Сопротивление рубца бактерий муреин к бычьей желудка lysozyme

сопротивление рубца бактерии муреин к бычьей желудка лизоцим
Аннотация
Справочная информация
лизоцимы, ферменты в основном связаны с защитой от бактериальных инфекций, являются mureinolytic. Овцеводство эволюционировали желудка с типа лизоцима как пищеварительный фермент, а также прибыль от переваривания бактерий кишки, после того как большинство пищевых компонентов, в том числе белка, были ферментированный в рубце
. В этой работе мы охарактеризовали биологическую активность крупного рогатого скота против желудочной секреции мембран, очищенного муреин и бактерий.
Результаты
бычьего желудка экстракта (BGE) был активен как против G + и G- бактерий, но эффект в отношении грамотрицательных бактерий не было связано с лизоцима, так как очищенный BGL была только активностью в отношении грамположительных бактерий. Нам не удалось найти образующие пептиды мелкопористой в BGE, и обнаружили, что ингибирование грамотрицательных бактерий BGE был обусловлен артефактом, вызванной уксусной кислоты. Мы сообщаем впервые активность бычьего желудка лизоцим (BG лизоцима) против чистых бактериальных культур, а удельное сопротивление некоторых рубца грамположительных штаммов к BGL.
Выводы
некоторых грамположительных бактерий рубца показали устойчивость к Сычуг лизоцим. Мы обсуждаем последствия этого факта в свете возможных практических применений такой устойчивой антимикробного пептида.
Предпосылки
лизоцимы являются бета-N-ацетил-мурамил-гидролазы, которые разрушают бактериальную муреин [1]. Наиболее распространенным животным лизоцим типа C, такие, как курица яичного лизоцима (ЕЛЖ, 14,3 кД), найденный в животных, насекомых и растений [2]. Животных с однокамерным желудком обладают один ген лизоцима C экспрессируются в различных тканях [3] и, как полагают, в первую очередь участвуют в защите против бактериальных инфекций.
В противоположность этому, жвачные животные имеют несколько генов лизоцим [4], а также по крайней мере, четыре кода для желудка лизоцим, который функционирует как пищеварительный фермент. Большинство пищевых компонентов ферментируется в рубце до летучих жирных кислот [5], а также жвачных преимущества переваривать бактерии передней кишки в качестве источника аминокислот. Корова лизоцим желудка является основным ферментом, адаптированный действовать в суровых условиях желудка, с оптимальной активностью при низком рН (4,5-5,2), низкие значения ионной силой и устойчивостью к кислоты и пепсина [6, 7]. Ранее мы уже сообщали о том, что набор лизоцима в качестве желудочного пищеварительного фермента конвергентно произошло в птичий передней кишки ферментера гоацин [8], а также с несколькими событиями дупликации генов в процессе ее эволюции [9]. Различия Аминокислотный между гомологичными белками из разных видов могут иметь адаптивное значение, как в случае с желудочным лизоцимы. Лизоцимы из желудков коров и Лангер обезьян (как с брожением в передней кишке) подвержены положительным дарвиновского отбора [10, 11].
Рубца бактерии представляют собой важный компонент рубца биомассы [5] и является вероятным фактором оказывая давление на эволюционную желудка лизоцима и других желудочных секреций в травоядных с передней кишки брожения. Это побудило нас создать 2 гипотезы: 1 - могут существовать и другие Сычуг пептиды с антимикробной активностью в дополнение к лизоцима, которые также действуют в отношении грамотрицательных бактерий; 2 - так как бактерии рубца были подвержены селективному давлению желудочного антимикробных выделениями, бактерии рубца, возможно, развилась устойчивость к этим соединениям. Целью данной работы было охарактеризовать биологическую активность крупного рогатого скота против желудочной секреции мембран, очищенного муреин и бактерий.
Результаты
Корова сычуг слизистая дали 26,4 мг BGE на грамм ткани (1,32 г, лиофилизированного экстракта на 100 мл уксусного экстракта из 50 г сырого слизистой оболочки, с.о. 0,61, N = 20). Содержание белка в экстрактах составляет 60%, что эквивалентно 16 мг белка на грамм желудочной ткани. В общей сложности 5 г экстракта желудочной подлежал хроматографии, и получали 82,2 мг активного (литическим) белка. Это представляет собой выход 1,64% вес /вес лизоцима из неочищенного экстракта и 0,43 мг лизоцима на грамм ткани.
Электрофореза в ДСН-ПААГ экстракта бычьего желудка выявили основную полосу белка около 15 кДа, и два других полосы больших белков (30 и 45 кДа). Non денатурации электрофорез показал полоса белка с литической активностью по М. Маслята
-вложено гель перекрытиями, предположительно желудка лизоцим. Лизис М. Маслята
суспензии экстракта желудка показана на рис. 1. Удельная активность (на М. Шеиз
) экстракта из всей слизистой оболочки желудка был 3,40 U (с.о. 1,48, N = 20) при рН 5,5. Удельная активность экстракта желудка снизилась на 32% при рН 6 (2,42 U) и 42% при рН 6,5 (2,04 U). Извлечение специфической активности при рН 5,5 была выше в экстракте желудка глазного дна (4,39 U), чем в том, что из антрального отдела и тела (2,49 U и 2,34 U, соответственно). Рисунок 1 Бактериолитические активность желудочного экстракта против М. Маслята
. Литическую активность показана в% от первоначального рассеяния М. Шеиз
суспензии (0,25 мг /мл в буферном растворе ацетата с рН 5,5), обработанную (показано стрелкой) с желудочным экстрактами всей сычуг слизистой оболочки (E1, E2, E3, E4 и Е, что соответствует концентрации экстракта 42, 133, 233, 417 и 554 мкг /мл, соответственно) и ЕЖЛ (5 мкг /мл).
BGE был бактериолитический против М. Шеиз
в зависимости от концентрации (Рисунок 1). BGE также деградирует Muramidase кишечной палочки
муреин, производя другой профиль, что грибного лизоцима cellosyl (рис 2). Muropeptides имеют базовую структуру, состоящую из N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-Ala-D-Glu-гамма-MDAP-R1R2, где R1 и R2 представл ют собой заместители на L-карбокси и D-аминогруппы. BGE (500 мкг /мл), полученного различными muropeptides, выводимым cellosyl (50 мкг /мл), в том числе отсутствие пика при 27 мин (muropeptide с R1 = D-Ala и R2 = -H), который был получен в результате обработки с cellosyl. Этот пик был элюировали и инкубировали с обоими BGE и cellosyl. BGE дополнительно переваривают эту muropeptide (рис 2в) в то время как cellosyl не (рис 2d). Это наводит на мысль шляпу в отличие от cellosyl, BGE лизоцим обладает L, D карбоксипептидазы или Nacetyl мурамиловых L-ала амидазы активность. Рисунок 2 Muramidase активность экстракта желудка на Echerichia палочка
очищенном муреин. Muropeptide профиль после переваривания муреин с экстрактом желудочной (500 мкг /мл, а) или с грибковым muramidase cellosyl (50 мкг /мл, б). Cellosyl произвел тетрапептид на 27 мин, соответствующей M4 (с R1 = D-Ala и R 2 = -H). Это было далее переваривается желудочной экстракта (500 мкг /мл, с), но не cellosyl (50 мкг /мл, d).
BGE был активен в отношении синегнойной
и кишечной палочки
, проницаемыми везикулы и деполяризованные липосом. Эти действия были показаны в изолированных белков и малых пептидов, не получают от активных пептидов из экстракта BGE, в том числе BGL, неактивны в отношении грамотрицательных бактерий (таблица 1). Permeabilizing активность оказалась из-ацетата в экстракте желудка, так как БСА ресуспендировали в уксусной кислоте и лиофилизируют была сходной активностью с BGE. BGL не подавляют рост некоторых грамположительных бактерий рубца, такие как Л. ацидофильных
и S. Бови
, которые были высоко тормозится ЕЛЖ, что указывает удельное сопротивление рубца бактерий муреин к BGL (таблица 1) .table 1 Процент роста контрольных культур в течение 6 часов, грам + и грамотрицательных бактерий, выращенных в присутствии лизоцима, EW BG лизоцима и BGE.
ПРОИСХОЖДЕНИЕ

бактерией

Яичный Lysozyme150 мкг /мл


бычий Желудочный Lysozyme150 мкг /мл
<бр>
бычий Желудочный Extract10 мг /мл


<й>
<й>
<й>
рН 5,5

рН 7,0

рН 5,5

рН 7,0

рН 5,5

рН 7,0

ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ, кишечная
грамположительных
М. Маслята

лизируют 1
лизису 1
лизису 1
лизису 1
лизису 1
лизису 1
грамотрицательных
P.aeruginosa,

106
173
142 182

0
90
кишечной палочки

103
91
86
124
15
44
рубце
грамположительных
Л. vitulinus

1 4
81
69
10
8
L. ацидофилин

0
NG

64
NG

168
NG

S. Бови

101
6
108
114
98
111
грамотрицательных
S. ruminantium

109
112
130
96
89
87
П. ruminicola

NG

24
NG

113
NG

208
1
= клетки лизируют путем обработки при рассеянии анализа. Полужирный курсив числа = рост тормозится. NG
= отсутствие роста культуры при этом значении рН.
Активности Обсуждение
Muramidase в кислотном желудке передней кишки ферментере, получая значительную биомассу бактерий, позволяет перевариванию стенок бактериальных клеток и либерализации аминокислоты -Rich содержимое ячейки. Активность BG лизоцима на очищенной муреин был отличается от других лизоцимы в гр, имеющих ниже оптимального рН и L, D карбоксипептидазы или Nacetyl мурамиловых L-ала амидазы активность. Это было, как и другие лизоцимы, активные только против грамположительных бактерий. Другие системы, такие как дизентерийная амёба
, как известно, содержат лизоцим, действующих совместно с мембранными permeabilizing пептидов [12], но попытки очистить активные небольшие пептиды из BGE потерпели неудачу, до сих пор.
Наличие грамотрицательных бактерий в рубца, кажется, не стимулируют развитие желудочных пептидов, способных ухудшить их. Это ограничит эффективность системы, так как только грамположительные бактерии поддаются перевариванию, и грамотрицательные бактерии представляют значительную часть рубца бактериальной биомассы. Кроме того, некоторые рубца грамположительные бактерии, по-видимому, развилась устойчивость к действию BG лизоцима.
рубца бактерии Streptococcus Bovis может развиться устойчивость к порообразующего пептидной низина, путем изменения клеточных липотейхоевый кислот. Приобретение низина сопротивления также присвоил сопротивление лизоцима [13]. Мало что известно о бактерии развивается устойчивость к лизоцимы от хозяина они колонизировать, как и в случае рубца бактерии и желудочном бычьего лизоцима. Явление может отражать селективное давление фермента желудка на рубца бактерии, так как BGL-устойчивые бактерии будут более склонны колонизировать нижней части кишечника и рубца молодняка, чем BGL-чувствительных штаммов.
Поиск новых антибактериальных наркотики привела к изучить более умозрительные подходы к уничтожению или ингибирующие патогенных микроорганизмов и вирусов. Заманчиво оптимистично прогнозируют, что высокостабильные пептиды, которые естественным образом эволюционировали в качестве желудочного антимикробных может иметь высокий потенциал для клинического применения. Человеческий лизоцим (секретируется моноцитов), в то время как играет защитную роль против инфекций, угнетает образование супероксида из neutrophyls и усиливает пролиферативный ответ лимфоцитов [14-17]. ЕЖЛ был применен против бактериальных и вирусных инфекций, основанный на его иммунной стимуляции и противовоспалительными свойствами [18].
Лизоцимы жвачных BG, эволюционировали в очень враждебной среде, таких как желудок, развилась устойчивость к кислоте и протеолиз и может проводить перспективные виды использования в лечении инфекций, а также в пищевой промышленности. В отрасли производства животных, применения антибиотиков и гормонов в качестве стимуляторов роста поставила угрозы для здоровья людей и животных, а также пищевых добавок корма с некоторыми стимуляторами роста теперь незаконно. Использование новых стимуляторов роста, которые не создают проблем устойчивости является одним из приоритетов, и антимикробные пептиды, конечно, хорошими кандидатами. В самом деле, лизоцим было установлено, быть столь же эффективным, как и обычные антибиотики, в содействии экономическому росту домашней птицы [19]. Тем не менее, открытие способности бактерий предположительно модифицировать его бактериальной муреин и становятся устойчивыми к действию литического лизоцимы, безусловно, вызывает озабоченность в практическом применении, так как имеет резистентность бактерий к антибиотикам.
Выводы
Эта работа показывает что желудочный бычий лизоцим активен в отношении грамположительных бактерий, но, что некоторые штаммы рубца не подвержены воздействию фермента. Возможности практического применения данного антимикробного пептида в качестве альтернативы антибиотикам, может быть ограничено развитием бактериальной устойчивости к действию литического лизоцимы.
Методы
Желудочный экстракт и очистки лизоцима
уксусной кислоты экстракта из abomasal слизистой оболочки полученного, как описано Добсоном и соавт. [7]. Бычьи желудка экстракты (BGE) лиофилизировали и хранили в замороженном виде. BGE белки разделяли в денатурирующем и неденатурирующем ПААГ-электрофореза. Группа литическую активность была выявлена ​​на покрывающей агарозном геле с вложенной М. Маслята
. Очистка BG лизоцима проводили повторно растворения лиофилизированного BGE в 10 об. из 10% -ной уксусной кислоты, центрифугирование при 150000 х г при температуре 4 ° С в течение 1 ч. Полученный супернатант, разбавили 1: 2,5 с 20% ацетонитрил /0,08% трифторуксусной кислоты. Это вещество пропускали через 0,5 мл порциями над Супердекс Pep 10/30 (Pharmacia LKB), уравновешенной с помощью 20% ацетонитрила /0,08% трифторуксусной кислоты при 20 ° С и скорости потока 0,1 мл /мин. Активные фракции объединяли, разводили в соотношении 1: 2 с стартовым буфером (50 мМ натрий-ацетата, рН 4,5) и наносили на Mono S 5/5 катионообменной колонке (Pharmacia LKB), уравновешенной стартовым буфером. Адсорбированный белок элюируют путем промывания колонки тем же самым буфером (5 мл) и при использовании 0-500 мМ NaCl градиентом (15 мл) и конечной промывки 1 М NaCl при 10 ° С. Активный материал разводили 1:13 с стартовым буфером (50 мМ натрий-ацетата, рН 7,8) и вновь вводили в Mono S HR 5/5 колонки (Pharmacia LKB), уравновешенной стартовым буфером. Колонку промывают тем же буфером (5 мл) и разработан с 15-мл с градиентом 0-500 мМ NaCl при 10 ° С. Активные фракции объединяли и хранили при -20 ° С. Обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на колонке 300 Аквапор бутил (2,1 × 30 мм, Браунли Labs), связанной с 130 разделительную систему (Applied Biosystems). Элюирование было сделано с линейным градиентом 0-84% ацетонитрила в 0,1% -ной трифторуксусной кислоты при 30 ° С в течение 45 мин. Скорость потока 0,2 мл мин-1 был применен, поток контролировали по поглощению при длине волны 214 нм. Пиковые фракции собирали вручную и проверены непосредственно на активность лизоцима с использованием техники lysoplate [20]. Трицин-SDS-электрофорез проводили в 13% гелей разделения [21].
Антимикробные тесты
активности литических против М. Шеиз
определялась рассеянием изменения в суспензии Micrococcus Шеиз
(0,25 мг /мл в ацетатном буфере) [8]. Яичный белок (ЭВ), лизоцима (Sigma) использовали в качестве контроля. Удельная активность в мкг экстракта желудочной определялась как единицы активности 1 нг ЕЖЛ на М. Шеиз
, при рН 5,5. Ингибирующее действие на рост бактерий определяли на бульоне и агар lysoplates [20]. Микроразведений восприимчивость тест [22] использовали для определения Минимальные ингибирующие концентрации. Влияние BGE или BG лизоцима на рост бактерий определяли в бульонных культурах, в которых рост контролировали turbidimetrically (A600 нм).
Muramidase активность BGE анализировали на очищенной кишечной палочки
муреин [23] с cellosyl (Hoechst , Франкфурт-на-Майне, 50 мкг /мл) и желудочный экстракт (500 мкг /мл), определяют с помощью ВЭЖХ производства растворимых muropeptides с низкой молекулярной массой [24]. Контрольную без муреин был включен в прогонов и не дали никаких пиков. При необходимости, полученные muropeptides были собраны по отдельности на выходе из УФ-детекция, сушат в вакууме, ресуспендировали в MilliQ воде и обессоливали, как описано ранее [23].
Мембранно-permeabilyzing активность желудочного экстрактов определяли fluorimetricaly, освобождением карбоксифлуоресцеина ( CF) от щеточной каймы мембранных везикул из свиной щетки кишечной границы [25] и диссипации валиномицина-индуцированного диффузионного потенциала в липосом [26].
Объявления
Авторы 'оригинальные представлены файлы для изображений Ниже приведены изображения ссылки на оригинал авторов представлены файлы для изображений. 'Исходный файл для фигурного 1 12898_2003_35_MOESM2_ESM.pdf Авторского 12898_2003_35_MOESM1_ESM.pdf авторов исходного файла для фигурного 2' исходного файла для фигурного 3 12898_2003_35_MOESM4_ESM.ppt Авторского 12898_2003_35_MOESM3_ESM.ppt Авторского исходного файла для фигуры 4

• Качество жизни у пациентов с раком желудка: перевод и психометрических оценки иранской версии EORTC QLQ-STO22
• Создание и характеристика метастаз модели рака желудка человека у голых мышей