Resistência das bactérias ruminais murein a resistência lysozyme

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Fundo
lisozimas, enzimas geralmente associada com a defesa contra infecções bacterianas, são mureinolytic. Ruminantes têm evoluído c tipo lisozima gástrica como uma enzima digestiva, e lucrar com a digestão de bactérias foregut, após a maioria dos componentes da dieta, incluindo proteínas, foram fermentados no rúmen
. Neste trabalho caracterizaram as atividades biológicas de secreções gástricas bovinos contra membranas, murein purificada e bactérias.
Resultados
extrato gástrica Bovina (BGE) foi ativo contra ambos G + e bactérias G-, mas o efeito contra bactérias Gram não foi devido à lisozima, uma vez purificada BGL tinha apenas actividade contra bactérias gram +. Não foi possível encontrar péptidos que formam pequena poro na BGE, e verificaram que a inibição de bactérias Gram-negativas por BGE era devido a um produto manufacturado causada por etilo. Nós relatamos pela primeira vez a atividade de lisozima gástrica bovina (BG lisozima) contra culturas bacterianas puras, ea resistência específica de algumas cepas positivas rúmen grama a BGL.
Conclusões
Algumas bactérias Gram + do rúmen mostrou resistência ao abomaso lisozima. Nós discutimos as implicações desta conclusão à luz das possíveis aplicações práticas de um peptídeo antimicrobiano, tais estável.
Fundo
lisozimas são beta-N-acetil-muramilo-hidrolase que interrompem murein bacteriana [1]. A lisozima animal mais comum é o tipo c, como o ovo de galinha lisozima (LEM, 14,3 kDa), encontrado em animais, insetos e plantas [2]. Os animais monogástricos possuem um único gene para a lisozima c expressa em vários tecidos [3] e é pensado para ser principalmente envolvidos na defesa contra infecções bacterianas.
Em contraste, os ruminantes têm múltiplos genes lisozima [4], e pelo menos quatro código para uma lisozima gástrico que funciona como uma enzima digestiva. A maioria dos componentes da dieta são fermentados no rúmen de ácidos gordos voláteis [5], e os benefícios de ruminantes de digerir bactérias foregut como uma fonte de aminoácidos. lisozima gástrica vaca é uma enzima de base adaptado para agir nas condições gástricas duras, com uma actividade óptima a um pH baixo (4,5-5,2), os valores de força iónica baixa, e resistente ao ácido e pepsina [6, 7]. Temos relatado anteriormente que o recrutamento de lisozima como uma enzima digestiva gástrico tem convergente ocorreu no intestino anterior aviária fermentador hoatzin [8], também com vários eventos de duplicação de genes durante a sua evolução [9]. diferenças de aminoácidos entre proteínas homólogas de espécies diferentes podem ter significado adaptativo, como é o caso com lisozimas gástricas. Lisozimas do estômago de vacas e macacos langur (ambos com fermentação no intestino anterior) estão sujeitos a selecção positiva darwiniana [10, 11].
As bactérias ruminais representam um componente importante da biomassa rúmen [5] e é um fator provável exercendo pressão evolutiva em lisozima gástrico e outras secreções gástricas em herbívoros com fermentação intestino anterior. Isto levou-nos a estabelecer 2 hipóteses: 1 - pode haver outros peptídeos abomaso com atividade antimicrobiana, além de lisozima, que também atuam contra bactérias Gram negativas; 2 - desde que as bactérias ruminais ter sido sujeito à pressão seletiva de secreções gástricas antimicrobianos, bactérias ruminais pode ter desenvolvido resistência a estes compostos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as atividades biológicas de secreções gástricas bovinos contra membranas, murein purificado e bactérias.
Resultados
mucosa Cow abomasum rendeu 26,4 mg BGE por g de tecido (1,32 g, do extrato liofilizado por 100 ml de extracto acético a partir de 50 g mucosa molhada, sd 0,61, n = 20). O teor de proteínas de extractos foi de 60%, equivalente a 16 mg de proteína por grama de tecido gástrico. Um total de 5 g de extracto gástrica foi sujeito a cromatograf ia e foram obtidos 82,2 mg de proteína activa (lítico). Isto representa um rendimento de 1,64% w /w de lisozima a partir do extracto bruto, e 0,43 mg de lisozima por grama de tecido.
SDS-PAGE do extracto gástrica bovino revelou uma banda de proteína principal de 15 kDa e cerca de dois outros bandas de proteínas maiores (30 e 45 kDa). eletroforese não desnaturante mostrou a banda de proteína com ação lítica sobre M. luteus
gel sobreposição -embedded, lisozima presumivelmente gástrico. Lise de M. luteus
suspensão por o extracto gástrico é mostrado na Fig. 1. A actividade específica (sobre M. luteus
) do extracto de toda a mucosa gástrica foi 3,40 L (sd 1,48, N = 20) a pH 5,5. A actividade específica do extracto gástrico diminuiu 32% a um pH de 6 (2,42 L) e 42% a pH 6,5 (2,04 L). Extrair actividade específica, a pH 5,5 foi mais elevada no extracto de fundo gástrico (4,39 L) do que na do antro e do corpo (2,49 L e 2,34 L, respectivamente). Figura 1 actividade bacteriolytic de extrato gástrica contra M. luteus
. actividade lítica apresentada como% de dispersão inicial de uma M. luteus
suspensão (0,25 mg /ml em tampão acetato pH 5,5) tratada (indicado pela seta) com extractos gástricas de toda a mucosa abomaso (E1, E2, E3, E4 e e, o que corresponde a extrair as concentrações de 42, 133, 233, 417 e 554 ug /ml, respectivamente) e LEM (5 ug /ml).
BGE foi bacteriolíticos contra M. luteus
de um modo dependente da concentração (Figura 1). BGE também degradada Muramidase E. coli
mureína, produzindo um perfil diferente à do cellosyl fúngica lisozima (Figura 2). Muropeptides têm uma estrutura básica consistindo de N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D-Glu-gama-MDAP-R1R2, em que R1 e R2 são substituintes na G-carboxi e grupos D-amino. BGE (500 ug /ml) produziu muropeptides diferentes para aqueles produzidos por cellosyl (50 ug /ml), incluindo a falta de um pico a 27 minutos (muropeptide com R1 = D-Ala, e R2 = H), que foi produzido por tratamento com cellosyl. Este pico foi eluído e incubadas com ambos BGE e cellosyl. BGE digerido ainda mais este muropeptide (Fig 2c), enquanto cellosyl fez não (2d Fig). Isto sugere o chapéu ao contrário cellosyl, BGE lisozima tem L, D carboxipeptidase ou Nacetyl muramilo atividade L-ala amidase. atividade Muramidase Figura 2 de extrato gástrica em Echerichia coli
murein purificada. perfil Muropeptide após digestão de murein com extracto gástrica (500 ug /mL, A) ou com o cellosyl muramidase fúngica (50 ug /ml, b). Cellosyl produzido um tetrapéptido a 27 min, correspondendo a M4 (com R1 = D-Ala e R 2 = -H). Este foi ainda digerido por extracto gástrica (500 ug /ml, c), mas não por cellosyl (50 ug /ml, d).
BGE era activa contra P. aeruginosa e E. coli

, permeabilizadas vesículas e lipossomas despolarizadas. Estas actividades foram rastreados em proteínas isoladas e pequenos péptidos que resultou em não péptidos activos a partir do extracto de BGE, incluindo BGL, inactivo contra bactérias Gram negativas (Tabela 1). Permeabilização actividade mostrou ser devido ao acetato de etilo no extracto gástrica, desde BSA ressuspenso em ácido acético e liofilizado tinha uma actividade semelhante à BGE. BGL não inibir o crescimento de certas bactérias gram-positivas do rúmen tais como L. acidophilus
e S. bovis
, que foram fortemente inibidos por LEM, indicando a resistência específica das bactérias ruminais mureína de BGL (Tabela 1) .table 1 Percentagem de crescimento das culturas de controlo às 6 horas, de Gram + e bactérias Gram-crescido na presença de EW lisozima, BG lisozima e BGE.
ORIGEM
BACTÉRIA
ovo Branco Lysozyme150 ug /ml
bovina gástrica Lysozyme150 ug /ml


bovina gástrica Extract10 mg /ml



pH 5,5
pH 7,0

pH 5,5
pH 7,0
pH 5,5
pH 7,0
AMBIENTAL, INTESTINAL
Gram positiva
M. luteus
lisadas 1 | 1 | lise lise 1 | 1 | lise lise 1 | 1 | lisadas Gram negativo
P. aeruginosa
106
173
142
182
0
90
E. coli
103
91
86
124
15
44
RUMEN
Gram positiva
L. vitulinus
1 4
81
69
10
8
L. acidophilus
0
NG
64
NG
168
NG
S. bovis
101
6
108
114
98
111
Gram negativas
S. ruminantium
109
112
130
96
89
87
P. ruminicola
NG
24
NG
113
NG
208
1 | = células lisadas por tratamento em dispersão ensaio. Itálico números em negrito = crescimento inibido. NG
= no crescimento da cultura neste pH.
Atividade Discussão
Muramidase no estômago ácido de um fermentador intestino anterior, recebendo uma biomassa considerável de bactérias, permite a digestão das paredes das células bacterianas e liberalização do aminoácido o conteúdo das células ricas em. A actividade da lisozima sobre BG mureína foi purificado diferente ao de outras lisozimas c em ter pH óptimo inferior e L, D ou carboxipeptidase Nacetyl muramilo actividade L-Ala-amidase. Foi, assim como outras lisozimas, ativos apenas contra bactérias Gram-positivas. Outros sistemas, tais como Entamoeba histolytica
, são conhecidas por conter lisozima agindo em conjunto com os péptidos de membrana permeabilização [12], mas as tentativas para purificar pequenos péptidos activos de BGE falharam, até agora.
Presença de bactérias Gram-negativas em rúmen não parece ter conduzido a evolução dos peptídeos gástricos capazes de degradá-los. Isto iria limitar a eficiência do sistema, uma vez que apenas bactérias gram-positivas são sensíveis à digestão, e bactérias Gram negativas representam uma proporção considerável de biomassa bacteriana do rúmen. Além disso, algumas bactérias gram-positivas do rúmen parecem ter desenvolvido resistência à acção da BG lisozima. bovis rúmen bactéria Streptococcus
pode desenvolver resistência à nisina peptídeo formador de poros, por modificação de ácidos lipoteicóicos de células. Aquisição de resistência nisina também conferiu resistência a lisozima [13]. Pouco se sabe sobre a bactéria desenvolver resistência a lisozimas a partir do hospedeiro que eles colonizam, como no caso das bactérias ruminais e lisozima bovina gástrico. O fenômeno pode refletir a pressão seletiva da enzima gástrica em bactérias ruminais, uma vez que bactérias resistentes a BGL será mais provável para colonizar o intestino inferior e no rúmen de animais jovens, do que as estirpes BGL-sensíveis.
A busca por novos antibacteriano drogas levou a explorar abordagens mais especulativos para destruir ou inibir microorganismos patógenos e vírus. É tentador prever com otimismo que os peptídeos altamente estáveis ​​que evoluiu naturalmente como antimicrobianos gástrico pode ter um alto potencial para aplicações clínicas. lisozima humana (secretada pelos monócitos), ao jogar um papel protetor contra infecções, deprime a geração de superóxido de neutrófilos e linfócitos aumenta a resposta proliferativa [14-17]. LEM foi aplicada contra infecções bacterianas e virais, com base na sua imuno-estimulação e propriedades anti-inflamatórias [18].
Lisozimas Ruminantes BG, tendo evoluído em um ambiente muito hostil tal como o estômago, desenvolveram resistência ao ácido e proteólise, e pode segurar uso promissor no tratamento de infecções, e na indústria alimentar. Na indústria de produção animal, os usos de antibióticos e hormonas como promotores de crescimento tem colocado ameaças para a saúde dos seres humanos e animais, e suplementação alimentar com alguns promotores de crescimento agora é ilegal. A utilização de novos factores de crescimento que não colocam problemas de resistência é uma prioridade, e peptídeos antimicrobianos são naturalmente bons candidatos. Com efeito, a lisozima foi encontrado para ser tão eficaz como os antibióticos convencionais, na promoção de crescimento de aves de capoeira [19]. No entanto, a descoberta da capacidade das bactérias para modificar presumivelmente sua murein bacteriana e se tornam resistentes à ação lítica de lisozimas, vai certamente ser motivo de preocupação em aplicações práticas, assim como a resistência bacteriana a antibióticos.
Conclusões
Este trabalho mostra que a lisozima bovina gástrico é ativo contra bactérias Gram-positivas, mas que algumas cepas do rúmen não são afetados pela enzima. Possíveis aplicações práticas do presente péptido antimicrobiano como uma alternativa aos antibióticos pode ser limitada pelo desenvolvimento de resistência bacteriana à acção lítica de lisozimas.
Métodos
extracto gástrica e purificação lisozima
acético extracto ácido da mucosa foi abomaso preparada tal como descrito por Dobson et ai. [7]. extratos gástricas bovina (BGE) foram liofilizadas e mantidas congeladas. BGE proteínas foram separadas por desnaturação e de electroforese PAGE não-desnaturante. atividade banda lítica foi revelado sobre um gel de agarose sobreposição incorporado com M. luteus
. A purificação do BG lisozima foi realizada dissolvendo re-BGE liofilizado em 10 vol. de ácido acético a 10%, centrifugar a 150.000 x g a 4 ° C durante 1 h. O sobrenadante resultante, diluiu-se 1: 2,5 com 20% de acetonitrilo /0,08% de ácido trifluoroacético. O material foi passado em lotes de 0,5 ml ao longo de um Superdex Pep 10/30 (Pharmacia LKB) equilibrada com 20% de acetonitrilo /0,08% de ácido trifluoroacético a 20 ° C e um caudal de 0,1 ml /min. As fracções activas foram reunidas, diluídas 1: 2 com tampão de partida (50 mM de sódio-acetato, pH 4,5) e carregadas numa Mono S 5/5 coluna de permuta catiónica (Pharmacia LKB) equilibrada com o tampão de partida. proteína adsorvida foi eluida por lavagem da coluna com o mesmo tampão (5 ml) e por utilização de um gradiente de 0-500 mM de NaCl (15 ml) e uma lavagem final de NaCl 1 M a 10 ° C. material activo foi diluída 1:13 com tampão de partida (50 mM de sódio-acetato, pH 7,8) e aplicada novamente a uma coluna Mono S HR 5/5 (Pharmacia LKB) equilibrada com o tampão de partida. A coluna foi lavada com o mesmo tampão (5 ml) e desenvolvida com um gradiente de 15 ml de NaCl 0-500 mM a 10 ° C. As fracções activas foram reunidas e armazenadas a -20 ° C. HPLC de fase reversa foi realizada numa coluna Aquapore Butil 300 (2,1 x 30 mm, Brownlee Labs) ligada a um sistema de separação 130 A (Applied Biosystems). A eluição foi realizada com um gradiente linear de 0-84% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% a 30 ° C ao longo de 45 min. Uma taxa de fluxo de 0,2 ml min-1, foi aplicado, o efluente foi monitorizado por absorvência a 214 nm. As fracções do pico foram colhidas manualmente e testados imediatamente para a actividade da lisozima usando a técnica lysoplate [20]. Tricina-SDS a electroforese foi realizada em géis de 13% de separação [21].
Testes antimicrobianos
actividade lítica contra M. luteus
foi determinado por dispersão de alterações em uma suspensão de Micrococcus luteus
(0,25 mg /ml em tampão de acetato) [8]. Clara de ovo (EW) de lisozima (Sigma) foi utilizada como um controlo. A actividade específica por ug de extracto gástrica foi definida como unidades de actividade de 1 ng de LEM sobre M. luteus
, a pH 5,5. Efeito inibitório sobre o crescimento bacteriano foi determinada em caldo e ágar lysoplates [20]. teste de microdiluição susceptibilidade [22] foi usada para determinar as concentrações inibitórias mínimas. Efeito de BGE ou BG de lisozima sobre o crescimento bacteriano foi determinada em culturas de caldo em que o crescimento foi monitorizada por turbidimetria (A600 nm).
Actividade Muramidase de BGE foi ensaiada em purificada de E. coli
mureína [23] com cellosyl (Hoechst , Frankfurt am Main; 50 ug /ml) e extracto gástrica (500 ug /ml), a determinação por HPLC da produção de muropeptides solúveis de baixo peso molecular [24]. Um controle sem murein foi incluído nas corridas e não deu picos. Quando necessário, muropeptides produzidos foram recolhidos individualmente na saída detecção UV, seco sob vácuo, ressuspendidas em água MilliQ e dessalinizado como descrito anteriormente [23].
Membrana-permeabilyzing actividade dos extractos foi determinada fluorimetricaly gástricas, pela libertação de carboxifluoresceína ( CF) de vesículas de membrana de borda em escova de fronteira porco intestinal escova [25] e pela dissipação de um potencial de difusão induzida por valinomicina em lipossomas [26].
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