Resistanssi pötsin bakteerien mureiinin naudan mahalaukun lysotsyymin

Resistanssi pötsin bakteerien mureiinin naudan mahalaukun lysotsyymin
tiivistelmä
tausta
Lysotsyymit, entsyymit liittyivät lähinnä suojaa bakteeri-infektioita, ovat mureinolytic. Märehtijät ovat kehittäneet mahalaukun c tyyppi lysotsyymiä, ruoansulatuskanavasta entsyymi, ja hyötyä ruoansulatus foregut bakteereja, kun suurin osa ravinnon komponentteja, kuten proteiini, on fermentoitu pötsissä
. Tässä työssä ominaista biologisista vaikutuksista naudan mahahapon eritystä vastaan ​​kalvoja, puhdistettua mureiini- ja bakteerit.
Tulokset
Naudan mahalaukun uute (BGE) oli tehoavat sekä G + ja G- bakteerit, mutta vaikutus vastaan ​​Gram bakteereita ei johtunut lysotsyymiä, koska puhdistettua BGL oli vain Gram + bakteereita. Emme löytäneet pieniä huokosia muodostavaa peptidien BGE, ja totesi, että esto Gram negatiivisten bakteerien BGE johtui artefaktin aiheuttama asetaatti. Raportoimme ensimmäistä kertaa aktiivisuus naudan mahalaukun lysotsyymiä (BG lysotsyymi) vastaan ​​puhtaat bakteeriviljelmät, ja ominaisvastus joidenkin pötsin grampositiiviset kantoja BGL.
Johtopäätökset
Jotkut Gram + pötsin bakteerit osoitti vastustuskykyä juoksutusmahassa lysotsyymiä. Keskustelemme vaikutuksia tämän havainnon valossa mahdollisia käytännön sovelluksia tällaisen stabiilin antimikrobisen peptidin.
Taustaa
Lysotsyymit ovat beeta-N-asetyylimuramyyli-hydrolaasi, jotka häiritsevät bakteerien mureiini- [1]. Yleisin eläin lysotsyymi on c tyyppiä, kuten kananmunan lysotsyymi (EWL, 14,3 kDa), todettu eläinten, hyönteisten ja kasvien [2]. Yksimahaisille hallussaan yhden geenin Lysotsyymiä c ilmaistu erilaisissa kudoksissa [3], ja sen ajatellaan olevan osallistuu pääasiassa suojaa bakteeri-infektioita.
Sen sijaan märehtijät on useita lysotsyymi geenit [4], ja ainakin neljä koodi maha- lysotsyymiä, joka toimii ruoansulatus entsyymi. Useimmat ravinnon komponentteja fermentoidaan pötsissä ja haihtuvien rasvahappojen [5], ja märehtijöiden edut sulattamaan foregut bakteerien lähteenä aminohappoja. Lehmä mahalaukun lysotsyymiä on perus entsyymi sovitettu toimimaan ankarissa mahalaukun olosuhteissa, optimaalinen aktiivisuus matalassa pH: ssa (4,5-5,2), alhainen ionivahvuus arvoja, ja hapon- ja pepsiini [6, 7]. Olemme aiemmin raportoitu, että rekrytointi Lysotsyymin kuin mahalaukun ruoansulatus entsyymi on konvergoivasti tapahtunut linnun foregut fermentori Hoatsin [8], myös useita geenikahdennustapahtuman tapahtumia sen kehityksen aikana [9]. Aminohapon erot homologisia proteiineja eri lajeista voi olla mukautuva merkitystä, kuten on asianlaita mahalaukun lysotsyymin. Lysotsyymit päässä vatsat lehmien ja langur apinoilla (molemmissa käymisen foregut) ovat positiivisiin Darwinian valinta [10, 11].
Rumen bakteerit ovat tärkeä osa pötsin biomassan [5] ja on todennäköinen tekijä kohdistaen evoluution painetta mahalaukun lysotsyymiä ja muita mahalaukun eritteiden kasvinsyöjiä kanssa foregut käyminen. Tämä sai meidät luomaan 2 hypoteeseja: 1 - siellä saattaa olla muita juoksutusmahaa peptidejä kanssa antimikrobisen aktiivisuuden lisäksi lysotsyymi, jotka toimivat myös Gram-negatiivisia bakteereita; 2 - koska pötsin bakteerit ovat kuuluneet selektiivisen paineen mahalaukun mikrobilääkkeiden eritteiden, pötsin bakteerit saattavat ovat kehittäneet resistenssin näille yhdisteille. Tavoitteena tätä työtä oli kuvata biologista aktiivisuutta naudan mahahapon eritystä vastaan ​​kalvoja, puhdistettua mureiini- ja bakteerit.
Tulokset
lehmä juoksutusmahaa limakalvon tuotti 26,4 mg BGE per g kudosta (1,32 g, lyofilisoitua uutetta 100 ml etikkahapon ote 50 g märkää limakalvon, sd 0,61, N = 20). Valkuaispitoisuus uutteiden oli 60%, mikä vastaa 16 mg proteiinia per gramma mahalaukun kudosta. Kaikkiaan 5 g mahalaukun uute kohteena kromatografialla, ja 82,2 mg aktiivista (lyyttisen) proteiini saatiin. Tämä merkitsee saanto 1,64% paino /paino lysotsyymin raakauutteesta, ja 0,43 mg lysotsyymiä per gramma kudosta.
SDS-PAGE naudan mahalaukun uutteesta paljasti Suurempi proteiini on noin 15 kDa ja kaksi muuta bändit isompi proteiineja (30 ja 45 kDa). Non denaturoinnin elektroforeesi osoitti proteiinin bändi lyyttinen aktiivisuus M. luteus
-Embedded overlay geeli, oletettavasti mahalaukun lysotsyymi. Lyysi M. luteus
suspension mahalaukun uutteesta on esitetty kuviossa. 1. spesifinen aktiivisuus (päällä M. luteus
) on ote koko mahalaukun limakalvon oli 3,40 U (sd 1,48, N = 20) pH: ssa 5,5. Spesifinen aktiivisuus mahalaukun uutteesta laski 32% pH: ssa 6 (2,42 U) ja 42% pH: ssa 6,5 ​​(2,04 U). Pura spesifinen aktiivisuus pH: ssa 5,5 oli suurempi ote mahalaukun silmänpohjan (4,39 U) kuin että antrum ja runko (2,49 U ja 2,34 U, tässä järjestyksessä). Kuva 1 bakteriolyyttinen aktiivisuus mahan otteen M. luteus
. Lyyttisen aktiivisuuden esitetty% alkuperäisestä sironnan M. luteus
suspensioon (0,25 mg /ml asetaattipuskuria, pH 5,5) käsiteltiin (osoitettu nuolella), jossa mahalaukun uutteista koko juoksutusmahaan limakalvon (E1, E2, E3, E4 ja E, joka vastaa poimia pitoisuuksia 42, 133, 233, 417 ja 554 ug /ml, vastaavasti) ja EWL (5 ug /ml).
BGE oli bakteriolyyttinen vastaan ​​M. luteus
pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 1). BGE myös hajoavat Muramidase E. coli
mureiini, tuottaa erilaisen profiilin kuin sieni lysotsyymin cellosyl (kuvio 2). Muropeptides on perusrakenne, joka koostuu N-asetyyli- N-asetyylimuramyyli-L-Ala-D-Glu-gamma-MDAP-R1R2, jossa R1 ja R2 ovat substituentteja L-karboksi ja D-aminoryhmät. BGE (500 ug /ml) on tuotettu eri muropeptides kuin tuotettu cellosyl (50 ug /ml), mukaan lukien ei ole huipussaan minuutin 27 (muropeptide R1 = D-Ala ja R2 = H), joka on valmistettu käsittelemällä kanssa cellosyl. Tämä huippu eluoitiin ja inkuboitiin sekä BGE ja cellosyl. BGE hajotettiin edelleen tämän muropeptide (kuvio 2c), kun taas cellosyl ei (kuvio 2d). Tämä viittaa siihen, hattu toisin cellosyl, BGE lysotsyymi on L, D karboksipeptidaasi tai Nacetyl muramyy- L-ala amidaasiaktiivisuus. Kuva 2 Muramidase aktiivisuus mahan uutteen Escherichia coli
puhdistettu mureiini-. Muropeptide profiili pilkkomisen jälkeen mureiinin mahalaukun uutteesta (500 ug /ml, a) tai sieni-muramidase cellosyl (50 ug /ml, b). Cellosyl tuotti tetrapeptide 27 min vastaa M4 (joilla R1 = D-Ala ja R2 = H). Tämä digestoitiin edelleen mahalaukun uutteesta (500 ug /ml, c) mutta ei cellosyl (50 ug /ml, d).
BGE oli aktiivinen P. aeruginosa
ja E. coli
, läpäiseviksi rakkulat ja depolarisoituneiden liposomeja. Nämä toimet seulottiin yksittäisiä proteiineja ja pieniä peptidejä tuottavat ole aktiivisia peptidejä BGE uutteesta, kuten BGL, aktiivinen Gram-negatiivisia bakteereja (taulukko 1). Läpäisevyyttä aktiivisuus osoittautui takia asetaatiksi mahalaukun uutteesta, koska BSA resuspendoitiin etikkahappoa ja kylmäkuivattiin oli samanlainen aktiivisuus kuin BGE. BGL ei estä kasvua joidenkin gram-positiiviset pötsin bakteerit, kuten L. acidophilus
ja S. bovis
, jotka olivat erittäin inhiboi EWL, mikä osoittaa, ominaisvastus pötsin bakteerien mureiinin BGL (taulukko 1) .table 1 Prosenttiosuus kasvun kontrolliviljelmien 6 tuntia, Gram + ja Gram bakteerit kasvatettiin läsnäollessa EW lysotsyymiä, BG lysotsyymi ja BGE.
ORIGIN
bakteeri
munanvalkuainen Lysozyme150 ug /ml
Naudan Mahan Lysozyme150 ug /ml


Naudan Mahan Extract10 mg /ml



pH 5,5
pH 7,0

pH 5,5
pH 7,0
pH 5,5
pH 7,0
ENVIRONMENTAL, Suolen
grampositiiviset
M. luteus

hajotettiin 1
hajotettiin 1
hajotettiin 1
hajotettiin 1
hajotettiin 1
hajotettiin 1
gramnegatiiviset
P. aeruginosa

106
173
142
182
0
90
E. coli
103
91
86
124
15
44
pötsin
grampositiiviset
L. vitulinus
1
4
81
69
10
8
L. acidophilus
0
NG
64
NG
168
NG
S. bovis
101
6
108
114
98
111
gramnegatiiviset
S. ruminantium
109
112
130
96
89
87
P. ruminicola
NG
24
NG
113
NG
208
1
= solut hajotettiin käsittelemällä sironta määrityksessä. Kursivoitu lihavoitu numeroita = kasvu estyy. NG
= ei kasvua kulttuurin tässä pH.
Keskustelu
Muramidase toimintaa happo vatsaan foregut fermentoriin, jotka saavat huomattavan biomassaa bakteerien sallii ruoansulatus bakteerien soluseinien ja vapauttaminen aminohapon rikas solun sisältö. Aktiivisuus BG lysotsyymiä on puhdistettiin mureiinin oli erilainen kuin muiden c lysotsyymin in, jossa on alempi optimaalinen pH ja L, D karboksipeptidaasi tai Nacetyl muramyyli-L-ala amidaasiaktiivisuus. Se oli, kuten muutkin lysotsyymit, aktiivinen vain gram-positiivisiin bakteereihin. Muut järjestelmät kuten suoliameba
, tiedetään sisältävän lysotsyymin toimivat yhdessä kalvon läpäiseväksi peptidit [12], mutta pyrkii puhdistamaan aktiivinen pieniä peptidejä BGE ovat epäonnistuneet, toistaiseksi.
Läsnäolo gram-negatiiviset bakteerit pötsin ei näytä ovat ajaneet kehitystä mahalaukun peptidejä, jotka kykenevät hajottamaan niitä. Tämä rajoittaa järjestelmän tehokkuutta, koska vain Gram-positiiviset bakteerit, ovat sopivia ruoansulatusta, ja gram-negatiiviset bakteerit ovat huomattava osa pötsin bakteerien biomassan. Lisäksi jotkut pötsin grampositiiviset bakteerit näyttävät kehittäneet vastustuskyvyn toimintaa BG lysotsyymiä. Pötsin bakteerin Streptococcus bovis
voivat kehittää resistenssin huokosia muodostava peptidi nisiini, muuttamalla solun lipoteikoiinihapot. Hankinta nisiinin resistenssin myös siirrettävä lysotsyymi vastus [13]. Tiedetään vain vähän bakteereita kehittää resistenssin lysotsyymejä isännästä ne asuttaa, kuten tapauksessa pötsin bakteerien ja mahalaukun naudan lysotsyymi. Ilmiö saattaa heijastaa selektiivinen paine mahalaukun entsyymin pötsin bakteerit, koska BGL bakteerien todennäköisemmin asuttaa alemman suoliston ja pötsin nuorten eläinten, kuin BGL-herkät.
Etsittäessä uusia antibakteerisia huumeita on johtanut tutkia enemmän spekulatiivisia lähestymistapoja tuhota tai estää taudinaiheuttajan mikro-organismeja ja viruksia. On houkuttelevaa optimistisesti ennustaa, että erittäin stabiili peptidejä, jotka luonnostaan ​​kehittynyt mahalaukun mikrobilääkkeiden voi olla hyvät mahdollisuudet kliinisiä sovelluksia. Ihmisen lysotsyymi (monosyyttien erittämä), pelatessaan suojaava tehtävä infektioita vastaan, masentaa superoksidi sukupolven neutrophyls ja parantaa lymfosyyttien proliferatiivista vastetta [14-17]. EWL on sovellettu bakteeri-ja virusinfektiot, jotka perustuvat sen immuuni-stimulaatio ja anti-inflammatorisia ominaisuuksia [18].
Märehtijöiden BG lysotsyymejä, joilla kehittyi hyvin vihamielisessä ympäristössä kuten vatsa, ovat kehittäneet vastustuskyvyn hapon ja proteolyysiä, ja voi olla lupaava käyttötarkoituksia hoidettaessa infektioita, ja elintarviketeollisuudessa. Vuonna eläintuotanto teollisuuden käytöissä antibioottien ja hormonien kasvunedistäjinä on aiheuttanut uhkia ihmisille ja eläimille, ja rehujen lisäravinteen joidenkin kasvunedistäjien on nyt laitonta. Uusien kasvua edistävien jotka eivät aiheuta ongelmia vastus on etusijalla, ja antimikrobiset peptidit ovat tietenkin hyviä ehdokkaita. Itse asiassa, lysotsyymi on todettu olevan yhtä tehokas kuin tavanomaiset antibiootit, edistämään kasvua siipikarjan [19]. Kuitenkin löytö kapasiteetin bakteerien oletettavasti muuttamaan bakteerien mureiini- ja tulevat vastustuskykyisiksi lyyttinen toimintaa lysotsyymejä, varmasti huolta käytännön sovelluksissa, kuten on bakteerien antibioottiresistenssin.
Johtopäätökset
työnäytöksiä että mahalaukun naudan lysotsyymi tehoaa gram-positiivisia bakteereita, mutta että jotkut pötsin kannat eivät vaikuta entsyymi. Mahdollista käytännön sovelluksia tämän antimikrobisen peptidin vaihtoehtona antibiootteja voidaan rajoittaa kehittämiseen bakteerien resistenssin lyyttisen vaikutuksen lysotsyymin.
Menetelmät
mahalaukun uutteesta ja lysotsyymi puhdistus
Etikkahappo ote juoksutusmahan limakalvo oli valmistettiin kuten on kuvattu Dobson et ai. [7]. Naudan mahalaukun uutteet (BGE) lyofilisoitiin ja säilytetään pakastettuina. BGE proteiinit erotettiin denaturoivalla ja ei-denaturoivaa PAGE-elektroforeesilla. Band lyyttistä aktiivisuutta paljastui yläpuolisen agaroosigeelillä upotettu M. luteus
. Puhdistaminen BG Lysotsyymin suoritettiin uudelleen liuottamalla kylmäkuivattu BGE 10 vol. 10% etikkahappoa, sentrifugoimalla 150000 x g 4 ° C: ssa 1 h. Saatu supernatantti, laimennettiin 1: 2,5: 20% asetonitriiliä /0,08% trifluorietikkahappoa. Materiaali ajettiin 0,5 ml erissä Superdex Pep 10/30 -pylvääseen (Pharmacia LKB), joka oli tasapainotettu 20% asetonitriiliä /0,08% trifluorietikkahappoa 20 ° C: ssa ja virtausnopeudella 0,1 ml /min. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin, laimennettiin 1: 2 alkaen puskurilla (50 mM natriumasetaattia, pH 4,5) ja ladattiin Mono S 5/5 kationinvaihtokolonniin (Pharmacia LKB), joka oli tasapainotettu lähtöpuskurilla. Adsorboitunut proteiini eluoitiin pesemällä pylväs samalla puskurilla (5 ml), ja käyttämällä 0-500 mM NaCl-gradientilla (15 ml) ja viimeinen pesu 1 M NaCl 10 ° C: ssa. Aktiivinen materiaali laimennettiin 1:13 lähtöaineiden puskuria (50 mM natriumasetaattia, pH 7,8) ja laitettiin uudelleen Mono S HR 5/5 -pylvääseen (Pharmacia LKB), joka oli tasapainotettu lähtöpuskurilla. Pylväs pestiin samalla puskurilla (5 ml) ja kehitettiin 15 ml gradientilla 0-500 mM NaCl 10 ° C: ssa. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Käänteisfaasi-HPLC suoritettiin Aquapore butyyli 300-pylvääseen (2,1 x 30 mm; Brownlee Labs) yhdistettynä 130 erottaminen järjestelmä (Applied Biosystems). Eluointi suoritettiin lineaarisella gradientilla 0-84% asetonitriilillä 0,1% trifluorietikkahapossa 30 ° C: ssa 45 min. Virtausnopeus 0,2 ml min-1 levitettiin, jäteveden tarkkailtiin absorbanssilla 214 nm: ssä. Piikin fraktiot kerättiin käsin ja testattiin välittömästi lysotsyymin aktiivisuus käyttämällä lysoplate tekniikkaa [20]. Tricine-SDS elektroforeesi suoritettiin 13%: n erotuksen geelit [21].
Antimikrobiset testit
lyyttistä aktiivisuutta M. luteus
määritettiin sironta muutoksia suspension Micrococcus luteus
(0,25 mg /ml asetaattipuskurissa) [8]. Munanvalkuaista (EW) lysotsyymi (Sigma) käytettiin kontrollina. Spesifinen aktiivisuus per ug mahalaukun uutteesta määriteltiin yksiköiden toiminnan 1 ng EWL on M. luteus
, pH 5,5. Estävä vaikutus bakteerien kasvuun määritettiin liemessä ja agar lysoplates [20]. Mikrolaimennusmenetelmää herkkyyskoeväliaineeseen [22], käytettiin määrittämään minimaalinen estävät konsentraatiot. Vaikutus BGE tai BG lysotsyymin bakteerien kasvua määritettiin lihaliemiviljelmiä jossa kasvua seurattiin sameusmittarin (A600 nm).
Muramidase aktiivisuus BGE määritettiin puhdistetulla E. coli
mureiini- [23] kanssa cellosyl (Hoechst , Frankfurt am Main, 50 ug /ml) ja mahalaukun uute (500 ug /ml), määritetään HPLC liukoisten pienimolekyylipainoisen muropeptides [24]. Kontrolli ilman mureiinin sisältyi ajoja ja antanut mitään huippuja. Kun tarvitaan, tuotetun muropeptides kerättiin yksilöllisesti UV-havaitseminen pistorasiaan, kuivattiin vakuumissa, suspendoitiin uudelleen MilliQ veteen ja suola poistettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [23].
Membrane-permeabilyzing aktiivisuus mahalaukun uutteista määritettiin fluorimetricaly, jonka vapautuminen karboksifluoreseiini ( CF) alkaen harjareunusten membraanivesikkeleihin sian suoliston harjareunusten [25] ja hajoamista on valinomysiinia aiheuttaman diffuusio potentiaalia liposomeihin [26].
julistukset
Kirjoittajien alkuperäinen toimitti asiakirjat kuville
Alla linkkejä kirjoittajien alkuperäiset toimitti asiakirjat kuville. 12898_2003_35_MOESM1_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 1 12898_2003_35_MOESM2_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 2 12898_2003_35_MOESM3_ESM.ppt Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 3 12898_2003_35_MOESM4_ESM.ppt Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 4

• Elämänlaatu potilailla, joilla on mahalaukun syövän: kääntäminen ja psykometristen arviointi Iranin version EORTC QLQ-STO22
• Perustaminen ja luonnehdinta etäpesäke malli ihmisen mahasyövän nude mice