetato, pH 4.5) e caricato su una colonna Mono S 5/5 scambio cationico (Pharmacia LKB) equilibrata con iniziare buffer. proteine ​​adsorbito è stato eluito lavando la colonna con lo stesso tampone (5 ml) e mediante l'uso di un gradiente di NaCl 0-500 mM (15 ml) ed un lavaggio finale di 1 M NaCl a 10 ° C. materiale attivo è stato diluito 1:13 con tampone di partenza (50 mM di sodio acetato, pH 7,8) e applicato nuovamente un Mono S HR 5/5 colonna (Pharmacia LKB) equilibrata con iniziare buffer. La colonna è stata lavata con lo stesso tampone (5 ml) e sviluppata con un gradiente di 15 ml di 0-500 mM NaCl a 10 ° C. Le frazioni attive sono state riunite e conservati a -20 ° C. HPLC in fase inversa è stata eseguita su una colonna di 300 Aquapore butile (2,1 × 30 mm; Brownlee Labs) collegato con un sistema di separazione 130 A (Applied Biosystems). L'eluizione è stata effettuata con un gradiente lineare di 0-84% di acetonitrile in acido trifluoroacetico 0,1% a 30 ° C per 45 min. Una portata di 0,2 ml min-1 è stato applicato, l'effluente è stato monitorato mediante assorbimento a 214 nm. frazioni di picco sono stati raccolti manualmente e testati immediatamente per l'attività lisozima utilizzando la tecnica lysoplate [20]. Tricine-SDS elettroforesi è stata eseguita in 13% gel di separazione [21].
Test antimicrobici
attività litica contro M. luteus
è stata determinata dalla dispersione cambiamenti in una sospensione di Micrococcus luteus
(0,25 mg /ml in tampone acetato) [8]. L'albume (EW) lisozima (Sigma) è stato utilizzato come controllo. Attività specifica per ug di estratto gastrica è stata definita come unità di attività di 1 ng di EWL su M. luteus
, a pH 5,5. effetto inibitorio sulla crescita batterica è stato determinato in brodo e lysoplates agar [20]. Test microdiluizione sensibilità [22] è stata utilizzata per determinare le concentrazioni minime inibenti. Effetto della BGE o BG lisozima sulla crescita batterica è stata determinata in brodo di coltura in cui la crescita è stata monitorata turbidimetricamente (A600 nm).
Attività Muramidasi di BGE è stato analizzato su purificato E. coli
murein [23] con cellosyl (Hoechst , Francoforte, 50 ug /ml) ed estratto gastrica (500 mcg /ml), la determinazione mediante HPLC produzione di muropeptides solubili a basso peso molecolare [24]. Un controllo senza murein è stato incluso nelle corse e non ha dato i picchi. In caso di necessità, prodotti muropeptides sono stati raccolti singolarmente all'uscita rivelazione UV, vuoto secca, risospeso in acqua MilliQ e dissalati come descritto in precedenza [23]
. Membrana permeabilyzing attività degli estratti gastrici è stato determinato fluorimetricaly, con la liberazione di carbossifluoresceina ( CF) da vescicole di membrana pennello di confine di spazzola intestinale maiale confine [25] e la dissipazione di un potenziale di diffusione valinomicina indotta in liposomi [26].
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