Ellenállás bendő baktériumok murein szarvasmarhák gyomor lysozyme

ellenállása bendő baktériumok murein szarvasmarhák gyomor lizozim katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa lizozim, enzimek leginkább kapcsolódó védelmi bakteriális fertőzések ellen, amelyek mureinolytic. A kérődzők fejlődtek a gyomor c típusú lizozim emésztőenzim, és a nyereség emésztését előbél baktériumok, miután a legtöbb étrendi összetevők, beleértve a fehérje, már erjedt a bendőben katalógusa. Ebben a munkában jellemezve biológiai aktivitását a szarvasmarha gyomor váladék ellen membránok, tisztított murein és a baktériumok.
Eredménye
Szarvasmarha gyomor-kivonat (BGE) adtunk aktív ellen egyaránt G + és G- baktériumok, de a hatás ellen Gram- baktériumok nem annak volt köszönhető, hogy a lizozim, mert tisztított BGL már csak a Gram + baktériumok. Nem tudtuk, hogy megtalálja a kis pórusképző peptidek BGE, és megállapította, hogy gátolja a Gram-negatív baktériumok által BGE volt köszönhető, hogy egy tárgy által okozott acetát. Mi jelentés első alkalommal a tevékenység a szarvasmarha gyomor lizozim (BG lizozim) ellen tiszta baktériumtenyészetek, és a fajlagos ellenállás néhány bendő Gram-pozitív törzsek BGL.
Következtetések
néhány Gram + bendő baktériumok kimutatta rezisztenciát oltógyomor lizozim. Megbeszéljük, mit jelent ez a megállapítás fényében lehetséges gyakorlati alkalmazásait, például a stabil antimikrobiális peptid. Katalógusa Háttér katalógusa lizozim a béta-N-acetil-muramil-hidroláz hogy megzavarják bakteriális murein [1]. A leggyakoribb állat lizozim van a C típus, mint például a csirke tojásfehérje lizozim (EWL, 14,3 kDa), az állati, a rovarok és növényi [2]. Gyomrú állatok rendelkeznek egyetlen gént lizozim C kifejezve különböző szövetekben [3], és úgy gondolják, hogy elsődlegesen részt védekezés a bakteriális fertőzések ellen.
Ezzel szemben, a kérődzők több lizozim géneket [4], és legalább négy kódot a gyomor lizozim, amely működik, mint egy emésztő enzim. A legtöbb étrendi komponensek erjesztett a bendőben, hogy illékony zsírsavak [5], és a kérődző előnyeit emésztésével előbél baktériumok forrásaként aminosavak. Cow gyomor lizozim enzim alapvető igazított jár a zord gyomorsav körülmények között, az optimális aktivitás alacsony pH (4,5-5,2), alacsony ionerősségű értékeket, és ellenáll a sav és pepszin [6, 7]. Korábban már beszámoltunk, hogy a felvétel a lizozim a gyomorsav emésztő enzimet konvergens történt a madárinfluenza előbél fermentor hoacin [8], továbbá több gén párhuzamos események során evolúció [9]. Aminosav közötti különbségek homológ fehérjék különböző fajokból származó lehetnek adaptív jelentőségű, mivel ez a helyzet a gyomor lizozimek. Lizozim a gyomor és a tehén Langur majmok (mindkettő erjesztéssel előbél) akiket pozitív darwini szelekció [10, 11].
Rumen baktériumok egyik fontos eleme a bendő biomassza [5], és ez valószínűleg tényező gyakoroljon evolúciós nyomás a gyomor lizozim és egyéb gyomor váladék növényevők a előbél erjedés. Ez arra ösztönzött bennünket, létrehozza 2 hipotézisek: 1 - lehetnek más oltógyomor peptidek antimikrobiális aktivitás mellett a lizozim, amely egyúttal a Gram negatív baktériumok; 2 - mivel bendőbaktériumokat vetették alá a szelekciós nyomás a gyomor antimikrobiális váladék, bendő baktériumok volna rezisztenssé ezeket a vegyületeket. A cél az volt, hogy jellemezzük az biológiai aktivitását szarvasmarha gyomor váladék ellen membránok, tisztított murein és a baktériumok.
Eredménye
Cow oltógyomor nyálkahártya kapunk 26,4 mg BGE per g szövet (1,32 g, liofilizált kivonat 100 ml ecetsav-kivonat, 50 g nedves nyálkahártya, SD 0,61, n = 20). Fehérje tartalom kivonatok 60% volt, ami megfelel 16 mg fehérje per gramm gyomor szövetet. Összesen 5 g gyomor kivonat volt kitéve kromatográfia, és 82,2 mg hatóanyagot (lítikus) fehérje kapunk. Ez azt jelenti, a hozam 1,64 tömeg /tömeg% lizozim a nyers extraktum, és 0,43 mg lizozim per gramm szövet.
SDS-PAGE a szarvasmarha gyomor kivonatot kiderült, egy nagy fehérje sávot körülbelül 15 kDa és két másik sávokban nagyobb fehérjék (30 és 45 kDa). Nem denaturáló elektroforézis mutatta a fehérje sáv litikus aktivitás M. luteus katalógusa -embedded overlay gél, feltehetően a gyomor lizozim. Lysis M. luteus
felfüggesztés által a gyomor extraktumot ábrán mutatjuk be. 1. Specifikus aktivitás (a M. luteus
) a kivonat a teljes gyomor nyálkahártya volt 3,40 U (SD 1,48, n = 20), pH = 5,5. Specifikus aktivitása gyomor extraktum csökkent 32%, pH = 6 (2,42 U) és 42%, pH = 6,5 (2,04 U). Kivonat specifikus aktivitása 5,5 pH magasabb volt a kivonat a gyomor fundus (4,39 U), mint hogy az antrum és a test (2,49 U és 2,34 U, sorrendben). 1. ábra Bacteriolytic aktivitását gyomor-kivonat ellen M. luteus katalógusa. Litikus aktivitását mutatjuk% kezdeti szóródása A M. luteus
szuszpenzió (0,25 mg /ml-acetát-pufferrel pH = 5,5) kezelt (nyíl jelzi) a gyomor- kivonatok egész oltógyomor nyálkahártya (E1, E2, E3, E4 és E, megfelelő kivonat koncentrációját 42, 133, 233, 417 és 554 ng /ml volt), és EWL (5 ng /ml).
BGE volt bacteriolytic ellen M. luteus
egy koncentráció-függő módon (1. ábra). BGE lebomlik Muramidáz E. coli katalógusa murein, termelő különböző profilt, hogy a gombás lizozim cellosyl (2. ábra). Muropeptides van egy alapvető szerkezet, amely az N-acetil-N-acetil-muramil-L-Ala-D-Glu-gamma-MDAP-R1R2, ahol R1 és R2 jelentése szubsztituenseket az L-karboxi és D-amino-csoportok. BGE (500 ng /ml) előállított különböző muropeptides által előállított cellosyl (50 ug /ml), beleértve a hiánya egy csúcs perc 27 (muropeptide R1 = D-Ala, és R2 = H), hogy által termelt kezelés a cellosyl. Ezt a csúcsot eluáljuk, és inkubáltuk egyaránt BGE és cellosyl. BGE tovább emésztettük ezt muropeptide (2C ábra), míg cellosyl nem (ábra 2d). Ez arra utal, kalap ellentétben cellosyl, BGE lizozim L, D karboxipeptidáz vagy N-acetil-L-muramil ala amidáz aktivitást. 2. ábra Muramidáz aktivitását gyomor-kivonat Echerichia coli katalógusa tisztított murein. Muropeptide profilját emésztés után a murein gyomor-kivonat (500 ng /ml, az a) vagy a gombás Muramidáz cellosyl (50 ug /ml, B). Cellosyl készített egy tetrapeptid 27 percig megfelelő M4 (amelynek R1 = D-Ala, és R2 = H). Ezt tovább emésztettük a gyomor-kivonat (500 ug /ml, c), de nem cellosyl (50 ug /ml, d).
BGE aktív volt P. aeruginosa elleni
és az E. coli katalógusa, permeabilizálás vezikulumokat és depolarizált liposzómák. Ezek a tevékenységek átvizsgáljuk izolált fehérjék és más kis peptidek így nincs aktív peptidek a BGE kivonat, beleértve a BGL, inaktív Gram negatív baktériumok (1. táblázat). Permeabilizáló aktivitás bizonyult miatt acetát a gyomor-kivonat, mivel BSA újraszuszpendáltuk ecetsavban, és liofilizáljuk hasonló volt aktivitás BGE. BGL nem gátolja a növekedést a néhány Gram pozitív bendő baktériumok, például L. acidophilus
és S. bovis katalógusa, amelyeket erősen gátolható EWL, jelezve fajlagos ellenállása a bendőben baktériumok murein a BGL (1. táblázat) .table 1 százalékos növekedése a kontroll tenyészetekben 6 órán át, a Gram + és Gram- baktériumok jelenlétében növesztjük az EW lizozim, BG lizozim és BGE.
ORIGIN Matton BAKTÉRIUM
Egg White Lysozyme150 ug /ml
Szarvasmarha Gyomor Lysozyme150 ug /ml katalógusa
katalógusa Szarvasmarha Gyomor Extract10 mg /ml
katalógusa katalógusa katalógusa pH 5,5 Matton pH 7,0 katalógusa
pH 5,5 Matton pH 7,0 Matton pH 5,5 Matton pH 7,0 Matton KÖRNYEZETVÉDELMI, INTESTINAL katalógusa Gram pozitív katalógusa M. luteus
lizált 1 katalógusa lizált 1 katalógusa lizált 1 katalógusa lizált 1 katalógusa lizált 1 katalógusa lizált 1 katalógusa Gram-negatív katalógusa P. aeruginosa

106
173
142 katalógusa 182 katalógusa 0 katalógusa 90 katalógusa E. coli Matton 103 katalógusa 91 katalógusa 86 katalógusa 124 katalógusa 15
44 katalógusa bendő
Gram pozitív katalógusa L. vitulinus Matton 1 katalógusa 4 katalógusa 81 katalógusa 69 katalógusa 10 katalógusa 8 katalógusa L. acidophilus Matton 0 katalógusa NG Matton 64 katalógusa NG Matton 168 katalógusa NG Matton S. bovis Matton 101
6
108 katalógusa 114 katalógusa 98 katalógusa 111 katalógusa Gram-negatív katalógusa S. ruminantium Matton 109 katalógusa 112 katalógusa 130 katalógusa 96 katalógusa 89 katalógusa 87 katalógusa P. ruminicola Matton NG Matton 24 katalógusa NG Matton 113 katalógusa NG Matton 208 Pg: 1 katalógusa = sejtek lízise a szórási vizsgálatban. Dőlt félkövér számok = növekedés gátolt. NG katalógusa = nincs növekedés a kultúra ebben a pH-t. Katalógusa Vita katalógusa Muramidáz aktivitás a savas gyomor egy előbél fermentor, kap egy jelentős biomassza baktériumok, lehetővé teszi az emésztést baktériumok sejtfalának és liberalizációjának aminosav gazdag cella tartalmát. A tevékenység a BG lizozim tisztított murein volt, ami különbözik a másik C lizozimek fűződik alacsonyabb optimális pH és az L, D karboxipeptidáz vagy N-acetil muramil-L-ala-amidáz aktivitást. Olyan volt, mint a többi lizozimek, aktív csak a Gram-pozitív baktériumokkal szemben. Más rendszerek, mint például Entamoeba histolytica katalógusa, tudják róluk, hogy a lizozim összehangoltan eljáró membrán permabilizáljuk peptidek [12], hanem megpróbálja megtisztítani aktív kis peptideket, BGE nem sikerült eddig. Katalógusa jelenléte a Gram-negatív baktériumok a bendő úgy tűnik, nem hajtott alakulását gyomor képes peptidek lebontják őket. Ez korlátozza a rendszer hatékonyságát, mivel csak Gram-pozitív baktériumok ellen van, hogy az emésztést, és Gram-negatív baktériumok jelentős részarányt képviselnek a bendő bakteriális biomassza. Továbbá, néhány bendő Gram-pozitív baktériumok úgy tűnik, hogy szemben rezisztenciát fejlesztettek ki az intézkedés a BG lizozim. Rumen baktérium a Streptococcus bovis
lehet rezisztenssé válnak a pórusképző peptid nizint, módosításával sejt lipoteikoát savak. Megszerzése nizin ellenállás is biztosított a lizozim ellenállás [13]. Keveset tudunk a baktériumok rezisztenssé lizozimek a fogadó kolonizálódnak, mint abban az esetben, bendő baktériumok és gyomor szarvasmarha lizozim. A jelenség utalhat szelektív nyomás a gyomor enzim bendő baktériumok, mivel BGL-rezisztens baktériumok nagyobb valószínűséggel megtelepedni az alsó bél és bendőjében fiatal állatok, mint BGL érzékeny törzsek.
A keresés az új antibakteriális kábítószer vezetett, hogy vizsgálja meg több spekulatív megközelítés, hogy elpusztítsa, vagy gátolja a kórokozó mikroorganizmusok és vírusok. Nagy a kísértés, optimistán azt jósolják, hogy rendkívül stabil peptidek, amelyek természetes módon alakult ki gyomor antimikrobiális lehet nagy a valószínűsége a klinikai alkalmazásig. Humán lizozim (kiválasztódik a monociták), közben egy védő szerepe a fertőzések ellen, csökkenti a szuperoxid generációs neutrophyls és javítja limfocita proliferációs választ [14-17]. EWL alkalmazásra került a bakteriális és virális fertőzések, alapuló immun-stimuláció és gyulladásgátló tulajdonságokkal [18].
Kérődző BG lizozimek, miután kialakult egy nagyon ellenséges környezet, mint például a gyomor, a szemben rezisztenciát fejlesztettek ki sav és proteolízis, és tarthat ígéretes felhasználások fertőzések kezelésére, és az élelmiszeriparban. Az állattenyésztési ágazat, a felhasználás az antibiotikumok és hormonok növekedésserkentő tette fel az egészségügyi veszélyek az emberre és az állatokra, és a takarmány-kiegészítés néhány növekedésserkentő már illegális. Az új növekedésserkentő, amelyek nem jelentenek problémát a rezisztencia prioritás, és antimikrobiális peptidek természetesen jó jelöltek. Valóban, a lizozim találták, hogy ugyanolyan hatékony, mint a hagyományos antibiotikumok, a növekedés elősegítésének baromfi [19]. Ugyanakkor a felfedezés a kapacitás, a baktériumok valószínűleg módosíthatja bakteriális murein és ellenállóvá válnak a litikus hatását lizozim, biztosan lesz aggodalomra gyakorlati alkalmazások, mint ahogy a baktériumok antibiotikumokkal szembeni rezisztencia.
Következtetések katalógusa Ez a munka azt mutatja, hogy a gyomorsav a szarvasmarha lizozim szemben aktív Gram-pozitív baktériumok, de néhány bendő törzsek nem befolyásolja az enzim által. Lehetséges gyakorlati alkalmazás ilyen antimikrobiális peptid alternatívájaként az antibiotikumokat is korlátozza a fejlesztési bakteriális rezisztencia a litikus hatását lizozimek.
Módszerek
Gyomor-kivonat és a lizozim tisztítás
Ecetsav kivonatot abomasal nyálkahártya volt előállítva Dobson et al. [7]. Szarvasmarha gyomor kivonatok (BGE) liofilizáltuk és fagyasztva kell tárolni. BGE fehérjéket elválasztottuk denaturáló és nem-denaturáló PAGE elektroforézissel. Sáv litikus aktivitását derült egy takaró agaróz gél beágyazott M. luteussal katalógusa. Tisztítása BG lizozim végeztük ismételt oldásával liofilizált BGE 10 vol. 10% -os ecetsav, centrifugálással 150.000 x g, 4 ° C-on 1 órán át. Az így kapott felülúszót, meghígítottuk 1: 2,5, 20% acetonitril /0,08% trifluor-ecetsav. Az anyagot át 0,5 ml tételekben felett Superdex Pep 10/30 oszlopon (Pharmacia LKB) oszlopot 20% acetonitril /0,08% trifluor-ecetsav 20 ° C hőmérsékleten, és az áramlási sebesség 0,1 ml /perc. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, vízzel 1: 2 arányban kiindulási pufferrel (50 mM nátrium-acetát, pH = 4,5), és felvittük egy Mono S 5/5 kationcserélő oszlopra (Pharmacia LKB) ekvilibrált kiindulási pufferrel. Adszorbeált fehérje eluáltuk az oszlopot ugyanazzal a pufferrel (5 ml), és felhasználásával egy 0-500 mM NaCl gradienssel (15 ml), és egy végső mosás 1 M NaCl-ban 10 ° C-on. Aktív anyagot hígítjuk 1:13 a kiindulási pufferrel (50 mM nátrium-acetát, pH = 7,8), és ismét alkalmazni egy Mono S HR 5/5 oszlopra (Pharmacia LKB) ekvilibrált kiindulási pufferrel. Az oszlopot mossuk, azonos pufferben (5 ml), és fejlesztettek ki egy 15 ml gradiens 0-500 mM NaCI, 10 ° C-on. Az aktív frakciókat egyesítjük, és -20 ° C-on. A fordított fázisú HPLC-t egy Aquapore Butyl 300 oszlopon (2,1 × 30 mm; Brownlee Labs) kapcsolódik egy 130 A szeparációs rendszer (Applied Biosystems). Az elúciót történik egy lineáris gradiens 0-84% acetonitril 0,1% trifluor-ecetsavat 30 ° C hőmérsékleten 45 perc alatt. Az áramlási sebességet 0,2 ml min-1-ben alkalmazzák, az elfolyó követtük nyomon abszorbancia 214 nm-en. A csúcs frakciókat összegyűjtjük, manuálisan és teszteltük azonnal lizozim aktivitás felhasználásával a lysoplate technika [20]. Tricin-SDS elektroforézist végeztünk 13% elválasztási gélek [21].
Antimikrobiális tesztek
litikus aktivitás ellen M. luteus
határoztuk szórási változások szuszpenzióját Micrococcus luteus katalógusa (0,25 mg /ml acetát-puffer) [8]. Tojásfehérje (EW) lizozim (Sigma) használtunk kontrollként. Specifikus aktivitása ug gyomor kivonat definiáltuk egységek tevékenységi 1 ng EWL a M. luteus katalógusa, pH 5,5-nél. Gátló hatás a bakteriális növekedésre határozták húsleves és az agar lysoplates [20]. Mikrohígításos érzékenységi teszt [22] alkalmazunk, hogy meghatározzuk a minimális gátló koncentrációját. Hatása BGE vagy BG lizozim a baktériumok növekedésére határoztuk táptalajtenyészeteket amelyben monitoroztuk a növekedést turbidimetriásan (A600 nm).
Muramidáz aktivitását BGE mértük a tisztított, E. coli
murein [23] cellosyl (Hoechst , Frankfurt am Main; 50 ug /ml) és a gyomor-kivonat (500 ng /ml), meghatározzuk HPLC-vel a termelés oldható kis molekulatömegű muropeptides [24]. A kontroll nélkül murein szerepelt a fut, és nem adott csúcsot. Amikor szükséges, előállított muropeptides gyűjtöttünk egyénileg a UV-detektálás aljzatba, vákuumban szárítjuk, újra szuszpendáljuk MilliQ vízben, és sómentesítjük a korábban leírt [23].
Membrán-permeabilyzing aktivitását gyomor kivonatok határoztuk fluorimetricaly, a felszabadulás karboxi ( CF) származó kefeszegélymembránjaiban vezikulák sertés bél kefeszegélymembránjaiban [25] és a disszipáció a valinomycin indukált diffúziós potenciál liposzómákba [26]. katalógusa nyilatkozatok katalógusa Szerzők eredeti beküldötteknek képeket
alábbiakban a linkeket a szerzők eredeti beküldötteknek képeket. 12898_2003_35_MOESM1_ESM.pdf A szerzők eredeti fájlt az 1. ábra szerinti 12898_2003_35_MOESM2_ESM.pdf A szerzők eredeti fájl 2. ábrán 12898_2003_35_MOESM3_ESM.ppt A szerzők eredeti fájl 3. ábra 12898_2003_35_MOESM4_ESM.ppt A szerzők eredeti fájl a 4. ábra

• Az életminőség javítása a betegek gyomorrák: fordítás és pszichometriai értékelése az iráni változata EORTC QLQ-STO22
• Létrehozása és jellemzése egy metasztázis modell a humán gyomorrák meztelen egerekben