Studie jämför DNA -extraktion och amplifieringsmetoder som används för mikrobiomforskning

Låt möta det, vi är ett resultatdrivet samhälle. För fokuserad på resultatet, människor tänker inte ofta på "hur". Till exempel, tänkte du på "hur" du kom till jobbet i morse eller kom du precis dit? I mikrobiomstudier är resultaten graferna och data men "hur, "som att pendla, är ofta bara en del av en rutin.

Dock, en grundläggande aspekt av analys av mikrobiomer (oavsett värd) bygger på DNA -extraktion och amplifieringsmetoder. Dussintals DNA -extraktionsmetoder som för närvarande finns på marknaden kan var och en extrahera DNA och producera välrenommerade resultat, men var och en har lite olika "hur". Labs har ofta sitt "go-to" -paket valt av laboratorieledaren och överförs från generation till generation av forskarstuderande. Och när du väl har valt en metod är det bäst att hålla sig till den metoden helt enkelt för att alla vet att ett annat kit kommer att ge lite olika resultat. Men vilken metod är bäst? Hur väljer du? Hur mycket påverkar "hur" verkligen resultaten? Och när ska man byta?

Experimentell design och provsamling diskuteras vanligtvis i stor längd i början av ett projekt, men DNA -extraktionsmetoder förbises ofta. Denna hotande partiskhet att ignorera vikten av DNA -extraktionsmetoden blev fokusfrågan för forskaren Cecelia Giangacomo och hennes rådgivare Jason G. Wallace i deras senaste Phytobiomes Journal offentliggörande, "Jämförelse av DNA-extraktion och 16S rRNA-genförstärkningsmetoder för växtassocierade bakteriesamhällen." Wallace säger, "Denna forskning låter oss veta de bästa/mest effektiva metoderna framöver. Vårt laboratorium gör mycket växtmikrobiomarbete, så vi vill se till att vi använder dessa resurser väl. Jag blev faktiskt förvånad över att ingen hade gjort det här förut, så vi hoppas att andra laboratorier tycker att det är användbart. "

DNA -extraktionssatser är utformade för att vara brett spektrum för att fungera för både mikrober och deras värd. I de flesta växtmikrobiomprojekt kommer det att finnas en liten mängd mikrobiellt DNA jämfört med värden. Således, den största utmaningen vid mikrobiomsekvensering är att optimera extraktionen av det mikrobiella DNA:n i översvämningen av värd -DNA i ett prov.

När DNA har extraherats, forskare kommer ofta att förstärka en enda bit av DNA från alla organismer i provet. Denna bit av DNA bevaras mellan olika arter av intresse men är tillräckligt olika mellan arterna för att karakterisera mångfalden i provet. Ett av de vanligaste målen för undersökning av bakterier; 16S ribosomal RNA-genen; finns också i växtkloroplaster. Så även om denna amplifieringsmetod fungerar bra för att separera värd från mikrobe i mänskliga och miljöprover, producerar den fortfarande värdkontaminering (genom amplifiering av kloroplast) i växtprover.

Wallace och hans team jämförde fyra vanliga kommersiellt tillgängliga DNA -extraktionsmetoder:DNeasy Plant (Qiagen), Snabbt DNA (Zymo), Extract-N-Amp (Sigma-Aldrich), och Power Soil Kit (Qiagen). De tittade också på fyra olika amplifieringsmetoder som är inriktade på specifika regioner av 16S ribosomal RNA -genen för att avgöra vilken metod som gjorde det bästa jobbet med att utesluta värd -DNA samtidigt som det mikrobiella DNAet bevarades.

Ett sätt forskare kan välja mot värd -DNA är genom att modifiera amplifieringsprocessen. Wallace och hans kollegor tittade på att lägga till molekylära klämmor som skulle klämma fast kloroplast och mitokondriellt DNA, blockerar i huvudsak amplifiering av oönskat DNA. De försökte också förstärka en annan region av 16S -genen som skulle diskriminera kloroplast och mitokondrier som leder till mer amplifierat DNA i mikrobiomet. Deras sista metod för att optimera amplifieringsprocessen använde sekvenser som "förgiftar" oönskat DNA så att det inte kan amplifieras ytterligare.

Denna process är analog med att ta flera rutter på din pendling. Var och en kan ha vissa överlappande landskap men också unika attribut; en kan vara mer naturskön, en snabbare, en annan mer stressig. I Wallaces forskning kunde de använda de olika extraktions- och amplifieringsvägarna för att jämföra hur 'hur' metoderna påverkar de övergripande resultaten. Medan de flesta forskare vet att det finns fördomar i deras metoder, detta var en direkt jämförelse sida vid sida som visar hur varje metod gav olika resultat och förändrade provets totala sammansättning.

Denna studie ska hjälpa människor att göra de bästa valen när det gäller hur de ska spendera sin tid och sina pengar för mikrobiomforskning. "

Jason G. Wallace

Wallace betonade att det inte finns någon "perfekt metod", och även inom deras studie fungerade vissa metoder bättre för vissa provtyper men inte för andra. Denna data ger forskare kunskap för att fatta bättre informerade beslut om deras metoder. Även den bästa metoden här kanske inte är den bästa metoden för specifika projekt, prover, typer, eller budgetar. Företag försöker ständigt optimera sina produkter, så när vi går vidare kommer denna utmaning förhoppningsvis att bli lättare för forskare.

Viktigast, denna forskning driver hem att det finns skillnader mellan metoder som kan påverka resultaten. Det finns ingen "perfekt metod". Det är upp till forskarna att förstå nyanserna i sina prover och välja den bästa metoden för den vetenskapliga frågan de hoppas ta itu med. Så även om alla vägar kan leda till ett resultat, experimentera med "hur" kan vara värt ansträngningen för att hitta den bästa vägen för mikrobiomforskning. "Detta är inte ett paradigmskifte, men det är en av de små, stegvisa förändringar som hjälper oss att forska lite bättre, och med tiden blir de ganska stora förbättringar, "förklarar Wallace.

• Familjers socioekonomiska status kan påverka barns sammansättning av tarmmikrobiom
• Känslomässigt stöd och motståndskraft kan hjälpa till att mildra de psykologiska effekterna av pandemin