Odpornost vampnih bakterij murein goveji želodca lizocim

Odpornost vampu bakterij murein do govejega želodca lizocim
Abstract
Ozadje
lizocimi, encimov, predvsem povezana z obrambo pred bakterijskimi okužbami, so mureinolytic. Prežvekovalci so se razvili želodčni tip c lizocima kot prebavnega encima, in dobička iz prebavo foregut bakterij, potem ko so bili večina prehranskih komponent, vključno z beljakovinami, fermentirano v vampu
. V tem delu smo značilne biološke aktivnosti govejih želodca izločki proti membrane, prečiščene murein in bakterije.
Rezultati
govejo želodčne ekstrakta (BGE) je aktivna tako proti G + in G- bakterije, vendar je učinek proti Gram- bakterij ni bila posledica lizocim, saj je imel očiščen BGL samo delovanje proti Gram + bakterije. Nismo mogli najti majhen por, ki tvorijo peptide v BGE, in ugotovil, da je zaviranje Gramu negativnih bakterij, ki jih BGE zaradi artefakt, ki ga acetat škodo. Mi poroča prvič dejavnost govejega želodca lizocim (BG lizocimskega) proti čistih bakterijskih kultur, in specifična upornost nekaterih rumen gram pozitivnih sevov na rno.
Sklepov
nekaterih po Gramu + vampnih bakterij, pokazala, odpornost na abomasum lizocima. Smo razpravljali o posledicah te ugotovitve v luči možne praktične aplikacije takega stabilnega protimikrobni peptid.
Ozadje
lizocimi so beta-N-acetil-muramil-hidrolaze, ki motijo ​​bakterijskega murein [1]. Najpogostejši živali lizocim je tip c, kot je piščanec beljakom lizocim (EWL, 14,3 kDa), ki se nahajajo v živalskih žuželk in rastlin [2]. Monogastrične živali imajo en sam gen za lizocim c izraženo v različnih [3] tkiv in je mislil, da je v prvi vrsti sodelujejo v obrambi pred bakterijskimi okužbami.
V nasprotju s prežvekovalci imajo več lizocim geni [4], in vsaj štiri koda za želodcu lizocim, ki deluje kot prebavnih encimov. Večina prehranskih komponente fermentirano v vampu do hlapnih maščobnih kislin [5], in koristi prežvekovalcev z razgrajanjem foregut bakterije kot vir aminokislin. Krava želodca lizocim je osnovni encim prilagojen, da deluje v težkih želodčnih pogojih, z optimalno aktivnost pri nizkem pH (4.5-5.2), nizke ionske trdnostjo in odporen na kislino in pepsin [6, 7]. prej smo poročali, da je convergently prišlo zaposlitev lizocim kot želodčni prebavnega encima v fermentorja hoacin aviarne foregut [8], tudi s številnimi dogodki gen podvajanje v njen razvoj [9]. Razlike amino kislin med homolognimi proteini iz različnih vrst so lahko adaptivno pomen, kot je to primer pri želodčnih lizocimi. Lizocimi iz želodcev krav in langur opice (oba z vrenjem v foregut) so predmet pozitivnega Darwinove selekcije [10, 11].
Vampu bakterije predstavljajo pomemben sestavni del [5] v vampu biomase in dejavnik, ki verjetno izvajali evolucijski pritisk na želodčno lizocim in drugih želodčnih izločki v rastlinojede z foregut fermentacijo. To je spodbudilo nam določiti 2 hipoteze: 1 - lahko pride drugi abomasum peptidi z antimikrobno poleg lizocim, ki bi prav tako delujejo proti Gram-negativnih bakterij; 2 - odkar so rumen bakterije predmet selektivnega pritiska želodca protimikrobnih izločki, lahko Rumen bakterije razvile odpornost na teh spojin. Cilj tega dela je bil opredelitev biološke aktivnosti govejih želodca izločki proti membrane, očiščenega murein in bakterij.
Rezultati
krava abomasum sluznica prinašajo 26,4 mg Bge na g tkiva (1,32 g, od liofilizirane ekstrakta na 100 ml ocetne izvlečka iz 50 g mokrega sluznico, sd 0,61, N = 20). vsebnost beljakovin ekstraktov je bila 60%, kar ustreza 16 mg proteina na gram želodčnega tkiva. Skupno 5 g želodca ekstrakta je predmet kromatografije in Dobimo 82,2 mg zdravilne (litičen) proteina. To predstavlja donos 1,64% m /m lizocima iz surovega ekstrakta in 0,43 mg lizocima na gram tkiva.
SDS-PAGE na želodčni ekstrakta goveje pokazala velik protein pas okoli 15 kDa in drugima dvema pasovi večjih proteinov (30 in 45 kDa). Non denaturacija elektroforeza je pokazala skupino beljakovin z litična dejavnost na M. luteus
-embedded prekrivni gel, predvidoma želodca lizocim. Liza M. luteus
suspenziji ob ekstrakta želodca je prikazano na sliki. 1. Specifična aktivnost (na M. luteus
) ekstrakta iz celotne želodčne sluznice je bila 3,40 U (sd 1,48, N = 20) pri pH 5,5. Specifična aktivnost ekstrakta želodca pri pH 6 (2,42 U) in 42% zmanjšala za 32% pri pH 6,5 (2,04 U). Ekstrakt specifično aktivnost pri pH 5,5 bil višji v izvlečku želodčnega fundusa (4,39 U), kot da na antruma in telesom (2,49 U in 2,34 U zaporedju). Slika 1 Bacteriolytic aktivnost želodca ekstrakta proti M. luteus
. Litičen aktivnost prikazan kot% začetne sipanja za M. luteus
suspenzije (0,25 mg /ml v acetatnem pufru pH 5,5), zdravljenim (označena s puščico) z želodčnih izvlečki celotnega abomasum sluznici (E1, E2, E3, E4 in E, kar ustreza za pridobivanje koncentracije 42, 133, 233, 417 in 554 mg /ml, v tem zaporedju) in EWL (5 mg /ml).
BGE je bacteriolytic proti M. luteus
v odvisnosti od koncentracije (slika 1). BGE razgradi tudi Muramidase E. coli
murein ustvaril drugačno dinamiko kot v glivične lizocimskega cellosyl (slika 2). Muropeptides imajo osnovno strukturo, ki sestoji iz N-acetylglucosaminyl-N-acetilmuramil-L-Ala-D-Glu-gama-mDap-R1R2, kjer sta R1 in R2 substituenti na L-karboksi in D-amino skupine. BGE (500 mg /ml) proizvaja različne muropeptides tistim, ki ga proizvaja cellosyl (50 ug /ml), vključno s pomanjkanjem vrha na minuto 27 (muropeptide z R1 = D-Ala in R2 = H), ki je bil proizveden z obdelavo z cellosyl. Ta vrh spiramo in inkubirali z obema BGE in cellosyl. BGE dodatno prebavi to muropeptide (slika 2c), medtem ko cellosyl ni (slika 2d). To kaže, klobuk za razliko od cellosyl, BGE lizocim je L, D karboksipeptidaza ali Nacetyl muramil L-ala amidaze aktivnost. Slika 2 Muramidase aktivnost želodca ekstrakta Echerichia coli
prečiščene murein. Muropeptide profil po razgradnji murein želodčno ekstrakta (500 ug /ml, a) ali z glivično muramidase cellosyl (50 ug /ml, b). Cellosyl proizvaja tetrapeptid v 27 min, kar ustreza M4 (ob R1 = D-Ala in R2 = H). To je bilo prebavi želodca ekstrakta (500 ug /ml, c), vendar ne po cellosyl (50 ug /ml, d).
BGE bil aktiven proti P. aeruginosa
in E. coli
, permeabilnih mehurčki in depolarizirano liposome. Te dejavnosti so bile pregledane v izoliranih proteinov in majhne peptide prinaša nobenih aktivnih peptidov iz ekstrakta BGE, vključno BGL, neaktivni proti Gram negativnih bakterij (tabela 1). Propustnosti aktivnost izkazalo, da je zaradi acetat v izvlečku želodca, ker BSA ponovno suspendirali v ocetni kislini in liofiliziramo imela podobno aktivnost BGE. BGL ne zavirajo rast nekaterih gram pozitivnih vampu bakterije, kot so L. acidophilus
in S. bovis
, ki so bili zelo inhibira s EWL, ki označuje posebno odpornost vampu bakterij murein za BGL (tabela 1) .table 1 Odstotek rasti kontrolne kulture na 6 ur, po Gram + in Gram- bakterije gojili v prisotnosti EW lizocim, BG lizocim in BGE.
IZVOR
bakterija
jajčni beljak Lysozyme150 ug /ml
Goveja želodca Lysozyme150 ug /ml


Goveja želodca Extract10 mg /ml



pH 5,5
pH 7,0

pH 5,5
pH 7,0
pH 5,5
pH 7,0
OKOLJA, črevesne
Gram pozitivne
M. luteus

lizirali 1
lizirali 1
lizirali 1
lizirali 1
lizirali 1
lizirali 1
Gram negativne
P. aeruginosa

106
173
142
182
0
90
E. coli
103
91
86
124
15
44
vampu
Gram pozitivne
L. vitulinus
1
4
81
69
10
8
L. acidophilus
0
NG
64
NG
168
NG
S. bovis
101
6
108
114
98
111
Gram negativne
S. ruminantium
109
112
130
96
89
87
P. ruminicola
NG
24
NG
113
NG
208
1
= celice lizirali z obdelavo v sipanja testom. Italski krepko številke = zaviral rast. Ng
= ni rast kulture pri tem pH.
Aktivnosti Razprava
Muramidase v kislem želodcu foregut fermentorju, ki prejme precejšnjo biomaso bakterij, omogoča prebavo bakterijske celične stene in liberalizacijo aminokislino vsebina -RICH celic. Dejavnost BG lizocim na očiščen murein je bila drugačna od drugih c lizocimi, da ima nižji optimalno pH in L, D karboksipeptidaza ali Nacetyl muramil L-ala amidaze aktivnost. Bilo je, kot druge lizocimi, ki delujejo samo proti po Gramu pozitivnim bakterijam. Drugi sistemi, kot so Entamoeba histolytica
, je znano, da vsebuje lizocima deluje usklajeno in z membrano propustnosti peptidi [12], temveč skuša očistiti aktivne majhne peptide iz BGE ni uspelo, tako daleč.
Prisotnost po Gramu negativnih bakterij v vampu ne zdi, da so posledica razvoja želodca peptidov, ki lahko jih razgradijo. To bi omejilo učinkovitost sistema, saj le Gram pozitivne bakterije so predmet prebavo in gramnegativne bakterije predstavljajo znaten delež vampu bakterijske biomase. Poleg tega so nekateri rumen grampozitivne bakterije se zdi, da so razvili odpornost na delovanje BG lizocim. Rumen bakterija Streptococcus bovis
lahko razvije odpornost na por oblikovanje peptidov nizinom, s spremembo celic lipoteichoic kisline. Pridobitev Nizin odpornosti podeli tudi odpornost lizocim [13]. Malo znanega o bakterije razvoja odpornosti na lizocimi gostitelja so kolonizira, kot v primeru vampnih bakterij in želodčnega govejo lizocim. Ta pojav lahko odraža selektivni pritisk želodca encima na vampnih bakterij, saj bo BGL odporne bakterije, je bolj verjetno, da kolonizirajo spodnji črevesje in vampu mladih živali, kot BGL občutljivi sevi.
Iskanje novega protibakterijsko droge je privedlo do raziskati bolj špekulativne pristope uničiti ali zavirajo patogenih mikroorganizmov in virusov. To je skušnjava, da optimistično napovedujejo, da bi lahko zelo stabilne peptidi, ki naravno razvile kot želodca protimikrobnih velik potencial za klinično prakso. Human lizocim (izločajo monociti), medtem ko igra zaščitno vlogo pred okužbami, posede generacijo superoksid od neutrophyls in krepi limfocitov proliferativni odziv [14-17]. EWL je bil uporabljen proti bakterijskim in virusnim okužbam, ki temelji na imunski stimulacijo in protivnetnimi lastnostmi [18].
Prežvekovalce BG lizocimi, ki so se razvili v zelo sovražnem okolju, kot so trebuh, so razvili odpornost na kisline in proteoliza, in imajo lahko obetajoče uporabo pri zdravljenju okužb, in v živilski industriji. V industriji proizvodnje živali, se je uporaba antibiotikov in hormonov kot pospeševalcev rasti zastavljeno nevarnosti za zdravje, za ljudi in živali, ter dopolnitev krme z nekaj pospeševalci rasti je zdaj nezakonito. Uporaba novih promotorjev rasti, ki ne predstavljajo težav odpornosti je prednostna naloga, in antimikrobne peptidi so seveda dobri kandidati. Dejansko je bilo ugotovljeno, da je enako učinkovito kot običajne antibiotike, pri spodbujanju rasti perutnine [19] lizocim. Vendar pa je odkritje sposobnost bakterij, da bi verjetno spremenila svojo bakterijsko murein in postali odporni na delovanje litičen za lizocimi, bo zagotovo skrb v praktičnih aplikacijah, kot je bakterijske odpornosti proti antibiotikom.
Sklepe
To delo kaže da želodca goveji lizocim je aktiven zoper Gram pozitivnim bakterijam, ampak da so nekateri rumen sevi vpliva encim. Možne praktične aplikacije tega protimikrobne peptida kot alternativo antibiotikov je lahko omejena zaradi razvoja bakterijske odpornosti na ukrepanje litičen za lizocimi.
Metode
želodčni ekstrakt in čiščenje lizocim
ocetne kisline, izvlečka iz abomasal sluznice je bila pripravimo tako, kot ga Dobson et al opisal. [7]. Govedo želodca izvlečki (BGE) so liofilizirane in hrani zamrznjen. BGE proteine ​​smo ločili z denaturacijsko in brez denaturacije PAGE elektroforeza. Band litična dejavnost je pokazalo na prekritju agaroznem gelu vgrajeni z M. luteus
. Čiščenje BG lizocim je bila izvedena, ponovno raztopimo liofiliziranega Bge 10 vol. 10% ocetne kisline, centrifugiranjem pri 150.000 x g pri 4 ° C 1 h. Nastalo Supernatant smo razredčili 1: 2,5 z 20% acetonitril /0,08% trifluoroocetne kisline. Material je bil sprejet v 0,5 ml serijah več superdeks Pep 10/30 koloni (Pharmacia LKB) uravnotežili s 20% acetonitrila /0,08% trifluoroocetne kisline pri 20 ° C in hitrost pretoka 0,1 ml /min. Aktivne frakcije smo zbrali, razredčimo 1: 2 z izhodnega pufrom (50 mM natrijevim acetatom, pH 4,5) in natovorjena mono S 5/5 kationsko izmenjevalno kolono (Pharmacia LKB), uravnoteženo z začetkom pufer. Adsorbirano protein eluiramo z izpiranjem kolone z istim pufrom (5 ml) in z uporabo 0-500 mM NaCl gradientom (15 ml) in končno pranje 1 M NaCl pri 10 ° C. Aktivna snov razredčimo 1:13 s začenši pufrom (50 mM natrijev-acetat, pH 7.8) in ponovno uporabiti za mono S HR 5/5 koloni (Pharmacia LKB) uravnotežena z začetkom buffer. Kolono smo sprali z enakim pufrom (5 ml) ter razvili s 15 ml gradientom 0-500 mM NaCl pri 10 ° C. Aktivne frakcije zberemo in shranimo pri -20 ° C. HPLC na reverzni fazi je bila izvedena na Aquapore butil 300 kolono (2.1 x 30 mm; Brownlee Labs), povezan z 130 sistem, ločitev (Applied Biosystems). Elucijo smo končali z linearnim gradientom 0-84% acetonitrila v 0,1% trifluoroocetne kisline pri 30 ° C v 45 min. Stopnja pretoka 0,2 ml smo uporabili min-1, je iztok spremlja absorbanco pri 214 nm. Peak frakcije zberemo ročno in takoj testirali za lizocim dejavnosti s tehniko lysoplate [20]. Tricin-SDS elektroforeza je bila izvedena v 13% ločevanja geli [21].
Preiskave antimikrobne
litična aktivnost proti M. luteus
je bila določena s trosenjem spremembe v suspenziji Micrococcus luteus
(0,25 mg /ml v acetatnem pufru) [8]. Jajčni beljak (VZ) lizocim (Sigma) smo uporabili kot kontrolo. Specifična aktivnost na ug želodčne ekstrakta je bila opredeljena kot enote aktivnosti 1 mg EWL o M. luteus
, pri pH 5,5. Zaviralni učinek na rast bakterij je bila določena na juho in agar lysoplates [20]. mikrodilucijski test občutljivosti [22] je bila uporabljena za določanje minimalne inhibitorne koncentracije. Učinek BGE ali BG lizocim na bakterijsko rast je bila določena v juho kulture, pri katerih je bila rast spremljati turbidimetrically (A600 nm).
Muramidase aktivnost BGE smo analizirali na očistili E. coli
murein [23] z cellosyl (Hoechst , Frankfurt; 50 ug /ml) in želodca ekstrakt (500 g /ml), določanje s HPLC proizvodnje topnih muropeptides nizko molekulsko maso [24]. Kontrolni brez murein bila vključena v izpustih in dal nobenih vrhove. Kadar je to potrebno, so bili proizvedeni muropeptides zbirajo posamezno na izhodu UV odkrivanje, vakuum suho, ponovno suspendirali v miliQ vode in razsolili kot je opisano zgoraj [23].
Membrane-permeabilyzing aktivnost želodca ekstraktov smo določili fluorimetricaly po osvoboditvi karboksifluorescein ( CF), od krtačo mejnih membranskih veziklov iz prašičje črevesne čopičem meje [25] in razpad difuzijsko potencialom-valinomycin povzroča v liposome [26].
Izjave
Avtorji "prvotna predložiti datoteke za slike
Spodaj povezave do izvirniku avtorjev prenosov datotek za slike. "Izvirno datoteko na sliki 1 12898_2003_35_MOESM2_ESM.pdf avtorjev 12898_2003_35_MOESM1_ESM.pdf avtorjev prvotni datoteki številka 2 12898_2003_35_MOESM3_ESM.ppt avtorjev prvotni datoteki številka 3 12898_2003_35_MOESM4_ESM.ppt avtorjev prvotni datoteki sliki 4

• Kakovost življenja pri bolnikih z rakom želodca: prevajanje in psihometričnih oceno iransko različico EORTC QLQ-STO22
• Vzpostavitev in karakterizacija model metastaz raka človeške želodčne pri nude mice