Résistance des bactéries du rumen murein à lysozyme

gastrique bovine Résistance des bactéries du rumen murein à lysozyme gastrique bovine
Résumé de l'arrière-plan
Lysozymes, enzymes principalement associée à la défense contre les infections bactériennes, sont mureinolytic. Ruminants ont évolué gastrique de type c lysozyme comme une enzyme digestive, et le résultat de la digestion des bactéries intestin antérieur, après que la plupart des composants alimentaires, y compris les protéines, ont été fermentée dans le rumen
. Dans ce travail, nous avons caractérisé les activités biologiques des sécrétions gastriques bovine contre membranes, murein purifiée et les bactéries.: Résultats
Bovine extrait gastrique (BGE) est actif contre les bactéries G + et G-, mais l'effet contre les bactéries Gram n'a pas été due à la lysozyme, puisque purifié BGL avait seulement une activité contre les bactéries Gram +. Nous avons été incapables de trouver des petits pores peptides formant dans le BGE, et a constaté que l'inhibition de bactéries à Gram négatif par BGE était due à un artefact causé par l'acétate. Nous rapportons pour la première fois l'activité de lysozyme gastrique bovine (BG lysozyme) contre les cultures bactériennes pures, et la résistance spécifique de certaines souches positives rumen Gram aux conclusions de BGL.
Certaines bactéries Gram + rumen ont montré une résistance à caillette lysozyme. Nous discutons les implications de cette découverte à la lumière des applications pratiques possibles d'un tel peptide antimicrobien stable.
Contexte
Lysozymes sont bêta-N-acétyl-muramyl-hydrolase qui perturbent murein bactérienne [1]. Le lysozyme animal le plus commun est le type de c, comme l'œuf de poule lysozyme blanc (LEF, 14,3 Kda), trouvé dans les animaux, les insectes et les plantes [2]. Les animaux monogastriques possèdent un seul gène de lysozyme c exprimé dans divers tissus [3] et est pensé pour être principalement impliquée dans la défense contre les infections bactériennes.
En revanche, les ruminants ont plusieurs gènes de lysozyme [4], et au moins quatre code pour un lysozyme de l'estomac qui fonctionne comme une enzyme digestive. La plupart des composants alimentaires sont fermentées dans le rumen d'acides gras volatils [5], et les avantages de ruminants de digérer les bactéries intestin antérieur comme une source d'acides aminés. Vache lysozyme gastrique est une enzyme de base adaptée pour agir dans les conditions gastriques sévères, avec une activité optimale à pH faible (04.05 à 05.02), de faibles valeurs de force ionique, et résistant à l'acide et de la pepsine [6, 7]. Nous avons précédemment rapporté que le recrutement de lysozyme comme une enzyme digestive gastrique a convergeant eu lieu dans l'intestin antérieur aviaire fermenteur hoatzin [8], également avec de multiples événements de duplication des gènes au cours de son évolution [9]. des différences d'acides aminés entre les protéines homologues provenant d'espèces différentes peuvent avoir une importance adaptée, comme cela est le cas avec les lysozymes gastriques. Lysozymes de l'estomac des vaches et des singes langur (à la fois avec la fermentation dans l'intestin antérieur) sont soumis à une sélection positive darwinienne [10, 11].
Bactéries du rumen représentent une composante importante du rumen biomasse [5] et est un facteur susceptible exerçant une pression évolutive sur lysozyme gastrique et autres sécrétions gastriques chez les herbivores avec foregut fermentation. Cela a incité nous établissons 2 hypothèses: 1 - il pourrait y avoir d'autres peptides de caillette avec une activité antimicrobienne, en plus de lysozyme, qui serait également agir contre les bactéries Gram négatives; 2 - puisque les bactéries du rumen ont été soumis à la pression sélective des sécrétions gastriques antimicrobiens, les bactéries du rumen pourraient avoir développé une résistance à ces composés. L'objectif de ce travail était de caractériser les activités biologiques des sécrétions gastriques bovine contre membranes, murein purifiée et bactéries
. Résultats
vache caillette muqueuse a abouti à 26,4 mg BGE par gramme de tissu (1,32 g, d'extrait lyophilisé pour 100 ml d'extrait acétique à partir de 50 g muqueuse humide, sd 0,61, N = 20). La teneur en protéines des extraits a été de 60%, ce qui correspond à 16 mg de protéine par gramme de tissu gastrique. Au total, 5 g d'extrait gastrique a été soumis à une Chromatographie et 82,2 mg de protéine active (lytiques) ont été obtenus. Ceci représente un rendement de 1,64% en poids /poids de lysozyme de l'extrait brut et de 0,43 mg de lysozyme par gramme de tissu.
SDS-PAGE de l'extrait de l'estomac de bovin a révélé une bande majeure de protéines d'environ 15 kDa et deux autres des bandes de plus grandes protéines (30 et 45 kDa). électrophorèse non dénaturante montre la bande de protéine avec une activité lytique sur gel de recouvrement -embedded de M. luteus, vraisemblablement lysozyme gastrique. Lysée de M. luteus
suspension par l'extrait gastrique est représenté sur la Fig. 1. Activité spécifique (sur M. luteus
) de l'extrait de toute la muqueuse gastrique était de 3,40 U (écart-type 1,48, N = 20) à pH 5,5. activité spécifique de l'extrait gastrique a diminué de 32% à pH 6 (2,42 U) et 42% à pH 6,5 (2,04 U). Extrait activité spécifique à pH 5,5 était plus élevé dans l'extrait du fundus gastrique (4,39 U) que dans celui de l'antre et du corps (2,49 U et 2,34 U, respectivement). Figure 1 activité bactériolytique d'extrait gastrique contre M. luteus
. activité lytique représentée en% de la diffusion initiale d'une suspension de M. luteus
(0,25 mg /ml dans un tampon acétate pH 5,5) traité (indiqué par la flèche) avec des extraits de la muqueuse gastrique caillette ensemble (E1, E2, E3, E4 et E, correspondant à extraire des concentrations de 42, 133, 233, 417 et 554 pg /ml, respectivement) et LEF (5 ug /ml).
BGE était bactériolytique contre M. luteus
d'une manière dépendante de la concentration (Fig. 1). BGE également dégradé Muramidase de E. coli
muréine, produisant un profil différent de celui du lysozyme cellosyl fongique (figure 2). Muropeptides ont une structure de base consistant en la N-acétylglucosaminyl-N-acétylmuramyl-L-Ala-D-Glu-gamma-MDAP-R1R2, où R1 et R2 sont des substituants en L-carboxy et les groupes D-aminés. BGE (500 pg /ml) a produit différents muropeptides à celles produites par cellosyl (50 pg /ml), notamment l'absence d'un pic à 27 minutes (muropeptide avec R1 = D-Ala et R2 = H) qui a été produit par traitement avec cellosyl. Ce pic a été élue et incubé à la fois BGE et cellosyl. BGE encore digéré cette muropeptide (figure 2c), tandis que cellosyl n'a pas (figure 2d). Cela suggère chapeau contrairement cellosyl, BGE lysozyme a L, D carboxypeptidase ou Nacetyl muramyl activité L-ala amidase. Figure 2 Activité Muramidase d'extrait gastrique sur Escherichia coli
murein purifiée. Profil muropeptide après digestion de murein avec un extrait gastrique (500 pg /ml, a) ou avec le cellosyl muramidase fongique (50 pg /ml, b). Cellosyl produit un tétrapeptide à 27 min correspondant à M4 (ayant R1 = D-Ala et R2 = -H). Ceci a été digéré par l'extrait gastrique (500 pg /ml, c), mais pas par cellosyl (50 pg /ml, d). Le plus BGE a été actif contre P. aeruginosa et E. coli

, perméabilisées des vésicules et des liposomes dépolarisée. Ces activités ont été criblés dans les protéines isolées et de petits peptides produisant pas de peptides actifs de l'extrait BGE, y compris BGL inactif contre les bactéries à Gram négatif (tableau 1). Perméabilisant activité avérée être due à l'acétate dans l'extrait gastrique, car la BSA remis en suspension dans de l'acide acétique et lyophilisé avait une activité similaire à BGE. BGL ne pas inhiber la croissance de certaines bactéries de la panse à Gram positif telles que L. acidophilus
et S. bovis
, qui ont été fortement inhibée par EWL, ce qui indique une résistance spécifique des bactéries du rumen murein BGL (tableau 1) .Tableau 1 Pourcentage de la croissance des cultures de contrôle à 6 heures, de Gram + et les bactéries Gram- cultivées en présence de EW lysozyme, BG lysozyme et BGE.
ORIGIN
BACTÉRIE
blanc d'oeuf Lysozyme150 ug /ml
bovine gastrique Lysozyme150 ug /ml


bovine gastrique Extract10 mg /ml



pH 5,5
pH 7,0

pH 5,5
pH 7,0
pH 5,5
pH 7,0
ENVIRONNEMENT, INTESTINAL
Gram positif
M. luteus
lysée 1
lysée 1
lysée 1
lysée 1
lysée 1
lysée 1
Gram négatif
P. aeruginosa

106
173
142
182
0
90
E. coli
103
91
86
124
15
44
RUMEN
Gram positif
L. vitulinus
1 4
81
69
10 8
L. acidophilus
0
NG
64
NG
168
NG
S. bovis
101
6
108
114
98
111
Gram négatif
S. ruminantium
109
112
130
96
89
87
P. ruminicola
NG
24
NG
113
NG
208 1
= cellules lysées par traitement dans la diffusion test. Italiques chiffres en gras = croissance inhibée. NG s = pas de croissance de la culture à ce pH de l'activité Discussion
Muramidase de. Dans l'estomac acide d'un fermenteur de foregut, recevant une biomasse considérable de bactéries, permet la digestion des parois cellulaires bactériennes et la libéralisation des acides aminés le contenu des cellules -Rich. L'activité de BG lysozyme sur murein purifiée était différente de celle des autres lysozyme c dans ayant un pH inférieur optimal et L, D ou d'une carboxypeptidase Nacetyl muramyl activité amidase L-Ala. Il était, comme d'autres lysozymes, actifs uniquement contre les bactéries à Gram positif. D'autres systèmes tels que Entamoeba histolytica
, sont connus pour contenir lysozyme agissant de concert avec membrane perméabilisant peptides [12], mais les tentatives pour purifier les petits peptides actifs de BGE ont échoué, jusqu'à présent
. Présence de bactéries à Gram négatif dans le rumen ne semble pas avoir entraîné l'évolution des peptides gastriques capables de les dégrader. Cela limiterait l'efficacité du système, étant donné que bactéries à Gram positif se prêtent à la digestion, et les bactéries Gram négatives représentent une part considérable de la panse de la biomasse bactérienne. En outre, certaines bactéries Gram positives rumen semblent avoir développé une résistance à l'action de BG lysozyme. bovis rumen bactérie Streptococcus
peuvent développer une résistance à la nisine du peptide formant des pores, en modifiant les acides lipotéichoïques cellulaires. Acquisition de la résistance nisine également conféré une résistance de lysozyme [13]. On connaît peu de bactéries développer une résistance aux lysozymes de l'hôte qu'ils colonisent, comme dans le cas des bactéries du rumen et lysozyme gastrique bovine. Le phénomène reflète peut-être la pression sélective de l'enzyme gastrique sur les bactéries du rumen, puisque les bactéries BGL-résistantes seront plus susceptibles de coloniser l'intestin inférieur et le rumen des jeunes animaux, que les souches BGL-sensibles.
La recherche de nouveaux antibactériens drogues a conduit à explorer des approches plus spéculatives pour détruire ou inhiber les micro-organismes pathogènes et des virus. Il est tentant de prédire avec optimisme que les peptides très stables qui naturellement évolué comme antimicrobien gastriques peuvent avoir un fort potentiel pour des applications cliniques. lysozyme humain (sécrété par des monocytes), tout en jouant un rôle de protection contre les infections, déprime la génération de superoxyde de neutrophyls et améliore la réponse proliférative des lymphocytes [14-17]. LEF a été appliqué contre les infections bactériennes et virales, en fonction de ses propriétés anti-inflammatoires immuno-stimulation et [18] Les lysozymes Ruminant BG de., Après avoir évolué dans un environnement très hostile, comme l'estomac, ont développé une résistance à l'acide et protéolyse, et peut détenir des utilisations prometteuses dans les infections de traitement, et dans l'industrie alimentaire. Dans le secteur de la production animale, les utilisations des antibiotiques et des hormones de croissance a constitué une menace pour la santé des humains et des animaux, et la supplémentation alimentaire avec des promoteurs de croissance est désormais illégal. L'utilisation de nouveaux promoteurs de croissance qui ne pose pas de problèmes de résistance est une priorité, et les peptides antimicrobiens sont bien sûr de bons candidats. En effet, le lysozyme a été trouvée être aussi efficaces que les antibiotiques classiques, pour favoriser la croissance des volailles [19]. Cependant, la découverte de la capacité des bactéries à modifier sans doute sa murein bactérienne et de devenir résistant à l'action lytique du lysozyme, va sûrement être une préoccupation dans les applications pratiques, de même que la résistance aux antibiotiques des bactéries.
Conclusions
Ce travail montre que le lysozyme gastrique bovine est actif contre les bactéries Gram-positives, mais que certaines souches de la panse ne sont pas affectés par l'enzyme. des applications pratiques possibles de ce peptide antimicrobien comme une alternative aux antibiotiques peuvent être limitées par le développement d'une résistance bactérienne à l'action lytique du lysozyme.
Méthodes
extrait gastrique et la purification de lysozyme
acide acétique extrait de muqueuse est la caillette préparé comme décrit par Dobson et al. [7]. extraits gastriques bovine (BGE) ont été lyophilisée et conservés congelés. protéines BGE ont été séparées par électrophorèse et dénaturant PAGE non dénaturant. activité Band lytique a été révélée sur un gel d'agarose superposée embarqué avec M. luteus
. Purification de BG lysozyme a été réalisée re-dissoudre BGE lyophilisée dans 10 vol. d'acide acétique à 10%, une centrifugation à 150 000 x g à 4 ° C pendant 1 h. Le surnageant résultant a été dilué à 1: 2,5 avec de l'acide trifluoroacétique à 20% d'acétonitrile /0,08%. Le matériau a été passé dans des lots de 0,5 ml sur une colonne Superdex Pep 10/30 (Pharmacia LKB) équilibrée avec 20% d'acétonitrile /acide trifluoroacétique à 0,08% à 20 ° C et à un débit de 0,1 ml /min. Les fractions actives ont été regroupées, diluées à 1: 2 avec du tampon de départ (50 mM d'acétate de sodium, pH 4,5) et chargé sur la colonne 05/05 échangeuse de cations, d'un mono (Pharmacia LKB) équilibrée avec le tampon de départ. On a élue la protéine adsorbée en lavant la colonne avec le même tampon (5 ml) et en utilisant un gradient de 0 à 500 mM de NaCl (15 ml) et un lavage final de 1 M de NaCl à 10 ° C. Matière active a été diluée 1:13 avec le tampon de départ (50 mM d'acétate de sodium, pH 7,8) et appliquée de nouveau à HR 5/5 la colonne d'un Mono (Pharmacia LKB) équilibrée avec le tampon de départ. La colonne a été lavée avec le même tampon (5 ml) et développée avec un gradient de 15 ml de NaCl 0 à 500 mM à 10 ° C. Les fractions actives ont été rassemblées et stockées à -20 ° C. HPLC en phase inverse a été effectuée sur une colonne Aquapore Butyl 300 (2,1 x 30 mm, Brownlee Labs) connecté à un 130 concerne un système de séparation (Applied Biosystems). L'élution a été effectuée avec un gradient linéaire de 0-84% d'acétonitrile dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1% à 30 ° C pendant 45 min. Un débit de 0,2 ml min-1 a été appliqué, l'effluent a été contrôlé par absorbance à 214 nm. Les fractions des pics ont été collectées manuellement et testé immédiatement pour l'activité du lysozyme en utilisant la technique lysoplate [20]. électrophorèse Tricine-SDS a été réalisée dans 13% des gels de séparation [21].
des tests antimicrobiens
activité lytique contre M. luteus
a été déterminée par diffusion de changements dans une suspension de Micrococcus luteus
(0,25 mg /ml dans un tampon acétate) [8]. Le blanc d'oeuf (EW) lysozyme (Sigma) a été utilisé comme témoin. Activité spécifique par ug d'extrait gastrique a été défini comme unités d'activité de 1 ng de LEF sur M. luteus
, à pH 5,5. Effet inhibiteur sur la croissance bactérienne a été déterminée sur le bouillon et lysoplates agar [20]. Test de microdilution de sensibilité [22] a été utilisé pour déterminer les concentrations minimales inhibitrices. Effet de BGE ou BG lysozyme sur la croissance bactérienne a été déterminée dans des cultures de bouillon dans lequel la croissance a été suivie par turbidimétrie (A600 nm).
Activité Muramidase de BGE a été dosée sur purifiée E. coli
murein [23] avec cellosyl (Hoechst Frankfurt am Main; 50 pg /ml) et l'extrait gastrique (500 ug /ml), la détermination par CLHP de la production de muropeptides solubles de faible poids moléculaire [24]. Un contrôle sans murein a été inclus dans les essais et a donné aucun pic. Lorsque cela est nécessaire, muropeptides produits ont été collectés individuellement à la sortie de détection UV, séché sous vide, remis en suspension dans de l'eau MilliQ et dessalé comme décrit précédemment [23] de.-Membrane permeabilyzing activité des extraits gastrique a été déterminée fluorimetricaly, par la libération de carboxyfluorescéine ( CF) à partir de vésicules membranaires de bordure en brosse de porc intestinale bordure en brosse [25] et par la dissipation d'un potentiel de diffusion induite par la valinomycine dans des liposomes [26]. Déclarations de
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