Studija uspoređuje metode ekstrakcije i amplifikacije DNA koje se koriste za istraživanje mikrobioma

Suočimo se, mi smo društvo vođeno rezultatima. Previše fokusiran na ishod, ljudi ne razmišljaju često o tome kako. Na primjer, jeste li razmišljali o tome kako ste jutros došli na posao ili ste tek stigli? U studijama mikrobioma rezultati su grafikoni i podaci, ali "kako, "poput putovanja na posao, često je samo dio rutine.

Međutim, Temeljni aspekt analize mikrobioma (bez obzira na domaćina) oslanja se na metode ekstrakcije i amplifikacije DNA. Desetine metoda ekstrakcije DNA koje su trenutno na tržištu sposobne su za ekstrakciju DNA i za postizanje uglednih rezultata, ali svaki ima malo drugačiji "kako". Laboratorije često svoj "go-to" pribor odabire voditelj laboratorija i prenosi ih s generacije na generaciju studenata. A kad odaberete metodu, najbolje je da se pridržavate te metode jednostavno zato što svatko zna da će drugačiji komplet dati malo drugačije rezultate. Ali koja je metoda najbolja? Kako birate? Koliko "kako" doista utječe na rezultate? I kada se trebate prebaciti?

O eksperimentalnom dizajnu i prikupljanju uzoraka obično se dugo raspravlja na početku bilo kojeg projekta, ipak se metode ekstrakcije DNA često zanemaruju. Ova prijeteća pristranost zanemarivanja važnosti metode ekstrakcije DNK postala je središnje pitanje istraživačice Cecelije Giangacomo i njezina savjetnika Jasona G. Wallacea u njihovom najnovijem izdanju Phytobiomes Journal objavljivanje, "Usporedba metoda ekstrakcije DNA i metoda 16S rRNA gena za bakterijske zajednice povezane s biljkama." Wallace navodi, "Ovo istraživanje nam omogućuje da saznamo najbolje/najučinkovitije metode u budućnosti. Naš laboratorij obavlja mnogo biljnih mikrobioma, pa želimo biti sigurni da te resurse dobro koristimo. Zapravo sam bio iznenađen što to nitko prije nije učinio, pa se nadamo da će drugim laboratorijima biti od koristi. "

Kompleti za ekstrakciju DNA dizajnirani su tako da budu širokog spektra za rad i za mikrobe i za njihovog domaćina. U većini projekata biljnih mikrobioma bit će mala količina mikrobne DNA u usporedbi s domaćinom. Tako, najveći izazov u sekvenciranju mikrobioma je optimizacija ekstrakcije mikrobne DNA u poplavi DNK domaćina unutar uzorka.

Kada se DNK ekstrahira, istraživači će često pojačati jedan komad DNK iz svih organizama u uzorku. Ovaj dio DNK sačuvan je kod različitih vrsta interesa, ali je dovoljno različit među vrstama kako bi se okarakterizirala raznolikost unutar uzorka. Jedan od najčešćih ciljeva za ispitivanje bakterija; 16S ribosomalni RNA gen-; također je prisutan u biljnim kloroplastima. Dakle, iako ova metoda pojačanja dobro funkcionira pri odvajanju domaćina od mikroba u uzorcima ljudi i okoliša, ipak uzrokuje kontaminaciju domaćina (pojačavanjem kloroplasta) u biljnim uzorcima.

Wallace i njegov tim usporedili su četiri uobičajene komercijalno dostupne metode ekstrakcije DNK:DNeasy Plant (Qiagen), Brza DNK (Zymo), Ekstrakt-N-pojačalo (Sigma-Aldrich), i Power Soil Kit (Qiagen). Također su pogledali četiri različite metode amplifikacije koje ciljaju na specifična područja gena 16S ribosomske RNA kako bi se utvrdilo koja je metoda učinila najbolji posao u isključivanju DNA domaćina uz očuvanje mikrobne DNA.

Jedan od načina na koji istraživači mogu izabrati DNK domaćina je modificiranje procesa amplifikacije. Wallace i njegovi kolege razmatrali su dodavanje molekularnih stezaljki koje bi stegle kloroplast i mitohondrijsku DNA, bitno blokira pojačavanje neželjene DNA. Također su pokušali pojačati različitu regiju gena 16S koja bi razlikovala kloroplast i mitohondrije što bi dovelo do pojačane DNK mikrobioma. Njihova posljednja metoda optimizacije procesa amplifikacije koristila je sekvence koje "truju" neželjenu DNA pa se ne može dodatno pojačati.

Ovaj proces je analogan kretanju više ruta na vašem putovanju. Svaki može imati neke preklapajuće krajolike, ali i jedinstvene atribute; netko može biti ljepši, jedan brži, još jedan stresniji. U Wallaceovom istraživanju mogli su koristiti različite načine ekstrakcije i amplifikacije kako bi usporedili kako 'kako' metoda utječe na ukupne rezultate. Iako većina istraživača zna da postoje pristranost u njihovim metodama, ovo je izravna usporedna usporedba koja pokazuje kako je svaka metoda dala različite rezultate i promijenila ukupni sastav uzorka.

Ova studija trebala bi pomoći ljudima da naprave najbolji izbor u smislu načina na koji će potrošiti svoje vrijeme i novac na istraživanje mikrobioma. "

Jason G. Wallace

Wallace je naglasio da ne postoji "savršena metoda", pa čak i unutar njihovog istraživanja neke su metode bolje funkcionirale za neke tipove uzoraka, ali ne i za druge. Ovi podaci pružaju istraživačima znanje za donošenje bolje informiranih odluka o svojim metodama. Čak ni najbolja metoda ovdje možda nije najbolja metoda za određene projekte, uzorci, vrste, ili proračune. Tvrtke stalno pokušavaju optimizirati svoje proizvode, pa ćemo s napretkom ovaj izazov, nadamo se, postati lakši za istraživače.

Najvažnije, ovo istraživanje ukazuje na to da postoje razlike među metodama koje mogu utjecati na rezultate. Ne postoji "savršena metoda". Na istraživačima je da razumiju nijanse svojih uzoraka i odaberu najbolju metodu za znanstveno pitanje koje se nadaju riješiti. Dakle, iako svi putevi mogu dovesti do rezultata, eksperimentiranje s 'kako' može biti vrijedno truda pronaći najbolji put za istraživanje mikrobioma. "Ovo nije promjena paradigme, ali to je jedno od malih, inkrementalne promjene koje nam pomažu da malo bolje istražimo, i s vremenom se to dodaje prilično velikim poboljšanjima, “, objašnjava Wallace.

• Obiteljski društveno-ekonomski status može utjecati na sastav crijevnog mikrobioma kod djece
• Emocionalna podrška i otpornost mogu pomoći u ublažavanju psiholoških učinaka pandemije